Questo protocollo descrive come applicare una metodologia pre-mirata alla radioterapia mirata delle xenografie tumorali nel modello del topo. La radioimmunoterapia pre-mirata o PRIT ci consente di iniettare l'anticorpo e il radioligand separatamente e lasciare che i due si combinino in vivo usando la chimica dei clic. Mentre presentiamo PRIT utilizzando un modello di xenografo di cancro del colon-retto, questa tecnica può essere applicata a qualsiasi anticorpo di targeting antigene superficiale.
È importante selezionare un antigene che non si interiorizzi rapidamente o persi ampiamente in quanto questi possono ridurre l'efficacia dell'approccio. Per sintetizzare huA33-TCO preparare prima una soluzione di 125 microlitri di 40 milligrammi per millilitro TCO-NHS in metilformamide secca in un tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri. Questa soluzione può essere aliquota e congelata a 80 gradi celsius per l'uso in esperimenti futuri.
In un tubo di microcentrifugo separato da 1,7 millilitri preparare una soluzione di cinque milligrammi per millilitro di huA33 in un millilitro di soluzione salina tamponata con fosfato. Utilizzando piccole aliquote di carbonato di sodio molare 0,1, regolare il pH della soluzione anticorpale tra 8,8 e 9,0. Utilizzare carta pH o un pH meter con un microelettrodo per monitorare il pH e fare attenzione che il pH non superi 9,0.
Aggiungere un volume corrispondente all'equivalenza molare 40 di TCO-NHS alla soluzione anticorpale. Per prevenire la precipitazione del TCO-NHS idrofobico, aggiungerlo lentamente e con agitazione. Lasciare incubare la reazione a 25 gradi Celsius su un miscelatore termico per un'ora con lieve agitazione.
Prima di purificare l'immunoconigiudato huA33-TCO utilizzando una colonna di desalinizzazione di esclusione delle dimensioni usa e getta precondiché imballata, equilibrare la colonna di esclusione delle dimensioni descritta dal fornitore per rimuovere eventuali conservanti presenti nella colonna durante la conservazione che di solito comporta il lavaggio della colonna cinque volte con un volume di PBS corrispondente al volume della colonna. Aggiungere la miscela di reazione alla colonna di esclusione delle dimensioni, annotando il volume della miscela di reazione. Dopo che la miscela di reazione è entrata nella colonna aggiungere una quantità appropriata di PBS per portare il volume totale di soluzione aggiunta alla colonna fino a 2,5 millilitri.
Raccogliere il prodotto utilizzando due millilitri di PBS come eluente. Misurare la concentrazione dell'huA33-TCO utilizzando uno spettrofotometro UV vis che monitora la lunghezza d'onda a 280 nanometri. Se si desidera una soluzione con una maggiore concentrazione di immunoconijugate, concentrare la soluzione huA33-TCO utilizzando un'unità filtrante centrifuga con un taglio di peso molecolare di 50.000 persone seguendo le istruzioni del produttore.
Conservare l'immunocongiudato huA33-TCO completato a 4 gradi celsius al buio. Se deve essere usato più di quattro giorni in futuro, conservarlo a 80 gradi celsius al buio. In un tubo di centrifuga da 1,7 millilitri aggiungere 200 microlitri di tampone di acetato di ammonio molare regolato in pH 5,5.
Aggiungere la quantità desiderata di cloruro di Lutezio-177 alla soluzione tampone. La quantità aggiunta dipenderà dal numero di soggetti dell'esperimento e dalle dosi radioattive somministrate. Aggiungere tetrazina PEG7-DOTA in DMSO alla miscela radioattiva.
L'importo aggiunto dipende dal numero di soggetti sottoposti a test. Lasciare incubare la soluzione a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Verificare che l'etichettatura radio sia completa utilizzando la cromatografia a strato sottile e radio istantaneo con 50 millimolare EDTA pH 5.5 come fase mobile.
L'etichetta Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazine rimarrà al basale mentre il Lutezio-177 gratuito sarà coordinato dall'EDTA e viaggerà con il fronte solvente. È fondamentale che il posizionamento dei tumori sottocutanei non interferisca con la tecnica di ritenuta. Consiglio di posizionarli sul lato del fianco che è opposto alla tua mano restrittiva.
Da quando mi trattengo con la mano sinistra ho scelto di posizionare i tumori sul fianco destro. Ordina topi nudi atimici femminili con xenografo del cancro del colon-retto, in modo che il volume medio del tumore in ogni coorte sia approssimativamente uguale. Per fare ciò, elenca i numeri di identificazione degli animali, il modello di tacca dell'orecchio e il volume tumorale in tre colonne separate di un programma di fogli di calcolo.
Ordinare i dati dal più piccolo al più grande volume tumorale. In una quarta colonna assegnare a ciascun animale un numero di gabbia. Pedala attraverso le gabbie in un modello simile a un serpente fino a quando a tutti gli animali viene assegnata una gabbia.
Una volta assegnate le gabbie, ordinare i dati in base al numero della gabbia. Per iniettare l'immunoconiuvante precomporre dosi di 150 microlitri di soluzione huA33-TCO in siringhe pretrattate con albumina siemica bovina all'1% in PBS e conservare queste siringhe sul ghiaccio. Per iniettare il radioligand, preleva prima dosi in 150 microlitri di soluzione salina sterile allo 0,9% contenente 1,1 equivalenza molare della Tetrazina-PEG7-DOTA radiomarcata rispetto alla quantità di huA33-TCO somministrata.
Utilizzare le pinze per misurare il lato più lungo del tumore oblungo e la larghezza che è perpendicolare alla lunghezza. Pesare ogni mouse su una bilancia per tenere traccia dell'aumento di peso o della perdita di peso nel tempo. Infine, calcola il volume usando la formula per il volume di un ellissoide supponendo che l'altezza sia approssimativamente uguale alla larghezza.
Qui è mostrata la biodistribuzione di un pretargeting in vivo con huA33-TCO e Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazine in topi nudi atimici con tumori del caner colorettale umano SOTTOcutanei SW1222. Tutti gli intervalli di iniezione producono alte concentrazioni di attività nel tessuto tumorale e basse concentrazioni di attività negli organi sani. L'intervallo di iniezione di 24 ore offre il più alto assorbimento tumorale a 120 ore dopo l'iniezione.
Sulla base di questi risultati è stato scelto un intervallo di 24 ore per il successivo studio di terapia longitudinale. Qui è mostrato lo studio di terapia longitudinale di cinque gruppi di topi con tumori SW1222 sottocutanei raffigurati nel volume medio del tumore in funzione del tempo e volume tumorale normalizzato al volume iniziale in funzione del tempo. C'è una netta differenza nella risposta delle coorti sperimentali rispetto ai gruppi di controllo.
Mentre i tumori nei topi che ricevevano solo un componente della strategia di radioimmunoterapia pre-mirata continuavano a crescere incontrollati, i tumori dei topi che ricevevano il regime completo di radioimmunoterapia pre-mirata hanno smesso di crescere e alla fine si sono arrestati. È importante sottolineare che non sono stati osservati effetti collaterali tossici e tutti gli animali hanno mantenuto un peso entro il 20% della loro massa iniziale. Sorprendentemente, i topi delle coorti sperimentali avevano un perfetto record di sopravvivenza alla fine dell'indagine.
Quando si tenta questa procedura è della massima importanza misurare in modo accurato e riproducibile i tumori. Quando si lavora con la radioattività, consultare il responsabile della sicurezza delle radiazioni dell'istituto per sviluppare protocolli e strutture sicuri. Disporre di adeguati controlli di sicurezza limiterà l'esposizione ed eviterà la contaminazione.
Il pretargeting offre una dose di radiazioni inferiore agli organi di fondo rispetto alla radioimmunoterapia tradizionale. Condividendo questo protocollo speriamo che altri possano essere in grado di testare i propri modelli e idee che porteranno a nuovi ed entusiasmanti progressi per il trattamento del paziente.
