This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director&#8217;s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).

NOTA: le informazioni del fornitore per tutti i reagenti utilizzati in questo protocollo è quotata nella tabella 1 e Elenco dei materiali. Tutte le soluzioni e le attrezzature che entrano in contatto con le cellule devono essere sterili, e la tecnica asettica devono essere utilizzati di conseguenza. Eseguire tutte le incubazioni cultura in un umidificata 37 ° C, 5% CO 2 incubatore se non diversamente specificato. In questo protocollo, tutti differenziazioni sono eseguite in 6 pozzetti, in cui i hiPSCs sono teste di serie. A seguito di differenziazione e di purificazione, le cellule possono essere dissociati e ripiastrate per uso a valle. 1. Media Preparazione <ol><li> Per il mezzo E8, ottenere una soluzione stock per ogni componente medio (NaHCO3, acido L-ascorbico 2-fosfato, sodio selenite, transferrina, insulina, FGF2, TGFB1) e memorizzare le soluzioni a -20 ° C. Aggiungere la quantità appropriata di soluzioni madre alla bottiglia di DMEM / F12 e filtrare per sterilizzare. La Conc soluzionezione e la configurazione di reazione per i componenti di magazzino e E8 medio si trovano nella tabella 1. </li><li> Per la soluzione di matrice extracellulare, scongelare la matrice membrana basale (comunemente in dotazione a 10 mg / ml) a 4 ° CO / N. Matrigel è comunemente utilizzato per la coltura di cellule staminali pluripotenti in quanto le cellule staminali umane pluripotenti possono aderire bene a questo materiale con l&#39;alfa-6-beta-1 integrina 9. Una volta scongelato, fanno 2,25 mg (250 ml) di aliquote sul ghiaccio con ghiaccio puntali freddo e tubi e memorizzare le aliquote a -80 ° C. <ol><li> Quando precoating piatti con ECMS, scongelare e aliquote della soluzione di matrice extracellulare (ECMS) su ghiaccio. Mescolare il ECMS e medio DMEM / F12 ghiacciata in un rapporto di 1: 200 in ghiaccio. Conservare in luogo fresco per evitare premature ECMS solidificazione. </li></ol></li><li> Per la RPMI / B27 senza prodotto insulina, aggiungere 10 ml di B27 Minus insulina in 500 ml di media RPMI. </li><li> Per la RPMI / B27 (con insulina) medio, aggiungere 10 ml di B27 Supplement (con insulin) e 5 ml di antibiotico Pen-strep in 500 ml di mezzi RPMI. </li><li> Per il medio di glucosio basso, aggiungere 10 ml di B27 supplemento e 5 ml di antibiotico Pen-strep in 500 ml di media RPMI senza glucosio. </li><li> Per il medio / crioconservazione congelamento, miscela di siero fetale bovino con dimetilsolfossido (DMSO) in un rapporto di 9: 1. Il mezzo di congelamento può essere conservato fino a 1 mese a 4 ° C. NOTA: Tutti i supporti devono essere filtrati e conservati a 4 ° C ed utilizzati entro 2 settimane se non diversamente specificato. Tutti i volumi di reagente / soluzione utilizzata di seguito sono destinati ad un singolo bene in un 6-pozzetti, se non diversamente specificato. </li></ol> 2. Pre-rivestimento 6 pozzetti con ECMS <ol><li> Effettuare ECMS mescolando matrice della membrana basale (ad esempio, Matrigel) con ghiaccio freddo DMEM / F12 media in un rapporto di 1: 200, quindi applicare 2 ml di fresco ECMS a ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Ogni bene in un 6-pozzetti riceveranno circa 90 mg ECMS. </li><li> Incubare la ECMS rivestito piastre per 1 ora a 37 ° C. Immediatamente prima placcatura cellule, aspirare DMEM soluzione / F12 da ciascun pozzetto. Le piastre saranno quindi pronto a ricevere cellule. </li></ol> 3. scongelamento le hiPSCs congelati NOTA: Strettamente seguire questa procedura in quanto può portare a coltura ottimale e differenziazione a valle di hiPSCs in hiPSC-CM seguendo il ciclo di congelamento / scongelamento. <ol><li> Scongelare una fiala di hiPSCs per ogni pozzetto di un 6-pozzetti. Preparare un tubo da 15 ml con 9 ml di freddo media E8 con inibitore di ROCK (10 micron) per ogni flacone. Inibitore ROCK migliora hiPSCs sopravvivenza dopo crioconservazione 10. Tenere i flaconcini di 37 ° C a bagnomaria scongelare le cellule fino a un cristallo di ghiaccio del diametro di circa 5 mm è lasciato. </li><li> Spruzzare l&#39;esterno dei flaconcini con il 70% di etanolo. Pulire le fiale con la carta velina prima di passare alla cappa laminare sterile. </li><li> Trasferire le cellule nel tubo conico preparato. Risciacquare tegli fiala una volta con 500 ml di E8 medio e trasferire il mezzo contenente le cellule scongelate allo stesso tubo conico. Centrifugare a RT per 4 min a 200 x g. </li><li> Aspirare il surnatante dopo centrifugazione e risospendere delicatamente il pellet cellulare con 2 ml di E8 media con inibitore ROCK (10 micron). Trasferire le cellule risospese ad un pozzetto di un 6-pozzetti pre-rivestito con ECMS. </li><li> Sostituire il mezzo con E8 medio senza inibitore ROCK dopo 24 ore di coltura. Le cellule dovrebbero hanno aderito entro tale data. </li></ol> 4. Passaging di hiPSCs <ol><li> Tipicamente, hiPSCs passaggio dopo aver raggiunto il 75% -80% di confluenza in un 6-pozzetti. Aspirare il terreno di coltura. Lavare rapidamente i pozzetti con 1 ml di sterile, RT PBS. Aspirare PBS. <ol><li> Aggiungere 500 ml di EDTA 0,5 mm o soluzione il distacco delle cellule 1x (ad esempio, Accutase) e incubare per 1-7 minuti a temperatura ambiente. Momento opportuno per EDTA incubazione varia con la linea hiPSC. Aspettiamo di vedere visibile il curling or ispessimento delle colonie intorno ai bordi, in modo da indicare che EDTA o distacco cellulare soluzione è pronto per essere rimosso. </li></ol></li><li> Aspirare il EDTA o la soluzione di distacco cellulare. Aggiungere 1 ml di E8 media integrato con inibitore ROCK 10 micron. Spostare colonie hiPSC nel pozzo ripetutamente pipettando su e giù e spruzzare colonie con una pipetta P1000. Le colonie dovrebbero essere suddivisi in 5-10 grumi di cellule dopo il completamento. </li><li> Trasferire le colonie che sono sospesi in 1 ml di terreno con E8 inibitore ROCK in una provetta conica da 15 ml. </li><li> Interrompere i grandi grumi di cellule in piccoli grumi nel medio E8. Aggiungere un volume appropriato di E8 media con inibitore alla sospensione cellulare per diluire le cellule. Il volume del supporto da aggiungere per diluizione dipende dalla densità delle cellule e il numero di pozzetti per essere seminati. Idealmente, una sola, l&#39;80% confluenti e dei hiPSCs deve essere diluito 1:12. <ol><li> Aggiungere 11 ml E8 media con inibitore ROCK agli attuali 1 ml di cell soluzione citata in tubo da 15 ml per ottenere una diluizione 1:12. </li></ol></li><li> Inoltre triturare i grumi di cellule in frammenti a piccole cellule (circa 50-200 cellule in ogni frammento è meglio). Evitare over-triturazione in quanto riduce la sopravvivenza delle cellule. </li><li> Aspirare ECMS dalle piastre pre-rivestito e aggiungere 2 ml di cellule risospese in ogni pozzetto. Circa 100.000 cellule per pozzetto di un 6-pozzetti è l&#39;ideale. Obiettivo per erogare le celle uniformemente intorno bene evitare raggruppamento delle cellule al centro del pozzo. </li><li> Dopo 24 ore di coltura, sostituire il supporto con E8 medio senza inibitore ROCK. Modificare il terreno di coltura ogni 24 ore fino a quando le cellule diventano 80% confluenti. Poi, le cellule sono ancora pronti per passaggio. Di solito ci vogliono 3-6 giorni tra i passaggi per raggiungere l&#39;80% di confluenza. </li></ol> 5. hiPSCs congelamento NOTA: seguire da vicino questa procedura in quanto può portare a coltura ottimale e differenziazione a valle di HIPSC in hiPSC-CM seguendo il ciclo di congelamento / scongelamento. <ol><li> Etichettare tubi criogenici con il nome di linea cellulare, tipo cellulare, il numero di passaggio, e la data di congelamento. Come regola generale, utilizzare un flacone per ogni pozzetto di un 6-pozzetti. Preparare un tubo da 15 ml riempita con 9 ml di E8 media con inibitore ROCK (10 micron). Preparare congelamento media con 90% FBS e 10% DMSO, e mantenere il mezzo a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Aspirare il terreno di coltura, aggiungere 500 ml di EDTA 0,5 mm o soluzione il distacco delle cellule 1x e incubare per 2-7 minuti a temperatura ambiente. La durata dell&#39;esposizione EDTA o distacco cellulare soluzione varia da linea cellulare di linea cellulare. </li><li> Aspirare EDTA o soluzione il distacco delle cellule. Aggiungere 1 ml di mezzo E8. </li><li> Spostare colonie hiPSC nel bene pipettando su e giù e spruzzare colonie con una pipetta P1000. Le colonie non dovrebbero essere suddivisi in più piccola di 100 grumi di cellule. Trasferire le cellule in sospensione per il tubo conico preparato contenente E8. Centrifugare a RT per 4 min a 200 x g. </li><li> Aspirare il surnatante e aggiungere 500 ml di medio congelamento freddo al pellet. Risospendere il pellet pipettando una o due volte. La sopravvivenza cellulare è migliorata mantenendo le cellule in grandi ciuffi. </li><li> Trasferire le cellule risospese in una provetta criogenica etichetta. Spostare rapidamente le fiale in un contenitore congelamento contenente isopropanolo, che consentirà di raffreddamento graduale. Mantenere il contenitore con le cellule a -80 ° C per 24 ore, quindi trasferire le cellule in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. </li></ol> 6. cardiaca Differenziazione delle iPSC umano NOTA: Tutti i media dovrebbero essere almeno a RT quando aggiunto. <ol><li> Dopo dissociazione con la soluzione di distacco EDTA o 1x cella, circa 100.000 sementi iPSCs umani sulla ECMS rivestiti piastre di coltura 6 pozzetti per la differenziazione (stessa procedura procedure Passaging cellulare). Quando le cellule raggiungono l&#39;85% di confluenza, cambiare il supporto di RPMI / B27 senza supporto di insulina con 6mcM inibitore GSK3-beta CHIR99021 (CHIR) e mantenere per 48 ore. </li><li> Dopo 48 ore, sostituire il mezzo di coltura contenente CHIR con RPMI / B27 senza supporto di insulina e lasciano in pace per 24 ore (fino al giorno 3). </li><li> Al giorno 3, cambiare il supporto di RPMI / B27 senza insulina con 5 micron Wnt inibitore IWR1 e mantenere per 48 ore (fino al giorno 5). NOTA: Wnt inibizione può anche essere condotta usando altri piccoli composti molecola, come descritto in studi precedenti 11. IWR1 stato selezionato sopra altri inibitori piccole molecole Wnt causa della maggiore gamma in cui è stato dimostrato per essere efficace nell&#39;inibire Wnt segnalazione 11. </li><li> Al giorno 5, cambiare il supporto posteriore per RPMI / B27 senza supporto di insulina e lasciar riposare per 48 ore (fino al giorno 7). </li><li> Al giorno 7, sostituire il mezzo con RPMI / B27 medio (con insulina) e sostituire medio ogni 3 giorni dopo con lo stesso mezzo. Battito spontaneo dei cardiomiociti dovrebbe in primo luogo essere visibile a circa giorno 8 al giorno10. </li></ol> 7. Purificazione di cardiomiociti umani per fame di glucosio <ol><li> Al giorno 10 post-differenziazione, cambiare il mezzo in ciascun pozzetto della piastra da 6 pozzetti a 2 ml di mezzo glucosio basso e mantenere le cellule in questo mezzo per 3 giorni (fino al giorno 13). </li><li> Al giorno 13, ritorno alle cellule di RPMI / B27 medio (con insulina). </li><li> Facoltativamente, replate cardiomiociti prima della seconda tornata di fame di glucosio per contribuire ad allentare i non cardiomiociti dalla piastra di coltura, che facilitano la dissociazione dei non cardiomiociti durante il digiuno del glucosio. <ol><li> Al giorno 13, media aspirare, lavare una volta con PBS, e dissociare le cellule in cellule singole con 500 ml di dissociazione cellulare dell&#39;enzima per 5 minuti a 37 ° C. In particolare, dopo 5 minuti di trattamento enzimatico, utilizzare una pipetta 1.000 microlitri dissociare manualmente cardiomiociti dal 6 pozzetti ripetutamente tirando l&#39;enzima dissociazione cellulare e spruzzare contro il cardiomyocyte monostrato. Fino a 30 ripetizioni pipettaggio può essere richiesto di dissociare i cardiomiociti in singole cellule. </li><li> Dopo che le cellule sono dissociate e sono in forma di singola cellula, raccogliere tutte le cellule in un tubo da 15 ml riempito con 5 ml di RPMI / B27 medio con insulina per diluire l&#39;enzima dissociazione cellulare e centrifugare per 4 min a 200 x g. Aspirare e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule con 2 ml RPMI / B27 media e la piastra su un nuovo ECMS rivestita 6 pozzetti. In genere, maggiore confluenza di cardiomiociti aiuta con la sopravvivenza delle cellule durante replating. Obiettivo di replate 2 milioni di cellule per piatto nuovo 6-bene per la sopravvivenza ottimale durante replating. </li></ol></li><li> Al giorno 14, cambiare il supporto posteriore a 2 ml di terreno di glucosio basso per un secondo ciclo di deprivazione di glucosio. Coltivare le cellule in questo stato di glucosio basso per altri 3 giorni. La maggior parte dei non-cardiomiociti moriranno in questa condizione cultura low-glucosio. </li><li> Al giorno 17, cambiare il supporto di 2 ml di RPMI / B27 media con insulina. Le cellule rimanenti saranno cardiomiociti altamente purificati. Questi cardiomiociti possono essere utilizzate per l&#39;analisi di espressione genica, screening di farmaci, analisi metabolica, e vari altri saggi a valle. </li></ol>

<ol>
	<li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (6), 150 (2013).</li><li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes.">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Kattman, S. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+enhances+the+survival+rate+of+human+embryonic+stem+cells+following+cryopreservation.">The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation.</a> Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells:+the+matrix+sandwich+method.">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li></ol>

The authors do not declare competing interests.

Ottenere una grande quantità di cardiomiociti hiPSC derivato altamente purificate è critica per la ricerca cardiaca base e applicazioni cliniche e traslazionali. Protocolli differenziazione cardiaca hanno subito enormi miglioramenti negli ultimi anni, la transizione dai metodi basati corpo embrioidi utilizzano fattori di crescita cardiogeno 2, alla matrice metodi a sandwich 12, e infine a piccole metodi basati monostrato molecola-modulato e 5. Tra i protocolli di cui sopra, il protocol...

Cardiomiociti umani primari sono difficili da ottenere a causa della necessità di biopsie cardiache invasive, difficoltà di dissociare di singole cellule, ed a causa della scarsa sopravvivenza cellulare a lungo termine in cultura. Data questa mancanza di cardiomiociti umani primari, umano indotto staminali pluripotenti cardiomiociti derivato dalle cellule specifiche del paziente tecnologia (hiPSC-CM) è stata considerata come una potente fonte cardiomiociti alternativa per la ricerca di base e applicazioni cliniche e traslazionali come la modellazione della malattia e della droga discovery 1. I primi sforzi di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in cardiomiociti impiegati protocolli di differenziamento utilizzando corpi embrionali (EBS), ma questo metodo è inefficiente in cardiomiociti producono perché spesso meno del 25% delle cellule in un EB sono battendo cardiomiociti 2,3. Comparativamente, un protocollo di differenziazione basata monostrato-utilizzando le citochine activina A e BMP4 visualizzato un rendimento superiore EBs, maquesto protocollo è ancora relativamente inefficiente, fattori di crescita richiede costosi, e funziona solo in un numero limitato di pluripotenti umana linee di cellule staminali 4. Recentemente, una, con sede a monostrato hiPSC protocollo di differenziazione dei cardiomiociti altamente efficiente è stato sviluppato attraverso la modulazione di segnalazione Wnt / β-catenina 5. Questi hiPSC-CM esprimere e alfa actinina due proteine ​​sarcomeriche che sono marcatori standard di cardiomiociti 6 troponina cardiaca T,. Il protocollo descrivere qui è un adattamento di questo piccolo basato molecola, alimentatore libera cellulare, differenziamento monostrato metodo 5,7. Siamo in grado di ottenere battendo cardiomiociti da hiPSCs dopo 7-10 giorni (Figura 1). Tuttavia, a seguito di una differenziazione cardiomiociti conseguente 50% battendo cellule, immunocolorazione costantemente dimostra l&#39;esistenza di una popolazione di non-cardiomiociti che sono negativi per i marcatori specifici cardiomiociti come alfa-actinina e specifico cardiaco troponina-T. Per further purificare cardiomiociti ed eliminare non cardiomiociti, popolazioni eterogenee di cellule differenziate sono stati sottoposti al glucosio inedia trattandoli con un mezzo estremamente bassa coltura glucosio per più giorni (Figura 2). Questo trattamento elimina selettivamente non cardiomiociti dovuta alla capacità dei cardiomiociti, ma non non-cardiomiociti, a metabolizzare lattato come fonte di energia primaria per sopravvivere in un ambiente a bassa glucosio 8. Dopo questa fase di purificazione, un aumento del 40% del rapporto di cardiomiociti ai non cardiomiociti si osserva, (Figura 3, Figura 4) e queste cellule può essere utilizzato per downstream analisi di espressione genica, modelli di malattia, e saggi di screening di stupefacenti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="550">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:207px;">Name</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog number</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Matrigel (9-12 mg/mL)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">RPMI media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11835055</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Glucose free RPMI media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11879-020</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">B27 Minus Insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1895601</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">B27 Supplement (w/ insulin)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Pen-strep antibiotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>BenchMark</td>
			<td>100-106</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2650</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>688000</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">CHIR99021</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>508306</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">IWR1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0161</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Cell lifter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-100-240</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Cryovial</td>
			<td>Fisher (NUNC tubes)</td>
			<td>375418</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12563-011</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation

Umane staminali pluripotenti indotte cellule derivate cardiomiociti (hiPSC-CMS) sono diventati una fonte di cellule importante per ovviare alla mancanza di cardiomiociti primari disponibili per applicazioni di ricerca e traslazionale di base. Per differenziare hiPSCs in cardiomiociti, sono stati sviluppati diversi protocolli tra cui corpo embrioide (EB) differenziazione basata e induzione fattore di crescita. Tuttavia, questi protocolli sono inefficienti e altamente variabili nella loro capacità di generare cardiomiociti purificati. Recentemente, una piccola molecola di base protocollo utilizzando la modulazione di Wnt / β-catenina ha mostrato di promuovere la differenziazione cardiaca con alta efficienza. Con questo protocollo, superiore al 50% -60% delle cellule differenziate erano cardiomiociti troponina-positivi cardiaca sono stati costantemente osservati. Per aumentare ulteriormente la purezza dei cardiomiociti, cellule differenziate sono stati sottoposti al glucosio inedia eliminare specificamente non cardiomiociti basato sulla differenza metabolicas tra cardiomiociti e non cardiomiociti. Usando questa strategia di selezione, abbiamo costantemente ottenuto un aumento superiore al 30% del rapporto di cardiomiociti ai non cardiomiociti in una popolazione di cellule differenziate. Questi cardiomiociti altamente purificati dovrebbero migliorare l&#39;affidabilità dei risultati di umana iPSC-based in studi di modellazione della malattia in vitro e test di screening di stupefacenti.

I cambiamenti morfologici durante hiPSC differenziazione. Il hiPSC coltivate in lastre senza alimentatore è cresciuto come piatti, colonie bidimensionali. Dopo aver raggiunto circa l&#39;85% di confluenza, hiPSCs sono stati trattati con 6 micron CHIR per la differenziazione (Figura 1A). Notevoli quantità di morte cellulare, un fenomeno normale e comune, sono stati osservati dopo 24 ore di trattamento CHIR. Dopo due giorni di trattamento CHIR, i hiPSCs cont...

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Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

Derivazione di Cardiomyocytes altamente purificato da cellule staminali umane pluripotenti indotte utilizzando piccoli Differenziazione Molecola-modulato e successiva glucosio Starvation

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

derivation-highly-purified-cardiomyocytes-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

18.4K Views.  Stanford University School of Medicine. Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening. 

Video: Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Derivazione senza alimentatore di melanociti da cellule staminali umane pluripotenti

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed phenotypes. Researchers interested in pursuing studies involving specific myocyte subtypes require a more directed differentiation approach. By treating mouse embryonic stem (ES) cells with Grem2, a secreted BMP antagonist that is necessary for atrial chamber formation in vivo, a large number of cardiac cells with an atrial phenotype can be generated. Use of the engineered Myh6-DSRed-Nuc pluripotent stem cell line allows for identification, selection, and purification of cardiomyocytes. In this protocol embryoid bodies are generated from Myh6-DSRed-Nuc cells using the hanging drop method and kept in suspension until differentiation day 4 (d4). At d4 cells are treated with Grem2 and plated onto gelatin coated plates. Between d8-d10 large contracting areas are observed in the cultures and continue to expand and mature through d14. Molecular, histological and electrophysiogical analyses indicate cells in Grem2-treated cells acquire atrial-like characteristics providing an in vitro model to study the biology of atrial cardiomyocytes and their response to various pharmacological agents.

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

Differenziazione dei atriale cardiomiociti dalle cellule staminali pluripotenti utilizzando la BMP Antagonista Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Generazione di integrazione-liberi cellule staminali pluripotenti indotte dalle cellule mononucleari di sangue periferico umano Utilizzando episomiale Vettori

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Differenziare i condrociti da cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo derivato dal sangue

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Derivazione libera dell&#39;integrazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo usando la matrice Laminina 521

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Rapida, regia di differenziazione delle cellule epiteliali del pigmento retinico da cellule staminali pluripotenti umane embrionali o indotto

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.