Vorremmo ringraziare tutti i membri della cellula formativa e medicina rigeneratrice Group dell&#39;Università di Würzburg per utili suggerimenti e Martina Gebhardt, nonché Heike Arthen per un eccellente supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), il Ministero dell&#39;Istruzione e della Ricerca tedesco BMBF (01 GN 0813), i bavaresi Research Network pluripotenti indotte cellule staminali &quot;forIPS&quot; e la &quot;Stiftung Sibylle Assmus &quot;. La figura 1 è stata prodotta utilizzando Servier medica Arte, disponibile da www.servier.com.

I fibroblasti umani utilizzati in questo studio sono stati ottenuti da una biopsia cutanea dopo essersi informato consenso e la clearance etico dal comitato etico dell&#39;Università di Würzburg, Germania (rapporto etico no: 96/11 del 10.06.2011). 1. Punch Biopsia <ol><li> Disinfettare la pelle del paziente. Anestetizzare parte della pelle di cui biopsia sarà presa da (preferibilmente una zona esposta al sole meno) con 0,5 a 1 ml di mepivacaina cloridrato intracutaneously e preparare biopsia della pelle utilizzando una sterile 3 millimetri biopsia, lavare biopsia con DPBS + 1 ml / 1 ml Gentamicina e rimuovere grasso. Sciacquare biopsia due volte con DPBS + gentamicina, aspirare DPBS completamente e copertura biopsia con dispasi II (2.4 U / ml) ed incubare 16 - 18 ore a 4 ° C. </li><li> Aspirare dispasi completamente, lavare due volte con DPBS e rimuovere l&#39;epidermide con una pinzetta. Lavare biopsia due volte con DPBS, aggiungere 2 ml tipo Collagenasi 2 (500 U / ml CDU), trasferimento in 15 ml di tubo e aggiungere Collagenase il volume totale fino a 5 ml. Incubare per 45 minuti a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Centrifugare 5 min a 180 xg ed eliminare il surnatante dopo. Risospendere pellet in 10 ml di DMEM-FCS-gentamicina-media (10% FCS, 1 ml / ml gentamicina) e centrifugare ancora per 5 min a 180 x g. Gettare il surnatante e risospendere pellet in 1,5 ml DMEM-FCS-gentamicina-media. Trasferimento t25 aderente pallone di coltura tissutale e incubare a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Modificare i media ogni 3 giorni. </li><li> Dopo circa due settimane, quando le cellule sono confluenti intorno alle parti della pelle, dividere le celle utilizzando tripsina / EDTA (0,05%): Lavare le cellule una volta con DPBS, incubare 5 minuti a 37 ° C, 5% di CO 2 dopo l&#39;aggiunta di 2 ml tripsina / EDTA (0,05%), aggiungere 2 ml di DMEM-FCS-Gentamicina-media, trasferimento in tubo da 15 ml e centrifugare a 180 xg per 5 minuti; scartare il surnatante e risospendere pellet in quantità appropriata di DMEM-FCS-gentamicina-media. </li><li> Espandere ulteriormente le cellule cambiando il mezzo ogni 3 rd giorno e la divisione come descritto in precedenza quando le cellule sono confluenti; aggiunta di gentamicina può essere interrotto dopo il passaggio 2. </li><li> Prima di utilizzare le cellule per esperimenti di conversione diretta, assicuratevi di escludere la contaminazione da micoplasma da analisi standard. </li><li> Quando le cellule sono state ampliate, si può iniziare direttamente la conversione o congelare cellule verso il basso con il 10% e il 90% DMSO FCS. Le cellule devono essere conservati in -80 ° C per 2 giorni e poi trasferite ad azoto liquido per la conservazione a lungo termine. </li><li> Per la preparazione della conversione, lavare le cellule una volta con DPBS, aspirare DPBS e aggiungere 2,5 ml tripsina / EDTA (0,05%). Conservare per 5 min a 37 ° C, 5% CO 2. Toccare pallone delicatamente per staccare le cellule, risospendere in 2,5 ml di mezzi di fibroblasti (DMEM incl. L-Glu + 10% FCS + 1% + 1% NEAA piruvato di sodio) e trasferimento in 15 ml di tubo. Centrifugare a 180 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 ml di mezzi di fibroblasti e pipetta su e giù per generare sospensione singola cella. &lt;/ Li&gt; <li> Contare il numero di cellule utilizzando una camera di conteggio Fuchs-Rosenthal- o Neubauer celle e 3 x 10 4 cellule per pozzetto di una piastra a pozzetti 24 plate. Incubare O / N a 37 ° C, 5% di CO 2. </li></ol> 2. L&#39;infezione di fibroblasti umani con Sendai Virus e Transdifferenziazione NOTA: Per garantire la sicurezza, le seguenti operazioni che manipolano virus devono essere eseguiti in una cappa di sicurezza biologica e una cappa a flusso laminare, e con gli adeguati dispositivi di sicurezza personale, in particolare una mascherina chirurgica, per evitare l&#39;esposizione della mucosa. <ol><li> Passare le cellule a 100 microlitri mezzi di fibroblasti (Passo 1.9). Scongelare aliquote di Oct4-, Klf4-, Sox2- e virus c-myc-Sendai e risospendere ogni virus in 1 ml di mezzi di fibroblasti. Aggiungere ogni virus con una MOI di 3 cellule (titolo virale varia da lotto a lotto, ma un&#39;aliquota di ciascuna virus può generalmente essere utilizzato per l&#39;infezione di 10 pozzetti di una piastra a pozzetti 24) e mescolare delicatamente. Incubare O / N a 37 ° C, 5% CO 2 </sub&gt;. </li><li> Dopo 24 ore aspirare medio e aggiungere 500 ml di mezzi neuroinduction (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% Glutamax, 10 ng / ml hLIF, 3 micron CHIR99021, 2 mM SB431542) e coltura a 39 ° C, 5% CO 2 da ora in poi. Modificare i media a giorni alterni. </li><li> Il giorno 6 dopo l&#39;infezione preparare laminina rivestite 6-pozzetti-: diluire laminina a 1 mg / ml di DPBS, aggiungere 1 ml di soluzione sulla 6-pozzetti e conservare a 4 ° C per 24 ore. </li><li> Il giorno 7 dopo l&#39;infezione dividere le celle utilizzando DPBS / EDTA: Aspirare il supporto e lavare le cellule una volta con DPBS, poi aggiungere 500 ml di DPBS / EDTA e incubare per 10 min a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Aggiungere 500 ml di DMEM / F12 e rimuovere sospensione dalla piastra in una provetta da 15 ml e centrifugare a 180 xg per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1,5 ml di mezzi neuroinduction, piatto su laminina rivestite 6 pozzetti-e aggiungere ROCK inibitore Y27632 in un conce finalentration di 10 micron per le cellule, coltura a 39 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Modificare i media a giorni alterni. </li><li> Dal giorno 14 dopo l&#39;infezione coltura le cellule a 37 ° C, 5% di CO 2. Colonie roepiteliale si manifestano intorno al giorno 17 dopo l&#39;infezione al microscopio a contrasto di fase. Essi dovrebbero essere abbastanza grandi per essere prelevati circa 20 giorni dopo l&#39;infezione. </li></ol> 3. Isolamento di Colonie putativo INPC <ol><li> Un giorno prima di prendere, cappotto un 48 ben piastra con laminina: diluire laminina a 1 mg / ml di DPBS, aggiungere 300 ml di soluzione su piastre e conservare a 4 ° C per 24 ore. Un giorno dopo aspirare laminina dai piatti e aggiungere 200 ml di mezzi neuroinduction ai pozzetti. </li><li> Lavare i 6 ben piastre contenenti le colonie di essere prelevati una volta con DPBS e aggiungere 2 ml DPBS per pozzetto di 6 ben piastre. Raccogliere le colonie meccanicamente: raschiare intorno colonie usando un ago sottile per liberarsi di cellule circostanti; impostare il 2001; l Pipetman su 50 ml e raccogliere le colonie utilizzando i rispettivi puntali delle pipette. </li><li> Trasferire una colonia ciascuna in un pozzetto di una piastra da 48 pozzetti laminina rivestite e generare una sospensione di cellule singole meccanicamente pipettando su e giù per 10 volte. Aggiungere inibitore ROCK Y27632 in una concentrazione finale di 10 mM alle cellule. </li><li> Grow le celle del 48 micropiastre a 37 ° C, 5% CO 2 per 2 giorni. Modificare i media ogni due giorni fino a quando le cellule raggiungono 80-90% di confluenza (circa 3 - 4 giorni.). </li></ol> 4. Ampliamento e Cryo-conservazione di iNPCs <ol><li> Passaging ed espansione di iNPCs <ol><li> Aspirare il medio e lavare le cellule con DPBS. Aspirare il DPBS e aggiungere 200 microlitri DPBS / EDTA e incubare per 10 min a 37 ° C, 5% CO 2, aggiungere 200 ml di DMEM / F12 e rimuovere sospensione dalla piastra in una provetta da 15 ml, centrifugare a 180 xg per 5 min . </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 0,5 ml di Neuroinduction supporto (punto 2.2), piastra su laminina rivestite 12-pozzetti e aggiungere inibitore ROCK Y27632 in una concentrazione finale di 10 pM alle cellule, coltura a 37 ° C, 5% CO 2. Dopo cellule raggiungono 80-90% confluenza possono essere sia ulteriormente ampliato o congelati come segue. </li></ol></li><li> Congelamento di iNPCs <ol><li> Aspirare il medio e lavare le cellule con DPBS. Aspirare il DPBS e aggiungere DPBS 300μl / EDTA e incubare per 10 min a 37 ° C, 5% CO 2, aggiungere 300 ml di DMEM / F12 e rimuovere sospensione dalla piastra in una provetta da 15 ml, centrifugare a 180 xg per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 0,5 ml di mezzo commerciale di congelamento NSC. Trasferimento sospensione fiale congelamento e mettere in un contenitore cella di congelamento. Conservare a -80 ° C per 2 giorni, poi il trasferimento per l&#39;azoto liquido per la conservazione a lungo termine. </li></ol></li></ol> 5. Differenziazione dei iNPCs <ol><li> Differenziazione verso neuroneal lineage <ol><li> Cellule di coltura su piastre laminina rivestite come sopra descritto. Cambia supporto per neuro-diff-media (DMEM / F-12, 1x N2, 1x B27, 300 ng / ml cAMP, 200 micron di vitamina C, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF) quando le cellule sono circa il 70% confluenti. Modificare i media ogni giorno per tre settimane. Do cellule non dividere durante la differenziazione. </li><li> Dopo tre settimane le cellule dovrebbero esprimere il marcatore TUJ1 neuronale. Per ottenere neuroni maturi e sottotipi neuronali continuano differenziazione fino a 3 mesi. </li></ol></li><li> La differenziazione verso lineage gliali <ol><li> Cambia supporto per i media ad induzione gliale (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 mM β-mercaptoetanolo, 100 micron aminoacidi non essenziali, 1,5 mm L-glutammina, l&#39;insulina 5 mg / ml, 40 ng / ml T3) incluso 20 ng / ml EGF di indurre il differenziamento in cellule precursori gliali. Rimuovere la metà dei media e sostituirli con mezzi freschi ogni giorno per circa 2 settimane. Durante questo periodo le cellule dovrebbero essere divisi1: 3 in presenza di 10 mM inibitore ROCK Y27632 quando viene raggiunto il 100% di confluenza. </li><li> Dopo 2 settimane differenziare le cellule ulteriormente in astrociti: quando le cellule sono supporti cambiamento quasi confluenti ai media commerciali astrociti disponibili, cambiare i media ogni due giorni. Dopo circa 7 giorni cellule iniziano a esprimere marcatori astrociti (ad esempio, GFAP). Se le cellule diventano 100% confluenti durante il protocollo di differenziazione, dividerli in un rapporto 1: 2 in presenza di 10 micron inibitore ROCK Y27632. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Qui vi mostriamo l&#39;isolamento e la conversione diretta di fibroblasti umani in cellule progenitrici neurali senza transgene espandibili e la loro progenie differenziata come base putativo per la terapia cellulare di sostituzione o l&#39;applicazione in analisi lo screening di stupefacenti. Conversione lineage diretta di cellule somatiche nel NPC è stato ottenuto mediante espressione forzata di trascrizione specifici lineage fattori 26,33,34. Tuttavia, in molti casi fibroblasti fetali sono stati usati per...

Nel 2006 Yamanaka e colleghi potrebbero mostrare per la prima volta la possibilità di riprogrammazione delle cellule somatiche in uno stato pluripotente 1. Questo dedifferentiation è stato raggiunto da sovraespressione di quattro fattori di trascrizione Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc in fibroblasti murini. Le generati cosiddette cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) mostrano l&#39;equivalenza funzionale alle cellule staminali embrionali (ESC) e possono quindi essere differenziati in tutti i tipi di cellule dell&#39;organismo adulto. Un anno dopo la riprogrammazione di iPSCs potrebbe essere realizzata anche per fibroblasti umani 2. Gli esperimenti in modelli animali dimostrano che le cellule IPSC derivati ​​vengono generalmente usate per la terapia cellulare di sostituzione, per esempio, in malattia di Parkinson (PD) 3-5. Tuttavia, alcune limitazioni associate con l&#39;uso di iPSCs rappresentano ostacoli per la piena realizzazione del loro potenziale terapeutico. Prima di tutto, riprogrammazione delle cellule in uno stato pluripotente e successivacontrollo di qualità è generalmente un tempo e processo inefficiente cedevole in ampi e quindi costose procedure di coltura cellulare. In secondo luogo, iPSCs bisogno di essere ri-differenziate nel tipo cellulare desiderato di interesse prima applicazione biomedica e la probabilità di cellule pluripotenti residue nella popolazione differenziata porti un significativo potenziale oncogeno e visualizza quindi un elevato rischio dopo il trapianto di cellule 6. In terzo luogo, il processo di riprogrammazione viene ottenuto inducendo i fattori di riprogrammazione da infezioni lenti- o retrovirale. L&#39;integrazione di questi virus nel genoma dell&#39;ospite potrebbe portare a mutagenesi inserzionale e / o riattivazione incontrollata dei transgeni 7,8. I sistemi non integrativi sono stati sviluppati per fornire i fattori di riprogrammazione di cellule bersaglio, che riducono al minimo il rischio di mutagenesi inserzionale e transgene riattivazione. Esempi di questi approcci senza transgene sono la riprogrammazione delle cellule utilizzando non l&#39;integrazioneAdeno o il virus di Sendai 9,10, basati sul DNA vettori 11 o l&#39;applicazione di metodi senza DNA, come la transfezione di mRNA sintetico 12 o trasduzione di proteine ​​ricombinanti 13,14. Un altro metodo promettente per la derivazione del libero-transgene IPSC è l&#39;uso di costrutti riprogrammazione lentivirali loxP modificati e la successiva eliminazione dei transgeni che utilizzano il sistema di ricombinazione Cre-loxP DNA 15,16. Un approccio più semplice per generare cellule neurali per la terapia di sostituzione cellulare rappresenta conversione diretta dei fibroblasti in neuroni post-mitotico 17-20. Vierbuchen et al. Riferito che la sovraespressione di fattori di trascrizione Ascl1, Brn2 e Myt1l risultati nella generazione di 20% neuroni da fibroblasti murini 17. Nel 2011 è stato dimostrato, che gli stessi tre fattori di trascrizione in combinazione con sovraespressione di NeuroD1 permettono transdifferenziazione di fibroblasti umani in neuRons 19. Umani indotta neuroni potrebbero essere generati anche da sovraespressione di Ascl1 e Ngn2 sotto dual SMAD- e GSK3β- inibizione 20. In particolare, la conversione diretta dei fibroblasti in neuroni genera una popolazione di cellule post-mitotico non proliferativa che non consente ulteriori espansioni e biobanche. Recentemente, la conversione diretta dei fibroblasti in una popolazione di cellule neurali staminali / progenitrici proliferazione è stato segnalato 21-26. Per motivi di chiarezza, tutti questi tipi cellulari saranno nominati come cellule progenitrici neurali indotte (iNPCs) in questo rapporto. Han et al. Sovraespresso Brn4, Sox2, c-Myc e Klf4 per generare iNPCs. Come i loro omologhi di cellule staminali neurali derivate da cellule o tessuti primaria o pluripotenti questi iNPCs sono tripotential e potrebbero essere differenziate in neuroni, astrociti e oligodendrociti 21. Il nostro gruppo ha un protocollo di conversione leggermente diversa che coinvolge sovraespressione di Sox2, Klf4E c-Myc e indotta Oct4-espressione per 5 giorni soltanto. Con questo approccio si potrebbe generare stabilmente proliferanti iNPCs da murine embrionali e adulte fibroblasti che presentano completo silenziamento della riprogrammazione fattori 22. In contrasto con iPSCs, iNPCs non presentano un potenziale cancerogeno dopo il trapianto 27. Abbiamo usato le cellule convertito con successo in un modello animale di demielinizzazione, ratti privi di mielina, dimostrando che iNPCs sono clinicamente utili 22. Fino ad allora, gli NPC possono essere generati solo da cellule staminali pluripotenti o tessuto neurale primaria 28-32. iNPCs sono cellule stabilmente espandibili che possono essere crioconservati e sono in grado di differenziarsi in neuroni, astrociti e oligodendrociti. Sono stati compiuti molti sforzi per adattare il protocollo conversione diretta da mouse per cellule umane 23,26,33,34. Nel 2012 è stato pubblicato che la sovraespressione del singolo fattore Sox2 nei fibroblasti è sufficiente a generare murine e umane iNPCs <sup&gt; 33. Gli autori hanno riferito generazione di iNPCs umani da fibroblasti prepuzio fetali e caratterizzati dalla colorazione contro Sox2 e Nestin. Tuttavia, le cellule bersaglio utilizzate per la riprogrammazione rappresentano un particolare tipo di cellule che non sarà disponibile nella pratica clinica e non vi era alcuna caratterizzazione funzionale delle cellule trasformate da trapianto in un modello animale eseguita. Una pubblicazione più recente descrive la generazione dei progenitori neuronali ristrette da fibroblasti fetali umane da sovraespressione di Sox2, c-Myc e sia Brn2 o Brn4 34. Le linee di cellule generate hanno mostrato capacità di auto-rinnovamento e potrebbero essere differenziate in vari tipi di neuroni terminali. Tuttavia, l&#39;utilizzo di fibroblasti fetali è sfavorevole, poiché queste cellule sono di origine eterogenea e non si può escludere la presenza di residui esempio, cellule staminali della cresta neurale nei preparati. Nel 2014, Zhu et al. Riportarono la conversione diretta di umano adulto e neonatale fibroblasti in cellule progenitrici neurali tripotential di sovraespressione di Sox2 insieme con Oct4 o Oct4 da solo e l&#39;aggiunta di piccole molecole ai media di coltura cellulare. In particolare, in base al loro studi Sox2 solo non era sufficiente per indurre conversione diretta 26. Più recentemente, Lu et al., Ha riferito che la sovraespressione della Yamanaka fattori Oct4-, Sox2-, Klf4-, c-Myc dal virus Sendai per 24 ore e successiva inattivazione del virus da un aumento di temperatura risultati nella generazione di espandibile neurale tripotential cellule precursori 23. In conclusione, anche se i protocolli di conversione pubblicati per le cellule umane finora hanno in comune la sovraespressione di almeno uno o più dei fattori Yamanaka, spesso in modo tempestivo ristretta, non vi è alcuna chiara indicazione dei fattori molecolari minimi necessari per guidare diretta conversione in iNPCs. La sovraespressione tempestivo limitato di Oct4 genetici, con mezzi, trasfezione con mRNA sintetico, oppure cproteine ​​ell permeanti insieme con l&#39;espressione costitutiva di Sox2, Klf-4, e c-Myc, non ha dato luogo a linee umane stabili INPC ancora. Pertanto, l&#39;applicazione di virus Sendai a overexpress tutti fattori Yamanaka e tempestive limitare la loro attività mediante inattivazione termica del virus 23 unitamente alle condizioni di induzione neurale multimediali ottimizzate 22,31 rappresenta la strategia preferita finora. Diversi studi dimostrano la funzionalità cellulare di cellule staminali neurali o dei loro omologhi differenziate in diversi modelli di malattie degli animali. Progenitori neurali da cellule staminali umane pluripotenti sono state trapiantate in modelli murini della malattia neuroinfiammatoria sclerosi multipla 35,36. L&#39;applicabilità di cellule progenitrici neurali hESC-derivati ​​in EAE (encefalomielite autoimmune sperimentale) -mice stato mostrato nel 2008 35. Cellule precursori neurali multipotenti sono state iniettate nei ventricoli del cervello di topo, e il risultato del trapiantocato nella riduzione dei segni clinici di EAE. Kim et al. Generato precursori oligodendrogliali di hESC e trapiantato quelli intracerebroventricolare in EAE-topi. Anche se il trapianto non sopravvissero per più di 10 giorni, i topi hanno mostrato un miglioramento significativo della funzione neurologica e la riduzione delle cellule immunitarie proinfiammatorie nella sostanza bianca 36. Terapia con cellule staminali è stato applicato anche per il targeting preclinico della malattia di Parkinson come PNG potrebbero essere impiegati con successo nei rispettivi modelli animali. Per questo, le cellule progenitrici sono stati derivati ​​da tessuto cerebrale fetale 37 differenziate da cellule staminali pluripotenti 38-40 o cellule staminali mesenchimali 41 sono state usate. Nel 2012 abbiamo dimostrato che iNPCs mouse sono in grado di produrre la proteina proteolipid, la principale componente proteica mielina, dopo il trapianto nel cervello di mielina-deficienti (md) ratti 22. Con questo esperimento prova di principio del applicabil terapeuticalità di iNPCs primo luogo è stato provato e subito confermata da un altro studio 32. Tuttavia, il pieno potenziale di uso terapeutico di iNPCs umani rimane da esplorare. Qui vi mostriamo un processo affidabile e integrata di (i) derivazione di cellule primarie umane da pazienti adulti tramite biopsia della pelle, (ii) la conversione diretta di fibroblasti umani in uno stato progenitore neuronale e (iii) la capacità di iNPCs essere differenziati in neuronale e lignaggi gliali. L&#39;utilizzo di questo protocollo contribuirà ad accelerare la generazione di cellule umane autologhe per applicazioni terapeutiche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Astrocyte media</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td align="right">1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch</td>
			<td>pfm medical</td>
			<td align="right">48301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon medchem</td>
			<td align="right">1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type2</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>PAN&#160;</td>
			<td>P10-032100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Roth</td>
			<td align="right">4720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td align="right">50115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP-antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hLIF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>GEM-700-112-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67-antibody</td>
			<td>NeoMarkers</td>
			<td>RM-9106-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSC freezing media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct4-antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc9081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6-antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>inh-sb43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>&#160;LifeTechnologies</td>
			<td>A1378001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumpyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox1-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-205725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1-antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 146986-50-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td align="right">21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into expandable neural progenitor cells

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) da fibroblasti cutanei adulti e la successiva differenziazione in cellule somatiche fornisce prospettive affascinanti per la derivazione dei trapianti autologhi che aggirano le barriere di istocompatibilità. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e la successiva differenziazione completa in linee desiderati rimane un posto di blocco per la traduzione clinica della tecnologia IPSC a causa del potenziale neoplastico e genomica instabilità associata. Recentemente, noi e gli altri dimostrato che le cellule somatiche non possono essere convertiti in iPSCs ma anche in diversi tipi di cellule staminali somatiche multipotenti solo utilizzando fattori definiti, eludendo così la progressione attraverso lo stato pluripotente. In particolare, la conversione diretta di fibroblasti umani in cellule progenitrici neurali indotte (iNPCs) prelude alla possibilità di una fonte di cellule autologhe romanzo per varie applicazioni come la sostituzione delle cellule, modelli di malattiae lo screening di stupefacenti. Qui, descriviamo l&#39;isolamento di adulti fibroblasti primari umani da biopsia cutanea e la loro conversione diretta efficace in iNPCs di espressione tempestivo ristretto di Oct4, Sox2, Klf4, così come c-Myc. Colonie neuroepiteliale Sox2-positivi compaiono dopo 17 giorni di induzione e linee INPC possono essere stabiliti in modo efficiente isolamento monoclonale ed espansione. Regolazione precisa della molteplicità di infezione virale e l&#39;integrazione della leucemia fattore inibitorio durante la fase di induzione rappresentano fattori critici per raggiungere efficienze di conversione fino al 0,2%. Finora, le linee INPC specifici del paziente potrebbero essere ampliati per più di 12 passaggi e uniforme mostrano caratteristiche morfologiche e molecolari delle cellule staminali / progenitrici neurali, come l&#39;espressione di nestina e Sox2. Le linee INPC possono essere differenziate in neuroni e astrociti come giudicato dalla colorazione contro TUJ1 e GFAP, rispettivamente. In conclusione, riportiamo un protocollo robusto per la derivazione e terribileconversione ct di fibroblasti umani in cellule progenitrici neurali stabilmente espandibili che potrebbero fornire una fonte cellulare per applicazioni biomediche come autologo sostituzione delle cellule neurali e modelli di malattia.

Qui vi presentiamo una descrizione di un processo integrato che permette la generazione di cellule indotte neurali progenitrici (iNPCs) da fibroblasti umani che sono stati ottenuti da una biopsia di pelle in meno di 8 settimane (Figura 1). INPCs paziente-specifc possono essere ulteriormente differenziati in lignaggi neuronali e gliali e porto un enorme potenziale per la terapia di sostituzione cellulare e modelli di malattia. L&#39;infezione dei fibroblasti con Oct4-, Klf4-,...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells at JoVE.com

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte fornisce prospettive affascinanti per la derivazione di trapianto autologo. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e laborioso ri-differenziazione impedisce ancora di traduzione clinica. Qui si descrive la derivazione di fibroblasti umani adulti e la loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali indotte e la successiva differenziazione in linee neurali.

Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

derivation-adult-human-fibroblasts-their-direct-conversion-into

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K Views.  University of Würzburg.  Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte fornisce prospettive affascinanti per la derivazione di trapianto autologo. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e laborioso ri-differenziazione impedisce ancora di traduzione clinica. Qui si descrive la derivazione di fibroblasti umani adulti e la loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali indotte e la successiva differenziazione in linee neurali. 

Video: Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Ricerca

Neuroscienze

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural-formanti colonia saggio Cell: un test per discriminare Bona Fide cellule staminali neurali da cellule progenitrici neurali

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-cellula Imaging di cellule sensoriali Precursore in Organo intatto Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis and enable new strategies for in vitro modeling or repairing the diseased brain. Identifying brain-resident non-neuronal cell types amenable to direct conversion into iNs might allow for launching such an approach in situ, i.e. within the damaged brain tissue. Here we describe a protocol developed in the attempt of identifying cells derived from the adult human brain that fulfill this premise. This protocol involves: (1) the culturing of human cells from the cerebral cortex obtained from adult human brain biopsies; (2) the in vitro expansion (approximately requiring 2-4 weeks) and characterization of the culture by immunocytochemistry and flow cytometry; (3) the enrichment by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using anti-PDGF receptor-&#946; and anti-CD146 antibodies; (4) the retrovirus-mediated transduction with the neurogenic transcription factors sox2 and ascl1; (5) and finally the characterization of the resultant pericyte-derived induced neurons (PdiNs) by immunocytochemistry (14 days to 8 weeks following retroviral transduction). At this stage, iNs can be probed for their electrical properties by patch-clamp recording. This protocol provides a highly reproducible procedure for the in vitro lineage conversion of brain-resident pericytes into functional human iNs.

Targeting brain-resident cells for direct lineage-reprogramming offers new perspectives for brain repair. Here we describe a protocol of how to prepare cultures enriched for brain-resident pericytes from the adult human cerebral cortex and convert these into induced neurons by retrovirus-mediated expression of the transcription factors Sox2 and Ascl1.

Lineage-riprogrammazione di cellule pericyte-derivate del cervello umano adulto in neuroni indotti

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Derivazione libero-Feeder della cresta neurale progenitrici Cellule pluripotenti da cellule staminali umane

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Sviluppo di un protocollo di raffinata per Trans-sclerale Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Homochronic trapianto di precursori Interneurone in cervelli di topo postnatale precoce

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identificazione dei marcatori di superficie cellulare delle cellule staminali primarie e delle cellule progenitrici mediante l'etichettatura metabolica di Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Conversione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC) in neuroni motore spinale e cranico funzionale utilizzando vettori PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...