XHP è stato sostenuto dal National Institute of Health (NIH) sovvenzioni da National Institute on Aging (NIHK01AG024496) e The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano (NIHR21HD056530).

1. Soluzione e Media Preparazione <ol><li> Rivestimento in gelatina soluzione: 0,1% (w / v) gelatina in DDH 2 O, autoclave e conservare a 4 ° C. </li><li> Matrigel rivestimento soluzioni. Soluzione: lento disgelo Matrigel (10 ml) a 4 ° C per una notte, aggiungere 10 ml ghiacciata DMEM o DMEM/F12, mescolare bene e aliquota 1 ml / tubo sotto cappuccio tessuto sterilizzato cultura, conservare a -20 ° C. Soluzione di lavoro: lento disgelo 1 ml aliquota Matrigel a 4 ° C per 1-2 ore, il trasferimento di 14 ml o refrigerata DMEM DMEM/F12 e mescolare bene sotto cappa sterile cultura del tessuto immediatamente prima del rivestimento. </li><li> Umano laminina soluzione di rivestimento: diluire 1 ml di soluzione umana laminina (0,5 mg / ml in Tris tamponata NaCl, conservare a -80 ° C, lento disgelo a 4 ° C per 1-2 ore) con gelida DMEM o DMEM/F12 a 12,5 ml soluzione di lavoro (40 mcg / ml) sotto cappa sterile cultura del tessuto immediatamente prima del rivestimento. </li><li> Fattore di crescita soluzioni madri (500-1000X): sciogliere il fattore di crescita a 10 mcg/ Ml in tampone sterile (0,5% di BSA, 1,0 mM DTT, 10% glicerolo, 1XPBS) e di memorizzare fino a 50-100 microlitri / tubo aliquote a -80 ° C. </li><li> Tutte le trans retinoico soluzione di lavoro (1000X): 10 mM in DMSO, conservare in aliquote a -80 ° C. </li><li> Mezzi di comunicazione HESC: DMEM/F12 o KO-DMEM (80%), KO sostituzione del siero (20%), L-alanil-L-gln o L-GLN (2 mm), MEM acidi aminoacidi non essenziali (MNAA, 1X), e β-mercaptoetanolo (100 micron), filtrare e conservare a 4 ° C, integrato con 20 ng / ml bFGF prima dell&#39;uso. O la sostituzione di &quot;knock out (KO) la sostituzione del siero&quot; con componenti definiti: DMEM/F12 o KO-DMEM (100%), L-alanil-L-gln o L-GLN (2 mm), MNAA (1X), MEM essenziale amminoacidi (MEAA, 1X) e β-mercaptoetanolo (100 micron), filtrata e conservare a 4 ° C, integrato con bFGF (20 ng / ml), l&#39;insulina umana (20 mg / ml), acido ascorbico (50 mg / ml), umano activina A (50 ng / ml), albumina umana / Albumax (10 mg / ml), e transferrina umana (8 mcg / ml) prima dell&#39;uso. </li><li> NSC media: DMEM/F12 (100%), N-2 supplement (1X), l&#39;eparina (8 mcg / ml). </li></ol> 2. Lastra di rivestimento <ol><li> Piastre cappotto con gelatina: aggiungere 2,5 ml / pozzetto di soluzione di gelatina a 6 piastre ed incubare una notte a 37 ° C incubatore umidificato. </li><li> Piastre cappotto con laminina: chill gelatina rivestite piatti e rimuovere la gelatina, aggiungere 2,5 ml / o umani e Matrigel soluzione di rivestimento laminina lavoro di pre-refrigerata gelatinizzato 6 pozzetti ed incubare a 4 ° C durante la notte. </li></ol> 3. Passaging e semina hESC indifferenziato in condizioni definite <ol><li> Lasciare colonie hESC crescere fino a 5-7 giorni vecchi, e prendere la cultura piastra hESC a microscopio da dissezione (pre-riscaldare dissezione fase a 37 ° C) sotto cappa sterile dissezione. </li><li> Seleziona colonie hESC da dividere. Morfologicamente, queste colonie avrebbero dovuto&gt; hESC 75% indifferenziato (piccole celle compatte), di solito leggermente opaco (non bianco-ammucchiati cellule non differenziate cellule chiare) con bordo ONU definitoderneath il microscopio da dissezione. Attentamente delineare le colonie selezionate e rimuovere strato differenziato dei fibroblasti che circonda la colonia e tutte le parti differenziate (se presente) della colonia con il bordo della P2 punta pipetta sterile o tirato capillare di vetro. (Si prega di notare, hESC pluripotenti sono in una fase transitoria, subiscono differenziazione spontanea anche in condizioni ottimali, anche se si preferisce, è difficile accertare le cellule tesi sono al 100% indifferenziato sotto microscopio da dissezione,&gt; 75% indifferenziati vengono solitamente considerati come il punto di passaggio. L&#39; cellule differenziate di solito non di semi e continuare a crescere, eliminati nel processo di passaging) </li><li> Rimuovere i vecchi media mobile contenente le cellule differenziate staccato da aspirazione. Lavare con i media hESC (senza bFGF) una volta. Aggiungere 3 ml / media hESC ben fresco contenente 20 ng / ml bFGF. </li><li> Tagliare le colonie hESC indifferenziato in piccoli pezzi, e staccare con la punta della pipetta sterile o vetro tirato capillare.</li><li> Piscina i supporti contenenti pezzi staccati colonia insieme in un tubo da 50 ml. Lavare la piastra una volta con 1 ml / media hESC pozzetto contenente 20 ng / ml bFGF e piscina insieme. </li><li> Aspirare il Matrigel o umano soluzione laminina dalle piastre rivestito fresca. Aliquota 4 ml / pozzetto contenente pezzi dei media hESC colonia di un 6-pozzetti. Delicatamente trasferire la piastra per incubatore senza agitare e lasciare colonia semi di pezzi durante la notte senza disturbare umidificata in un incubatore a 37 ° C con una atmosfera di 5% di CO 2. </li></ol> 4. Induzione neurale di hESC in Sistema Cultura Definito con Acido Retinoico <ol><li> Al 3 ° giorno dopo la semina, rimuovere la maggior parte dei vecchi media da ciascun pozzetto della piastra e di lasciare i supporti a sufficienza per permettere colonie hESC di essere sommersa (mai permettere hESC ad asciugarsi). Sostituire con 4 ml / media hESC ben fresco contenente 20 ng / ml bFGF e 10 mM acido retinoico. </li><li> Sostituire vecchi media con i media hESC fresca contenente 20 ng / ml bFGF e10 mM acido retinoico a giorni alterni, e permettere neurali indotti colonie hESC crescere fino a giorno 7 o 8. Tutte le cellule all&#39;interno della colonia subirà cambiamenti morfologia a grandi cellule differenziate che continueranno a moltiplicarsi. Le colonie aumenteranno di dimensioni per coprire la piastra di giorno 7 o 8, e le cellule cominceranno ad accumularsi in alcune aree delle colonie. </li></ol> 5. Continuando differenziamento neuronale in Cultura Sospensione <ol><li> Prendere la cultura piastra hESC microscopio a dissezione (pre-riscaldare dissezione fase a 37 ° C) sotto cappa sterile dissezione. Attentamente delineare le colonie e rimuovere strato di fibroblasti che circonda la colonia (cellule differenziate migrate dalla colonia) con il bordo della P2 puntale sterile o tirato capillare di vetro. </li><li> Rimuovere i vecchi media mobile contenente cellule di fibroblasti staccato da aspirazione. Lavare con i media hESC (senza bFGF) una volta. Aggiungere 3 ml / media hESC ben fresco (senza bFGF). </li><li> Tagliare il neurali-icolonie hESC nduced in piccoli pezzi, e staccare con la punta della pipetta sterile o tirato capillare di vetro. </li><li> Piscina i supporti contenenti pezzi staccati colonia insieme in un tubo da 50 ml. Lavare la piastra una volta con 1 ml / media hESC bene (senza bFGF) e piscina insieme. </li><li> Aliquota 4 ml / e senza siero hESC supporti contenenti pezzi colonia di un 6-pozzetti bassissimo attaccamento e incubare a 37 ° C umidificata incubatore per consentire galleggiante ammassi cellulari (neuroblasti) per formare per 4-5 giorni. </li></ol> 6. Fenotipo maturazione neuronale nella cultura adesivo <ol><li> Piscina i supporti contenenti neuroblasti galleggiante insieme in un tubo da 50 ml. Centrifugare a 1400 rpm per 5 min. Aspirare il vecchi media per quanto è possibile e aggiungere pari quantità di fresca NSC supporti contenenti VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), e BDNF (10 ng / ml). </li><li> Pipetta su e giù per miscelare neuroblasti galleggianti e aliquota 4 ml / pozzetto a 6-pozzetti. Il neuroblasti può anche essere séeded in un laminina laminina / collagene (Matrigel) o umana polimerizzati 3-dimensionale matrice nel siero senza mezzi NSC contenenti VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), e BDNF (10 ng / ml) . Trasferire le piastre a 37 ° C in incubatore umidificato per consentire neuroblasti di allegare tutta la notte. </li><li> Sostituire NSC supporti contenenti VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), e BDNF (10 ng / ml) a giorni alterni. Vaste reti di cellule neuronali dei neuriti portanti e cellule pigmentate cominceranno a comparire entro 2 settimane di coltivazione continua e aumento del numero con il tempo, e potrebbe essere sostenuta per oltre 3 mesi. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: L&#39;acido retinoico (RA) è reso sufficiente a indurre hESC mantenuto nel sistema cultura definita la transizione da pluripotenza esclusivamente ad un fenotipo neuroectodermici (Fig. 2A). In caso di esposizione di hESC indifferenziato a RA, tutte le cellule all&#39;interno della colonia subirà cambiamenti di morfologiagrandi cellule differenziate che cessano esprimere pluripotenza associati marcatori, come indicato dalla Oct-4, e cominciare a esprimere diverse neuroectoderma associati marcatori, come HNK1, AP2, e TRKC (Fig. 2B). Queste cellule differenziate grandi continueranno a moltiplicarsi e le colonie aumenteranno di dimensione, di procedere spontaneamente per esprimere il marker precoce neuronale β-III-tubulina (fig. 2B). Il marcatore più maturo neuronale Mappa-2 si cominciano ad apparire nelle aree delle colonie dove le cellule si sono accumulati (Fig. 2B). In coincidenza con la comparsa delle cellule neuroectodermici e la differenziazione neuronale, il meccanismo neuronale specifico fattore trascrizionale Nurr1, implicato nella differenziazione dei neuroni dopaminergici e l&#39;attivazione della tirosina idrossilasi (TH) del gene 16, sarà traslocare al nucleo (Fig. 2B). Dopo aver staccato la hESC RA trattati formeranno galleggiante ammassi cellulari (neuroblasti) in una setta sospensioneure per continuare il processo di differenziazione neuronale. Dopo la rimozione di bFGF e dopo permettendo neuroblasti per collegare ad una piastra di coltura tissutale o seminati in un laminina / collagene polimerizzato 3-dimensionale matrice di un siero privo di un terreno specifico, β-III-tubulina e mappa-2-esprimere, neuriti portante cellule e cellule pigmentate inizieranno ad apparire con un drastico aumento di efficienza rispetto ai spontanea multi-lignaggio differenziazione delle hESC senza trattamento nel periodo di tempo stesso, e potrebbe essere sostenuta per oltre 3 mesi (Fig. 2C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig1.jpg" /> Figura 1 Uno schema di ben controllata induzione efficiente delle cellule staminali umane pluripotenti esclusivamente ad una particolare stirpe clinicamente rilevanti da semplice disposizione di piccole molecole. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig2.jpg" /> Figura 2 <strong&gt; Acido retinoico induce specifiche neurali lignaggio e la progressione neuronale diretta di pluripotenza in determinate condizioni. (A) Schema raffigurante della linea Time Protocol of diretto differenziazione neuronale di hESC. (B) Dopo l&#39;esposizione di hESC indifferenziato ad acido retinoico (RA) nell&#39;ambito del sistema cultura definita, grande differenziati ottobre-4 (rosso), le cellule negative all&#39;interno della colonia ha cominciato ad emergere, rispetto ai mock-trattati (DMSO) hESC come il controllo . RA-indotta delle cellule differenziate ottobre-4-negativi cominciarono a esprimere HNK-1 (rossa), AP2 (rosso), TRKC (verde), e poi β-III-tubulina (rosso), in linea con primi differenziazione neuroectodermici. Queste cellule hanno continuato a maturare in ultima analisi, che esprimono il marcatore neuronale Map-2 (verde), di solito in aree in cui cellule hanno cominciato ad accumularsi. In coincidenza con la comparsa delle cellule neuroectodermici e la differenziazione neuronale, il meccanismo neuronale specifico fattore trascrizionale Nurr1 (verde), implicato indopaminergici differenziazione neuronale e l&#39;attivazione della tirosina idrossilasi (TH) del gene, traslocato al nucleo. Tutte le cellule sono mostrati dalla colorazione DAPI dei loro nuclei (blu). (C) il trattamento con RA induce la differenziazione verso una linea neuronale ad alta efficienza come dimostrato dalle reti estese di neuriti-cuscinetto cellule che esprimono β-III-tubulina (in rosso) e mappa-2 (verde, mostrata in un 3-dimensionali matrice). Le frecce indicano le cellule pigmentate tipico di quelli del sistema nervoso centrale. Tutte le cellule sono mostrati dalla colorazione DAPI dei loro nuclei (blu) in riquadri. Barre di scala: 0,1 mm.

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

Gli autori dichiarano interessi in competizione. XHP è il fondatore di Xcelthera. XHP e EYS hanno proprietà intellettuale relativi alle hESC.

Una delle sfide più importanti sia per lo studio dello sviluppo e la traduzione clinica è stata come incanalare le ampie potenzialità di differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti da un fenotipo desiderato in modo efficiente e prevedibile. Anche se tali cellule possono differenziarsi spontaneamente in vitro in cellule di tutti gli strati germinali passando attraverso un multi-stadio lignaggio aggregato, solo una piccola frazione di cellule perseguire un 1,4 lignaggio dato. In questi hESC derivati ​​aggregati, la simultanea comparsa di una notevole quantità di ampiamente divergenti tipi di cellule indesiderate che possono risiedere in tre strati germinali embrionali rende spesso la comparsa di fenotipi desiderati non solo inefficiente, ma incontrollabile e inaffidabile pure. Anche se lignaggi cardiache e neuronali sono stati ottenuti in precedenti relazioni, tuttavia, l&#39;inefficienza nella generazione di cellule specializzate attraverso strato germinale, l&#39;induzione di cellule pluripotenti e l&#39;alto rischio di cancerogenicità a seguito transplantation hanno impedito ulteriori traduzioni cliniche. Le linee di hESC inizialmente sono stati ottenuti e mantenuti in co-coltura con una crescita arrestato topo fibroblasti embrionali (MEF) 4. Anche se molti di alimentazione umana, senza alimentatore, e sistemi di coltura chimicamente formulati sono stati sviluppati per hESC 11-13, gli elementi necessari e sufficienti per sostenere l&#39;auto-rinnovamento delle cellule pluripotenti umane restano irrisolti. Queste cellule alimentatore esogeni e reagenti biologici aiutano a mantenere la crescita a lungo termine stabile di hESC indifferenziata, mentre la maschera la capacità delle cellule pluripotenti di rispondere ai segnali di sviluppo. Mantenere hESC indifferenziato in un definito biologici sistema privo di cultura che consente l&#39;espansione fedeli e controllabili differenziazione diretta è una delle chiavi per la loro utilità e le potenzialità terapeutiche. RA non era sufficiente a indurre la differenziazione neuronale di hESC indifferenziato mantenuto sotto condiz precedentemente riportatoioni contenenti cellule alimentatore esogeni. Anche se lignaggi neurale compaiono in una fase relativamente precoce nella differenziazione hESC, trattando hESC differenziato multi-lignaggio aggregati (corpi embrionali) con artrite reumatoide solo leggermente aumentato la bassa resa dei neuroni 1, 14, 15. Per raggiungere in modo uniforme la conversione di cellule staminali umane pluripotenti da una stirpe particolare, abbiamo impiegato un sistema di coltura definito in grado di assicurare la proliferazione di hESC indifferenziato per identificare le condizioni per ben controllata induzione efficiente delle hESC pluripotenti esclusivamente ad una particolare stirpe clinicamente rilevanti dalla semplice fornitura di piccole molecole (Fig. 1, fig. 2). Studi futuri rivelerà molecole controllo genetico ed epigenetico dello sviluppo umano nel sistema nervoso centrale come alternative, che possono aprire la strada a piccole molecole-mediata controllo diretto e la modulazione del destino hESC quando pluripotenti derivanti lignaggi clinicamente rilevanti per terapie rigenerative. Senza trattamento con RA, 1-5HESC% sarà oggetto di differenziazione spontanea in neuroni 1, 14, 15. Con il trattamento con RA, siamo stati in grado di generare&gt; 95% progenitori embrionali neuronali ed i neuroni dalle hESC mantenuto nell&#39;ambito di una definizione di cultura in un processo che potrebbe emulare sviluppo embrionale umano 14. Recentemente, noto neurali destino determinare i geni sono stati utilizzati per transdifferenziarsi fibroblasti di topo adulto in progenitori neurali e dei neuroni con un basso livello di efficienza che vanno 0,5-8% 17, 18. Tuttavia, riprogrammato le cellule somatiche sono state storicamente associato con l&#39;espressione genica anormale e senescenza accelerata con compromissione della utilità terapeutica 19-21. Infine, il protocollo abbiamo stabilito qui è limitato alle hESC pluripotenti derivate dalla massa cellulare interna (ICM) o epiblast della blastocisti umana 4, non possono applicarsi a cellule pluripotenti altri, tra cui origine animale-CES, CES derivati ​​da precedenti morula (otto celle) embrioni allo stadio 22, e artificially cellule riprogrammate 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> Bioscienze BD </td><td> 356231 </td><td> Fattore di crescita ridotta </td></tr><tr><td> Umano laminina </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> all trans retinoico </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565018 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out sostituzione siero </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM soluzione di aminoacidi non essenziali (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM unoMino acidi soluzione (MEAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Acido ascorbico </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> Transferrina umana </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> BFGF umano </td><td> Peprotech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;insulina umana </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> Un umano activina </td><td> Peprotech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> Umano BDNF </td><td> Peprotech </td><td> AF-450-02 </td><td></td></tr><tr><td> VEGF umano </td><td> Peprotech </td><td> AF-100-20 </td><td></td></tr><tr><td> Umano NT-3 </td><td> Peprotech </td><td> 450-03 </td><td></td></tr><tr><td> Eparina </td&gt; <td> Sigma </td><td> H5284 </td><td></td></tr><tr><td> N-2 supplemento (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td><td></td></tr><tr><td> 6-ben ultrabassa piastra di fissaggio </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6 pozzetti </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

C&#39;è un grande bisogno insoddisfatto di una clinicamente adeguata fonte di cellule neuronali umane per la riparazione o rigenerazione del danneggiato sistema nervoso centrale (SNC) struttura e circuiti nel settore sanitario di oggi. Terapie basate sulle cellule sono molto promettenti per ripristinare il tessuto nervoso e la funzione perduta per i disturbi del sistema nervoso centrale. Tuttavia, terapie cellulari basate sul sistema nervoso centrale, cellule staminali neurali hanno incontrato limitazioni e difficoltà di alimentazione da utilizzare in ambito clinico grazie alla loro capacità di espansione limitata di cultura e di plasticità, dopo non aver esteso 1-3 passaging. Nonostante alcuni risultati positivi, il CNS-derivato cellule staminali neurali (hNSCs) sembrano esercitare i loro effetti terapeutici principalmente dalla loro progenie non neuronali attraverso la produzione trofica e le molecole neuroprotettive per salvare le cellule endogene 1-3. In alternativa, pluripotenti le cellule staminali embrionali umane (hESC) proffer cure per una vasta gamma di disturbi neurologici da supplying la diversità dei tipi di cellule umane neuronali del sistema nervoso centrale di sviluppo per la rigenerazione 1,4-7. Tuttavia, come incanalare il potenziale ampia differenziazione delle hESC pluripotenti in modo efficiente e prevedibile di un fenotipo desiderato è stato una grande sfida sia per lo studio e la traduzione di sviluppo clinico. Approcci convenzionali si basano su multi-lignaggio inclinazione di cellule pluripotenti attraverso la differenziazione spontanea foglietto embrionale, con conseguente inefficienza e incontrollabile lignaggio impegno che viene spesso seguita da eterogeneità fenotipica e instabilità, di conseguenza, un elevato rischio di tumorigenicità 7-10. Inoltre, non definito integratori stranieri / animale biologica e / o alimentatori che sono stati generalmente utilizzati per l&#39;isolamento, l&#39;espansione e la differenziazione delle hESC può utilizzarli direttamente di tali cellule specializzate innesti nei pazienti problematici 11-13. Per superare questi ostacoli, abbiamo risolto gli elementi di un sistema di coltura definito necessaria e sufficiente per sustaining il pluripotence epiblast di hESC, che funge da piattaforma per la derivazione de novo di hESC clinicamente adeguata ed efficace regia hESC quali uniformemente verso lignaggi clinicamente rilevanti da piccole molecole 14 (vedere uno schema in figura. 1). L&#39;acido retinoico (RA) non induce la differenziazione neuronale di hESC indifferenziata mantenuta su linee 1, 14. E a differenza di CES del mouse, trattando corpi embrionali hESC differenziato (EBS) solo leggermente aumenta la bassa resa dei neuroni 1, 14, 15. Tuttavia, dopo lo screening di una serie di piccole molecole e fattori di crescita, abbiamo riscontrato che tali condizioni definite reso acido retinoico (RA) sufficiente a indurre le specifiche del neuroectoderma diretto da hESC pluripotenti che ulteriormente progredita al neuroblasti che ha generato umano progenitori neuronali ed i neuroni nel SNC di sviluppo con alta efficienza (Fig. 2). Abbiamo definito le condizioni per l&#39;induzione della neuroesplosioni diretto da hESC pluripotenti senza un intervento a più fasi embrionali lignaggio corpo, consentendo ben controllati derivazione efficiente di una grande quantità di cellule neuronali tutta la gamma di stadi di sviluppo per le terapie basate sulle cellule.

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Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Abbiamo stabilito un protocollo per l&#39;induzione di neuroblasti pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di progenitori neuronali umane e tipi di cellule neuronali nel sistema nervoso centrale per lo sviluppo neurale riparazione.

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

efficient-derivation-human-neuronal-progenitors-neurons-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K Views.  San Diego Regenerative Medicine Institute. Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione di neuroblasti pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di progenitori neuronali umane e tipi di cellule neuronali nel sistema nervoso centrale per lo sviluppo neurale riparazione.

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DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Etichettatura DiOLISTIC di neuroni da roditori e non-umano Fette cervello dei primati

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Ricerca

Neuroscienze

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

La specifica di telencefalici neuroni glutamatergici di cellule staminali umane pluripotenti

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Derivazione libero-Feeder della cresta neurale progenitrici Cellule pluripotenti da cellule staminali umane

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Conversione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC) in neuroni motore spinale e cranico funzionale utilizzando vettori PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

Differenziazione neuronale dalle cellule staminali embrionali del topo in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

Derivazione, espansione, crioconservazione e caratterizzazione di cellule endoteliali microvascolari cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and Leber Congenital Amaurosis (LCA) cause progressive and debilitating vision loss. There is an unmet need for therapies that can restore vision once photoreceptors have been lost. Transplantation of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue (organoids) into the subretinal space of an eye with advanced RD brings retinal tissue sheets with thousands of healthy mutation-free photoreceptors and has a potential to treat most/all blinding diseases associated with photoreceptor degeneration with one approved protocol. Transplantation of fetal retinal tissue into the subretinal space of animal models and people with advanced RD has been developed successfully but cannot be used as a routine therapy due to ethical concerns and limited tissue supply. Large eye inherited retinal degeneration (IRD) animal models are valuable for developing vision restoration therapies utilizing advanced surgical approaches to transplant retinal cells/tissue into the subretinal space. The similarities in globe size, and photoreceptor distribution (e.g., presence of macula-like region area centralis) and availability of IRD models closely recapitulating human IRD would facilitate rapid translation of a promising therapy to the clinic. Presented here is a surgical technique of transplanting hPSC-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model allowing assessment of this promising approach in animal models.

Presented here is a surgical technique for transplanting human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model.

Trapianto sottoretinico di tessuto retinico derivato da cellule staminali embrionali umane in un modello animale felino di grandi dimensioni

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

Generazione di neuroni umani e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti per la modellazione delle interazioni neurone-oligodendrociti

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

Cellule simili alla microglia umana: differenziazione da cellule staminali pluripotenti indotte e saggio di fagocitosi di cellule vive in vitro utilizzando sinaptosomi umani

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...