This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.

1. Generazione di linee cellulari stabili che esprimono la proteina di interesse <ol><li> Preparare i media con l&#39;aggiunta di FCS inattivato al calore e 1% penicillina / streptomicina per commercialmente disponibile Dulbecco&#39;s Modificato (DMEM) supplementato con Glutamax-I, piruvato, e 4,5 g / l D-glucosio. </li><li> Coltivare cellule HEK293 in mezzi a 37 ° C in 5% CO 2. Sub-coltivare cellule ogni tre giorni. Rimuovere la carta e sospendere nuovamente le cellule in 15 ml di mezzi freschi. Pipettare 1 ml in un nuovo 75 centimetri a 2 celle pallone di coltura e aggiungere 14 ml media. </li><li> Analizzare il numero di cella utilizzando un emocitometro. </li><li> Seed HEK293 cellule in un 6-pozzetti ad una densità di 2 x 10 5 cellule per pozzetto e incubare per 24 ore. </li><li> Per la trasfezione utilizzare il protocollo fornito dal produttore del reagente di trasfezione. Trasfezione cellule con pEGFP-C2 o pEGFP-C2-CAEB utilizzando il reagente di trasfezione. Prima dell&#39;uso, scaldare la REAG trasfezioneent e il supporto richiesto per RT. Utilizzare un rapporto 3: 1 di reagente di trasfezione di DNA. <ol><li> Nel dettaglio, pipetta 1,5 ml di reagente di trasfezione direttamente in 50 ml di medio DMEM privo di siero. Per la formazione del complesso, pipettare 0,5 mg di DNA codifica GFP o GFP-Caeb alla miscela reagente contenente trasfezione e incubare per 15 minuti a RT. </li><li> Trasfettare cellule aggiungendo alla miscela di reazione in maniera goccia a goccia e incubare a 37 ° C in 5% CO 2 per 24 ore. </li></ol></li><li> Aggiungere 1 mg / ml geneticina per la selezione di cloni GFP-positive a 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Dopo 6 giorni, isolare le cellule singole mediante citofluorimetria classificare in una piastra a 96 pozzetti ospitare medie e HEK293 supernatante in un rapporto 1: 1. Generare HEK293 supernatante da coltura cellule confluenti HEK293 che sono stati centrifugati per 15 min a 4966 x g. </li><li> Il giorno seguente, sostituire terreno di coltura con terreno contenente 1.50; mg / ml geneticina. Modificare i media una volta alla settimana. Se le cellule formano un monostrato confluente, trasferirli ad una piastra da 24 pozzetti. Sub-coltivare cellule due volte alla settimana in un rapporto di 1: 5 in mezzi contenenti 1,5 mg / ml geneticina. Infine, analizzare la percentuale di cellule GFP-positive mediante analisi immunoblot e citometria a flusso. </li></ol> 2. Analisi di linee cellulari stabili di Analisi Immunoblot <ol><li> Rimuovere il surnatante e lavare le cellule aderito una volta con caldo PBS. Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone campione 2x Laemmli, calore per 5 min a 95 ° C e conservare a -20 ° C. </li><li> Caricare circa 4 x 10 4 cellule per campione su un gel SDS-PAGE 12%. Inoltre, carico 6 ml di una scala commerciale proteine ​​come marcatore di peso molecolare. Eseguire gel in un sistema di elettroforesi in gel con una tensione costante di 180 V per 45-60 min con 1x Laemmli tampone di corsa. </li><li> Proteine ​​macchia su membrane PVDF (dimensione dei pori di 0.45 micron) ad una tensione costante di 16 V per 60 minuti utilizzando un Trans-Blot SD Semi-Dry Cell Transfer. </li><li> Membrane blocchi in 10 ml di latte secco non grasso 5% in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) per 1 ora a RT. </li><li> Diluire 4 ml di anticorpo anti-GFP in 4 ml di MPT e incubare le membrane O / N a 4 ° C. </li><li> Eseguire tre fasi di lavaggio 10 min con 10 ml di PBS / 0.05% Tween 20. </li><li> Incubare membrane con 0,8 ml di anticorpi secondari perossidasi coniugata in 4 ml di MPT. </li><li> Dopo 1 ora di incubazione a RT, lavare membrane tre volte con PBS / 0,05% Tween 20 (come descritto in 2.6) e rilevare l&#39;attività di perossidasi di rafano con un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Applicare equipaggiamento standard per lo sviluppo di pellicole di visualizzare bande proteiche. </li></ol> 3. Analizzare le cellule utilizzando un citometro di flusso. <ol><li> Risospendere le cellule in PBS. Utilizzare cellule HEK293 come controllo negativo per regolare in avanti scAtter (FSC) e side scatter (SSC), in modo che le cellule sono in scala. Disegnare un cancello sulla cellule viventi escludendo doppietti cellulari, inerti e detriti cellulari. </li><li> Regolare il tubo fotomoltiplicatore (PMT) guadagno in modo che le cellule non colorate sono all&#39;estrema sinistra dell&#39;istogramma per il canale FL1 (488 nm laser argon). </li><li> Per analizzare l&#39;intensità di fluorescenza delle cellule HEK293-GFP e HEK293-GFP-CAEB aprire l&#39;istogramma del canale FL1 e acquisire 10.000 eventi sulla popolazione recintato. </li><li> Analizzare i dati utilizzando FACS commerciali software di analisi. </li></ol> 4. Transfection della linea cellulare stabile con il inducibile Expression System Vector <ol><li> Cellule HEK293 Seed esprimono stabilmente GFP o GFP-Caeb in un 12-pozzetti ad una densità di 1 x 10 5 cellule / pozzetto. </li><li> 19 hr post-semina, co-trasfezione delle cellule con regolatore plasmide e risposta plasmide codificante sia Bax o caspasi attivate 3. <ol><li> Co-trasfezione le cellule stabili HEK293con 100 ng di pWHE125-P regolatore plasmide (Figura 2) e 100 ng del plasmide risposta pWHE655-hBax o pWHE655-revCasp3 (Figura 3) e 0,4 ml di polyethylenimine. </li><li> Preparare il DNA e polyethylenimine reagente trasfezione ciascuno in 75 ml di Opti-MEM e incubare per esattamente 5 minuti a temperatura ambiente. Per la formazione del complesso, incubare entrambi miscele insieme per 15 minuti a RT. </li></ol></li><li> Aggiungere la soluzione polyethylenimine / DNA goccia a goccia per le cellule e incubare a 37 ° C in 5% CO 2. </li></ol> 5. induzione di apoptosi <ol><li> 5 ore dopo la trasfezione, inducono l&#39;espressione delle proteine ​​pro-apoptotiche mediante aggiunta di 1 ug / ml di doxiciclina al terreno di coltura. Incubare le cellule per 18 ore a 37 ° C in 5% CO 2. </li></ol> 6. Analisi della Cell Host Apoptosis da Analysis Immunoblot <ol><li> Ispezionare le cellule prima di harvesting sotto il microscopio ottico per controllare per l&#39;induzione della morte cellulare. Le cellule apoptotiche sono rilevabili dalla presenza di corpi apoptotici circondano la morte cellulare. </li><li> Rimuovere il surnatante e lavare le cellule aderito una volta con caldo PBS. Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone campione 2x Laemmli, calore per 5 min a 95 ° C e conservare a -20 ° C. </li><li> Caricare circa 4 x 10 4 cellule per campione su un gel SDS-PAGE 12%. Inoltre, carico 6 ml di una scala commerciale proteine ​​come marcatore di peso molecolare. Eseguire gel in un sistema di elettroforesi in gel con una tensione costante di 180 V per 45-60 min con 1x Laemmli tampone di corsa. </li><li> Proteine ​​macchia su membrane PVDF (dimensione dei pori di 0,45 micron) ad una tensione costante di 16 V per 60 minuti con un Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cellulare. </li><li> Membrane blocchi in 10 ml di latte secco non grasso 5% in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) per 1 ora a RT. </li><li> Diluire 4 μl di anticorpo anti-spaccati poli ADP-ribosio polimerasi (PARP) in 4 ml di MPT e incubare O / N a 4 ° C. </li><li> Eseguire tre fasi di lavaggio 10 min con 10 ml di PBS / 0.05% Tween 20. </li><li> Incubare membrane con 0,8 microlitri rafano perossidasi-coniugato anticorpo secondario diluito in 4 ml MPT. </li><li> Dopo 1 ora di incubazione a RT, lavare membrane tre volte con PBS / 0,05% Tween 20 (come descritto in 6.7) e rilevare l&#39;attività di perossidasi di rafano con un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Applicare equipaggiamento standard per lo sviluppo di pellicole di visualizzare bande proteiche. </li><li> Rimuovere gli anticorpi legati da 30 minuti di incubazione a RT con 7 ml Western Blot Stripping Buffer. </li><li> Dopo tre lavaggi con PBS / Tween 20 0,05% (come descritto in 6.7), sondare le membrane con 4 ml di anticorpo anti-actina in 4 ml di MPT O / N a 4 ° C. </li><li> Dopo tre lavaggi con MPT (come descritto in 6.7), incubare le membrane con 0,8 ml di hoanticorpi secondari rseradish perossidasi coniugato diluiti in 4 ml di MPT. </li><li> Dopo 1 ora di incubazione a RT, lavare membrane tre volte con PBS / 0,05% Tween 20 (come descritto in 6.7 e rilevare l&#39;attività di perossidasi di rafano con un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Applicare attrezzature standard per lo sviluppo della pellicola di visualizzare bande proteiche. Nota: Tutte le incubazioni sono state eseguite su un agitatore per il tempo indicato e la temperatura. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Molti batteri patogeni porto sistemi di secrezione di secernere o traslocare proteine ​​effettrici batteriche nella cellula ospite. Queste proteine ​​effettrici hanno la capacità di modulare i processi e percorsi nella cellula ospite, permettendo ai batteri di sopravvivere e replicare quanto di rispettiva nicchia intracellulare. Comprendere le attività biochimiche e dei meccanismi molecolari delle proteine ​​effettrici contribuirà ad una migliore comprensione di patogenicità e può aiutare a sviluppare n...

La virulenza di molti batteri patogeni Gram-negativi dipende sistemi di secrezione specializzati di dirottare cellule ospiti eucariotiche. I batteri usano questi sistemi di secrezione di iniettare proteine ​​di virulenza batterica (effettori) nella cellula ospite per modulare una varietà di attività cellulari e biochimici. Lo studio delle proteine ​​effettrici ha fornito non solo straordinario di approfondire alcuni temi fondamentali della ospitanti / patogeno, ma anche nella biologia di base delle cellule eucariotiche 1. Modulazione dell&#39;apoptosi cellula ospite ha dimostrato di essere un meccanismo di virulenza importante per molti patogeni intracellulari, e un certo numero di proteine ​​effettrici modulazione dell&#39;apoptosi sono stati identificati 2-9. Tuttavia, i loro precisi meccanismi molecolari dell&#39;attività rimangono sfuggente in molti casi. L&#39;apoptosi, una forma di morte cellulare programmata, svolge un ruolo importante nella risposta immunitaria all&#39;infezione 10. Due vie principali che portano alla apoptosi averestati individuati: mira i mitocondri (apoptosi intrinseca) o trasduzione diretta del segnale tramite i recettori di morte cellulare a livello della membrana plasmatica (apoptosi estrinseca). Il percorso di morte cellulare intrinseca o mitocondri-mediata è innescato da segnali intracellulari e prevede l&#39;attivazione di Bax e Bak, due membri pro-apoptotici della famiglia di Bcl-2. Questa famiglia è composta da proteine ​​regolatore pro- ed anti-apoptotici che controllano la morte cellulare 11-14. Attivazione di apoptosi porta a oligomerizzazione di Bax e Bak seguiti da successiva permeabilizzazione della membrana esterna mitocondriale, con conseguente rilascio del citocromo c nel citoplasma. Rilascio del citocromo C avvia attivazione delle caspasi effettrici 3 e 7, attraverso l&#39;attivazione della caspasi 9 nella apoptosoma 15. Questo porta alla proteolisi di substrati selezionate che, tra l&#39;altro, si traduce nella esposizione della fosfatidilserina sulla superficie cellulare 16 e libera un DNasi dedicato che frammenta chromatin 17,18. Al fine di determinare se all&#39;interno della cascata apoptotica una proteina effettore individuo interferisce, un sistema di espressione inducibile è stato impiegato 19. I sistemi di regolamentazione per l&#39;espressione condizionale di transgeni sono stati uno strumento prezioso nell&#39;analisi funzione di una proteina all&#39;interno della cellula o la sua importanza per il tessuto, organo e organismo sviluppo, così come durante l&#39;iniziazione, progressione e manutenzione della malattia 20-23. Tipicamente, i sistemi di controllo inducibili, come il sistema Tet 24 impiegato qui, formano una unità di trascrizione artificiale (vedi Figura 1). Un componente è un fattore di trascrizione artificialmente ingegnerizzato chiamato tTA (tetraciclina-dipendente trascrizione attivatore), formata dalla fusione della trascrizione repressore batterico TetR 25 ad un dominio proteine ​​di mammiferi che media l&#39;attivazione trascrizionale o silenziamento 24,26. Il secondo componente è un ibridopromoter, chiamato TRE (elemento tetraciclina-sensibile), costituito da un promotore minimo eucariotico, contenente almeno un TATA-box e un sito inizio della trascrizione, unita a più ripetizioni del sito di legame al DNA cognate per TetR, teto 24,25. Il terzo componente è il ligando naturale TetR, tetraciclina o uno dei suoi derivati, come anhydrotetracycline o doxiciclina 25. Su ligando aggiunta al mezzo di coltura, TetR perde la sua affinità per této e dissocia dal TRE. Come risultato, la trascrizione del gene bersaglio è abolito. Espressione del transgene può, pertanto, essere strettamente controllata in maniera tempo e dose-dipendente sia in coltura cellulare e in animali 20,23,24. Con tTA, espressione del transgene verifica costitutivamente, se non in presenza di tetraciclina. Questo può essere uno svantaggio nello studio delle proteine ​​citotossiche o oncogeniche perché tetraciclina deve prima essere rimosso dal sistema, prima transgene expression verifica e gli effetti della proteina bersaglio sulla cellula può essere monitorato. Questo può richiedere molto tempo e non è sempre completa, soprattutto negli animali transgenici 27. Per affrontare questa limitazione, un mutante TetR con una risposta inversa alla presenza di doxiciclina stato utilizzato per generare un nuovo fattore di trascrizione, rtTA (reverse tTA) 28. Si lega solo al TRE e, contemporaneamente, attiva la trascrizione in presenza di doxiciclina. Leakiness residua del sistema, cioè., L&#39;espressione del transgene in assenza del fattore di trascrizione TRE-bound, originario sia (i) da effetti di posizione in un sito di integrazione genomica, (ii) dal TRE sé 29, o (iii) da non -specific legame di tTA / rtTA 28, è stata affrontata introducendo un silenziatore trascrizionale aggiuntivo, denominato TTS (tetraciclina-dipendente silenziatore trascrizionale) 30 al sistema. Si forma una rete dual regolatore insieme rtTA (vedi Figura 1).In assenza di doxiciclina TTS si lega a TRE e attivamente spegne qualsiasi trascrizione rimanente. In presenza di doxiciclina, TTS dissocia da TRE e rtTA si lega contemporaneamente inducendo l&#39;espressione del gene bersaglio. Questo ulteriore livello di rigorosità è spesso necessario per esprimere proteine ​​citotossiche altamente attivi 31-34. L&#39;utilizzo di questo sistema a doppia regolazione strettamente controllata, la cascata apoptotica può essere iniziato con una fase definita che consente l&#39;analisi di se la data proteina effettrici può interferire con l&#39;induzione di apoptosi. Questo metodo non può essere utilizzato solo per studiare l&#39;attività anti-apoptotica di proteine ​​effettrici batteriche, ma anche per l&#39;espressione inducibile di proteine ​​pro-apoptotica o tossici, o per dissezione interferenze con altre vie di segnalazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>51985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365752001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP11.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polyscienes</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP&#160;</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>A6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cleaved PARP</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>611038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-actin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Plus Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46428</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying an inducible expression system to study interference of bacterial virulence factors with intracellular signaling

La tecnica qui presentata consente di analizzare in cui il passaggio a proteina bersaglio, o in alternativa una piccola molecola, interagisce con i componenti di un percorso di segnalazione. Il metodo si basa, da un lato, l&#39;espressione inducibile di una proteina specifica per avviare un evento di segnalazione ad un passo definito e predeterminato nella cascata di segnalazione selezionato. Espressione concomitante, invece, del gene di interesse quindi permette al ricercatore di valutare se l&#39;attività della proteina bersaglio espressa si trova a monte oa valle della manifestazione segnalazione avviato, in funzione della lettura del percorso di segnalazione che si ottiene. Qui, la cascata apoptotica è stata selezionata come una via di segnalazione definito per dimostrare la funzionalità del protocollo. I batteri patogeni, come Coxiella burnetii, traslocare proteine ​​effettrici che interferiscono con l&#39;induzione della morte della cellula ospite nella cellula ospite per garantire la sopravvivenza dei batteri nella cella e di promuovere la lorodiffusione nell&#39;organismo. Le C. proteine ​​effettrici burnetii CAEB inibisce efficacemente la morte della cellula ospite dopo l&#39;induzione di apoptosi con luce UV o con staurosporina. Per restringere in cui passo CAEB interferisce con la propagazione del segnale apoptotico, proteine ​​selezionate con ben caratterizzato l&#39;attività pro-apoptotica sono stati espressi transitoriamente in maniera doxiciclina inducibile. Se CAEB agisce a monte di queste proteine, l&#39;apoptosi procederà senza ostacoli. Se CAEB agisce a valle, la morte cellulare sarà inibito. Le proteine ​​di prova prescelti erano Bax, che agisce a livello dei mitocondri e caspasi 3, che è il principale proteasi esecutore. CAEB interferisce con la morte cellulare indotta da espressione Bax, ma non da caspasi 3 espressione. CAEB, pertanto, interagisce con la cascata apoptotica tra queste due proteine.

In primo luogo, sono stati stabiliti linee cellulari HEK293 esprimenti stabilmente la proteina di interesse (Caeb) come una proteina di fusione GFP-. Come controllo, sono stati generati anche linee cellulari HEK293 che esprimono stabilmente GFP. L&#39;espressione di GFP e GFP-CAEB è stata verificata mediante analisi immunoblot. L&#39;immunoblot rappresentante (figura 4A) dimostra espressione stabile e chiaramente rilevabile di GFP e GFP-CAEB. Tuttavia, questo test non è in grado di determinare se tutt...

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Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

L&#39;applicazione di un sistema di espressione inducibile per studiare interferenza di fattori batterici di virulenza con segnalazione intracellulare

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.1K Views.  Friedrich-Alexander-Universität. The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

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Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

L&#39;infezione di embrioni di zebrafish con batteri patogeni intracellulari

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and tomato. The susceptibility of M. sexta larvae to a variety of entomopathogenic bacterial species1-5, as well as the wealth of information available regarding the insect's immune system6-8, and the pending genome sequence9 make it a good model organism for use in studying host-microbe interactions during pathogenesis. In addition, M. sexta larvae are relatively large and easy to manipulate and maintain in the laboratory relative to other susceptible insect species. Their large size also facilitates efficient tissue/hemolymph extraction for analysis of the host response to infection.
The method presented here describes the direct injection of bacteria into the hemocoel (blood cavity) of M. sexta larvae. This approach can be used to analyze and compare the virulence characteristics of various bacterial species, strains, or mutants by simply monitoring the time to insect death after injection. This method was developed to study the pathogenicity of Xenorhabdus and Photorhabdus species, which typically associate with nematode vectors as a means to gain entry into the insect. Entomopathogenic nematodes typically infect larvae via natural digestive or respiratory openings, and release their symbiotic bacterial contents into the insect hemolymph (blood) shortly thereafter10. The injection method described here bypasses the need for a nematode vector, thus uncoupling the effects of bacteria and nematode on the insect. This method allows for accurate enumeration of infectious material (cells or protein) within the inoculum, which is not possible using other existing methods for analyzing entomopathogenesis, including nicking11 and oral toxicity assays12. Also, oral toxicity assays address the virulence of secreted toxins introduced into the digestive system of larvae, whereas the direct injection method addresses the virulence of whole-cell inocula.
The utility of the direct injection method as described here is to analyze bacterial pathogenesis by monitoring insect mortality. However, this method can easily be expanded for use in studying the effects of infection on the M. sexta immune system. The insect responds to infection via both humoral and cellular responses. The humoral response includes recognition of bacterial-associated patterns and subsequent production of various antimicrobial peptides7; the expression of genes encoding these peptides can be monitored subsequent to direct infection via RNA extraction and quantitative PCR13. The cellular response to infection involves nodulation, encapsulation, and phagocytosis of infectious agents by hemocytes6. To analyze these responses, injected insects can be dissected and visualized by microscopy13, 14.

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

The method described here utilizes direct injection of entomopathogenic bacteria into the hemocoel of Manduca sexta insect larvae. M. sexta is a commercially available and well-studied insect. Thus, this method represents a simple approach to analyzing host-bacterial interactions from the perspective of one or both partners.

Allevamento e iniezione di<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Le larve per valutare virulenza batterica

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Istituzione di un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema per studiare intracellulare Comportamento<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In umani THP-1 macrofagi

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

A seguito in tempo reale l&#39;impatto dei fattori di virulenza pneumococco in un acuto mouse Polmonite modello tramite batteri bioluminescenti

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

Monitoraggio parte dell&#39;Assemblea di una Secreted batterica Virulence Factor Uso site-specific reticolazione

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

Applicazione di nanoparticelle fluorescenti per studiare rimodellamento del sistema Endo-lisosomiale da batteri intracellulari

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

Identificazione di fattori di virulenza di Mycobacterium abscessus per replica intracellulare nei fagociti

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to visceral lesions. Currently, 12 million people are estimated to be infected with Leishmania worldwide and over 1 billion people live at the risk of infection. Leishmania amazonensis is endemic in Central and South America and usually leads to the cutaneous form of the disease, which can be directly visualized in an animal model. Therefore, L. amazonensis strains are good models for cutaneous leishmaniasis studies because they are also easily cultivated in vitro. C57BL/6 mice mimic the L. amazonensis-driven disease progression observed in humans and are considered one of the best mice strains model for cutaneous leishmaniasis. In the vertebrate host, these parasites inhabit macrophages despite the defense mechanisms of these cells. Several studies use in vitro macrophage infection assays to evaluate the parasite infectivity under different conditions. However, the in vitro approach is limited to an isolated cell system that disregards the organism&#39;s response. Here, we compile an in vivo murine infection method that provides a systemic physiological overview of the host-parasite interaction. The detailed protocol for the in vivo infection of C57BL/6 mice with L. amazonensis comprises parasite differentiation into infective amastigotes, mice footpad cutaneous inoculation, lesion development, and parasite load determination. We propose this well-established method as the most adequate method for physiological studies of the host immune and metabolic responses to cutaneous leishmaniasis.

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Here, we present a compiled protocol to evaluate the cutaneous infection of mice with Leishmania amazonensis. This is a reliable method for studying parasite virulence, allowing a systemic view of the vertebrate host response to the infection.

Infezione in vivo con Leishmania amazonensis per valutare la virulenza dei parassiti nei topi

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...