Gli autori desiderano ringraziare Cui Chao, Piano de Kort, Stoop Esther e Ralph Carvalho per le immagini in Figura 4, Ulrike Nehrdich e Davy de Witt per la cura dei pesci e altri membri di laboratorio per le discussioni utili. Questo lavoro è supportato dal Programma Mix intelligente del Ministero olandese degli Affari economici e del Ministero dell&#39;Istruzione, della Cultura e della Scienza, la Commissione europea settimo progetto quadro ZF-sanitaria (salute-F4-2010-242048), il Parlamento europeo Marie-Curie Initial Training Network FishForPharma (PITN-GA-2011-289.209), e dal NHMRC australiano (637.394). L&#39;australiano Istituto di Medicina Rigenerativa è supportato da sovvenzioni da parte del Governo dello Stato del Victoria e il governo australiano.

<ol>
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A., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+of+professional+phagocytes+in+vivo:+unlike+macrophages,+neutrophils+engulf+only+surface-associated+microbes.">Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes.</a> J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).</li><li>van Soest, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda.">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).</li><li>Adams, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+tolerance+in+replicating+mycobacteria+mediated+by+a+macrophage-induced+efflux+mechanism.">Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism.</a> Cell. 145, 39-53 (2011).</li><li>Ellett, F. L., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+quantification+of+fluorescent+leukocyte+numbers+in+zebrafish+embryos.">Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos.</a> Methods in Enzymology. , (2011).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).</li><li>Mathias, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+inflammation+by+retrograde+chemotaxis+of+neutrophils+in+transgenic+zebrafish.">Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).</li><li>Gray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish.">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I metodi di infezione descritti in questo articolo sono spesso usati per studiare la funzione dei geni dell&#39;immunità innata di accoglienza o geni di virulenza batterica 1. Le micro-iniezione per via endovenosa metodi (protocolli 5 e 6.1) vengono utilizzati più spesso per tali studi. La vena caudale presso l&#39;isola di sangue posteriore è la posizione più conveniente per iniezione endovenosa di 1-giorno-vecchi embrioni. Come la vena caudale diventa più difficile da penetrare nelle fasi successive, si preferisce il dotto di Cuvier, come sito di iniezione per via endovenosa per gli embrioni a 2-3 dpf. In tutti i casi è fondamentale per iniettare gli embrioni con un numero consistenti di batteri, che dovrebbe essere controllato da inoculi placcatura ad iniezione per il conteggio cfu. I seguenti aspetti devono essere considerati per ottenere iniezioni riproducibili. In primo luogo, è essenziale disporre di alta qualità aghi di iniezione microcapillari vetro. Se la punta dell&#39;ago è troppo grande, l&#39;iniezione creerà un foro puntura abbastanza grande per sanguinamento si verifichi ei batteri iniettati fluirà fuori della circolazione sanguigna. In secondo luogo, i batteri devono essere iniettato direttamente nella circolazione sanguigna. Se la punta dell&#39;ago non si trova all&#39;interno della vena, o se si diffonde iniezione di fluidi in pratica l&#39;estensione sacco vitellino, l&#39;embrione deve essere scartato dall&#39;esperimento. In terzo luogo, utilizzando PVP40 come supporto per l&#39;iniezione di M. marinum aiuterà a prevenire i batteri di affondare l&#39;ago di vetro. PVP40 migliorare l&#39;omogeneità della sospensione, con conseguente inoculi più riproducibile per tutta la durata di iniezioni. PVP40 possono anche essere utilizzati per S. iniezioni typhimurium, ma qui è meno importante perché la dimensione più grande e fluorescenza dei batteri permette un controllo visivo l&#39;inoculo di iniezione durante gli esperimenti. Per praticare le iniezioni si consiglia l&#39;uso del colorante rosso fenolo (1% v / v) o di 1 micron sfere fluorescenti disponibili in diversi colori (Invitrogen). Una volta che la tecnica è padroneggiata, ci vogliono circa 30 minutes per iniettare 50-100 embrioni, incluso il tempo necessario per allineare le embrioni su piastre di agarosio e regolando il volume di iniezione batterica. Mentre iniezioni endovenose nel isola sangue (protocollo 5) o nel condotto di Cuvier (protocollo 6,1) sono più comunemente utilizzati, i percorsi alternativi di infezione descritti in questo articolo video sono dimostrati utili per studiare macrofagi e neutrofili chemiotassi (protocolli 6,2, 6,3 , e 6.4), per studiare la crescita di ceppi batterici attenuati (protocollo 6.5), e ad adeguare il modello di zebrafish infezione per applicazioni ad elevato throughput (protocollo 6.6) 4-8. Le descritte micro-iniezione metodi possono essere applicati anche per le iniezioni di virus 18, 19, spore fungine 14, 20 o protozoi parassiti (Maria Forlenza, comunicazione personale). Un accessorio utile per le procedure di iniezione descritte in questo articolo il video è una procedura descritta di recente per l&#39;iniezione sottocutanea di batteri in zebrembrioni afish 21. Questa procedura è stata applicata per studiare fagocitosi dei batteri da parte di neutrofili, che sono stati trovati per batteri efficiente fuo su superfici tessuto ma, a differenza di macrofagi, sono praticamente in grado di fagocitare i batteri dopo l&#39;iniezione nel sangue o in piene di liquido cavità del corpo. Per gli embrioni iniezioni sottocutanee sono posizionati simile a quello per le iniezioni muscolari di coda descritti in questo articolo video, ma l&#39;ago viene inserito sotto la pelle per iniettare i batteri nel corso di un somite. È importante considerare che il micro-iniezione è essenzialmente un percorso artificiale di infezione. Tuttavia, gli embrioni precoci sono altamente resistenti alla esposizione esterna agli agenti patogeni batterici. In realtà, saggi immersione, in cui gli embrioni sono immerse in una sospensione batterica, non sono riproducibili nelle nostre mani 22. Mentre alcuni embrioni possono essere infettati al momento immersione, abbiamo osservato una grande variazione nei tassi di mortalità e l&#39;espressoione di geni marcatori infiammatori tra embrioni individuali in tali dosaggi. Le micro-iniezione metodi descritti in questo articolo raggiungere infezioni riproducibili e sono particolarmente utili per studiare le interazioni delle cellule batteriche con ospiti immunitarie innate. Un approccio efficace per quantificare l&#39;infezione batterica in embrioni individuali è quello di analizzare le immagini fluorescenti di embrioni infetti con misura, software dedicato quantificazione pixel 17, 23. Questo approccio è stato dimostrato che correla bene con i risultati della conta cfu dopo placcatura di embrioni infetti. Allo stesso modo, variazioni relative al numero dei leucociti embrioni sono stati quantificati mediante analisi di immagini digitali in linee transgeniche leucociti fluorofori reporter; questo approccio sarebbe applicabile a quantificare la risposta leukopoietic ospite alle infezioni 24. La funzione di geni ospitanti immune innato può essere studiata in modo efficiente in vivo combinando i modelli di infezione descrittecon knockdown morfolino. Morpholinos sono oligonucleotidi antisenso che colpiscono RNA sintetici specifici e ridurre l&#39;espressione dei prodotti genici quando iniettate in embrioni allo stadio 1-cellule zebrafish come mostrato in articoli altre video in questa rivista 10, 25. Negli studi atterramento morpholino, è di grande importanza che tutti i gruppi di embrioni da confrontare sono in scena correttamente prima di iniezioni batteriche. Questo è particolarmente importante perché embrioni avere un sistema di sviluppo immunitario che diventa sempre più competente nel tempo. Ci sono diverse linee transgeniche giornalista attualmente disponibili per distinguere le principali sottoinsiemi innata del sistema immunitario, i macrofagi e neutrofili, in embrioni di zebrafish. Il mpx e promotori LYZ sono stati utilizzati per generare linee giornalista neutrofili 16, 26, 27, e la csf1r (FMS) e MPEG1 promotori sono stati utilizzati per produrre reporter macrofago 14, 28. Mentre CSF1r (FMS) è inoltre espresso in xanthophores, mpeg1 espressione è esclusivamente in macrofagi. Come mostrato in questo articolo video, MPEG1 recentemente messo a punto le linee del reporter sono molto utili per l&#39;imaging fagocitosi batterica da parte dei macrofagi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Fornitore </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Rosso fenolo </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 228210 </td></tr><tr><td> Difco Middlebrook 7H10 agar </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 262710 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook OADC Enrichment </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 211886 </td></tr><tr><td> Difco Middlebrook 7H9 </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 271310 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook ADC Enrichment </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 211887 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> Polivinilpirrolidone (PVP40) </td><td> Calbiochem, Merck KGaA </td><td> 529504 </td></tr><tr><td> N &lt;/ Em&gt;-Phenylthiourea (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td></tr><tr><td> Ethyl 3-amminobenzoato metansolfonato sale (Tricaine) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> Metil cellulosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> SeaPlaque agarosio (agarosio a basso punto di fusione) </td><td> Lonza Inc. </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 um, fluorescente rosso (580/605)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8821 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 micron, giallo-verde fluorescenti (505/515)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8823 </td></tr></tbody></table>

infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embrioni sono sempre più utilizzati come modello per studiare la funzione del sistema immunitario innato dei vertebrati in interazioni ospite-patogeno 1. I principali tipi di cellule del sistema immunitario, macrofagi e dei neutrofili, sviluppano durante i primi giorni di embriogenesi prima della maturazione dei linfociti che sono necessari per le risposte immunitarie adattative. La facilità di ottenere un gran numero di embrioni, la loro accessibilità a causa dello sviluppo esterno, la trasparenza ottica degli stadi embrionali e larvale, una vasta gamma di strumenti genetici, le vaste risorse mutanti e collezioni di linee giornalista transgenici, tutti a creare la versatilità del pesce zebra modello. Salmonella enterica sierotipo Typhimurium (S. typhimurium) e Mycobacterium marinum possono risiedere intracellulare nei macrofagi e sono spesso utilizzati per studiare le interazioni ospite-patogeno in embrioni di zebrafish. I processi di infezione di questi duepatogeni batterici sono interessanti per confrontare, perché S. typhimurium infezione è acuta e letale entro un giorno, mentre M. marinum infezione è cronica e può essere ripreso fino allo stadio larvale 2, 3. Il sito di micro-iniezione di batteri nell&#39;embrione (figura 1) determina se l&#39;infezione diventerà rapidamente sistemico o inizialmente rimane localizzata. Una infezione sistemica rapido può essere stabilita da micro-iniezione batteri direttamente nella circolazione sanguigna attraverso la vena caudale all&#39;isola sangue posteriore o attraverso il condotto di Cuvier, un canale di circolazione ampia sul sacco vitellino collega il cuore alla vascolarizzazione tronco. A 1 dpf, quando gli embrioni a questo stadio sono attivi i macrofagi phagocytically neutrofili, ma non hanno ancora maturato, iniettando nel sangue, l&#39;isola è preferito. Per le iniezioni a 2-3 dpf, anche quando gli embrioni hanno sviluppato funzionali (mieloperossidasi che produce) neutrofili, il dotto di Cuvier è preferito come tche al sito di iniezione. Per studiare la migrazione diretta di cellule mieloidi verso infezioni locali, i batteri possono essere iniettato nel muscolo coda, vescicola otica, o rombencefalo ventricolo 4-6. Inoltre, la notocorda, una struttura che sembra essere normalmente inaccessibile alle cellule mieloidi, è altamente suscettibile di infezione locale 7. Un&#39;alternativa utile per applicazioni ad elevato throughput è l&#39;iniezione di batteri nel tuorlo di embrioni entro le prime ore dopo la fecondazione 8. La combinazione di batteri fluorescenti e le linee di zebrafish transgenico con macrofagi fluorescenti o neutrofili crea le circostanze ideali per il multi-color imaging di interazioni ospite-patogeno. Questo articolo video descrivere i protocolli dettagliati per l&#39;infezione per via endovenosa e locale di embrioni di zebrafish con S. typhimurium o M. marinum batteri e per la successiva immagine di fluorescenza della interazione con le cellule del sistema immunitario.

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Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Embrioni di zebrafish trasparente si sono dimostrati padroni di casa modello utile per la visualizzazione e lo studio delle interazioni funzionali tra cellule immunitarie innate e batteri patogeni intracellulari, come ad esempio<em&gt; Salmonella typhimurium</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt;. Micro-iniezione di batteri e multi-colore di imaging fluorescenza sono tecniche essenziali interessate dall&#39;applicazione di modelli zebrafish infezione embrioni.

L&#39;infezione di embrioni di zebrafish con batteri patogeni intracellulari

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

infection-of-zebrafish-embryos-with-intracellular-bacterial-pathogens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

43.4K Views.  Leiden University. Embrioni di zebrafish trasparente si sono dimostrati padroni di casa modello utile per la visualizzazione e lo studio delle interazioni funzionali tra cellule immunitarie innate e batteri patogeni intracellulari, come ad esempio Salmonella typhimurium E Mycobacterium marinum. Micro-iniezione di batteri e multi-colore di imaging fluorescenza sono tecniche essenziali interessate dall'applicazione di modelli zebrafish infezione embrioni.