Questo protocollo è adatto per studiare la virulenza di Leishmania, perché fornisce una visione sistemica dell'ospite vertebrato all'infezione cutanea. Il vantaggio principale dell'adozione di questo protocollo è che consente ai ricercatori di valutare contemporaneamente la risposta infiammatoria dell'ospite e la replicazione dei parassiti. Questo metodo può essere utilizzato per caratterizzare diversi bersagli e trattamenti relativi alla virulenza, che potrebbero portare nuove intuizioni nel controllo della leishmaniosi cutanea.
Può anche essere applicato ad altri ceppi di topi e specie di Leishmania che causano la leishmaniosi cutanea. Questo test ha alcuni passaggi critici, come richiedere personale addestrato che si confortevole a lavorare con i topi e ha esperienza nell'esecuzione di iniezioni subplantarie per evitare l'esposizione accidentale a materiale infettivo. A dimostrare la procedura sarà il Dottor Ricardo Zampieri, tecnico del mio laboratorio.
Inizia coltivando promastigoti L.amazonensis in un matraccio di coltura cellulare quadrata di 25 centimetri, contenente 10 millilitri di pro-medium, per tre giorni a 25 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, pipettare cinque millilitri di coltura promastigote in fase di crescita logaritmica in un nuovo pallone. Aggiungere cinque millilitri di ama-medium al pallone e incubarlo a 34 gradi Celsius per tre o quattro giorni.
Dividi la cultura diluerla con un rapporto da uno a tre con ama-medium fresco in un nuovo pallone. Quindi incubarlo per altri tre o cinque giorni. Trasferire un'aliquota della sospensione axenica degli amastigoti diluita in PBS in una camera Neubauer e contare i parassiti non flagellati.
Quindi, diluire la sospensione in PBS in base alla dose di inoculo desiderata e al numero di inoculi previsti. Caricare una siringa tubercocina con un ago calibro 27 con la sospensione del parassita preparata. Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato con un dito del piede e inoculare 50 microlitri della sospensione nel tessuto subplantare sul piede posteriore sinistro.
Registrare la progressione della lesione una volta alla settimana, misurando lo spessore dei pedvi infetti e non infetti utilizzando una pinza, e calcolare la differenza di spessore tra i due footpad per valutare la progressione della lesione. Aggiungere un millilitro di pro-medium in un tubo di smerigliatrice di tessuto di vetro per lesione e pesare il tubo. Spruzzare il 70% di etanolo sul pedane per la disinfezione e asportare il piede dell'animale sul tallone per estrarre il pedane infetto.
Assicurarsi che le forbici e le forcep siano sterilizzate mantenendole imbevute di 70% di etanolo. Posizionare il footpad in una piastra di Petri sterile e sezionarlo con le forcep e il bisturi. Raccogliere tutti i tessuti molli e scartare le ossa.
Trasferire i tessuti raccolti nel tubo di smerigliatrice del tessuto di vetro e pesare nuovamente il tubo per determinare il peso della lesione. Omogeneizzare il tessuto 10 volte con la smerigliatrice per una completa interruzione dei tessuti e lasciare che la miscela si insolli. Raccogli 20 microlitri del supernatante e caricalo nella prima colonna e nella prima corsia della piastra del pozzo 96, preparata secondo le indicazioni manoscritte.
Ripetere questo passaggio per le tre corsie successivi per quadruplicare i risultati per ogni animale. Omogeneizzare ogni pozzo 10 volte utilizzando una pipetta multicanale e trasferire 20 microlitri del campione diluito dalla prima alla seconda colonna. Continuare la diluizione seriale fino al raggiunto dell'ultima colonna e scartare gli ultimi 20 microlitri del campione diluito.
Sigillare il piatto con pellicola e incubarlo a 25 gradi Celsius per sette giorni in una camera umida. Dopo l'incubazione, analizzare la piastra al microscopio invertito per determinare l'ultimo pozzo contenente parassiti per ogni corsia. I parassiti protozoici di Leishmania esistono in due forme di sviluppo durante il loro ciclo vitale in ospiti invertebrati e vertebrati:promastigoti e amastigoti.
Le condizioni axeniche possono simulare diversi ambienti ospiti in vitro, mantenendo la morfologia e la vitalità dei parassiti. Le condizioni axeniche per gli amastigoti imitano l'ambiente acido e l'aumento della temperatura degli ospiti dei vertebrati. I promastigoti si distingueranno in amastigoti in queste condizioni.
Quando vengono trasferiti in pH neutro e incubati a 25 gradi Celsius, gli amastigoti axenici si trasformano di nuovo in promastigoti. La differenza di virulenza dei ceppi knockout di tipo selvaggio e Leishmania Iron Regulator 1 è stata osservata sui pedani del mouse infetti. LIR1 regola i livelli di ferro intracellulare in Leishmania, mediando l'esportazione di ferro e prevenendone l'accumulo intracellulare a livelli tossici.
Il saggio di infezione che include la differenza nella progressione del gonfiore e della lesione ha rivelato che LIR1 è essenziale per la virulenza in vivo di L.amazonensis. Il carico parassita è stato determinato eseguendo un saggio di diluizione limitante dalle lesioni infette. Le lesioni dei topi infetti knockout LIR1 contengono da 10 a sei volte meno parassiti di quelli dei topi infetti da Leishmania di tipo selvatico, rivelando che l'assenza di LIR1 impedisce la replicazione intracellulare degli amastigoti.
Una delle cose più importanti da ricordare quando si esegue questa procedura è usare colture di Leishmania che sono state passageate in vitro meno di dieci volte per evitare la perdita di virulenza parassitaria. Oltre a questa procedura, è possibile utilizzare saggi di infezione in vitro. Tuttavia, questo è un metodo limitato, perché non fornisce una panoramica fisiologica sistemica dell'interazione ospite-parassita.
Questo metodo in vivo è l'approccio migliore per valutare le risposte sistemiche per la leishmaniosi cutanea, come quantificare i biomarcatori sieri nei tessuti ospiti recuperati per ulteriori studi immunologici.
