Lo screening della biblioteca mutante e gli studi trascritomici degli agenti patogeni intracellulari possono aiutare a rispondere a domande chiave sugli adattamenti genomici e normativi degli agenti patogeni di interesse che vengono utilizzati per sopravvivere all'interno dell'ospite. I principali vantaggi di queste tecniche sono che sono tecniche di indagine su larga scala e che forniscono una visione obiettiva dell'adattamento alla vita intracellulare. Le implicazioni di queste tecniche si estendono verso la terapia del Mycobacterium abscessus che si associa a questa malattia fornendo informazioni sui potenziali obiettivi per la terapia vaccinale.
Inizia coltivando l'ameba Acanthamoeba castellani, o Ac, in 30 millilitri di mezzo di glucosio di lievito peptone in flaconi di coltura tissutale di 75 centimetri quadrati a temperatura ambiente. Dopo un'ora utilizzare una pipetta da 25 millilitri per rimuovere il supernatante e lavare le cellule tre volte con 10 millilitri di tampone Ac senza carbonio o azoto per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, staccare l'ameba dal fondo del pallone con un singolo frullato vigoroso e regolare le cellule in un tubo Falcon, a cinque volte 10 alla concentrazione di cinque amebe per mil in tampone Ac fresco.
Seme cinque volte 10 alle quattro amebe per pozzo in un piatto di 96 po '. Posizionare il piatto a 32 gradi celsius per un'ora senza tremare, per consentire alle tropho-zoiti ameba galleggianti di aderire ai pozzi. Nel frattempo, riscaldare i batteri sul ghiaccio e aggiungere cinque microlitri dei batteri scongelati ad ogni pozzo alla fine dell'incubazione.
Dopo 1,5 ore a 32 gradi Celsius, scartare il supernatante invertendo la piastra su una pila di garza sterile in un vassoio metallico sterilizzato sotto una cappa dei fumi. Lavare ogni bene tre volte con 200 microlitri di mezzo ac fresco per pozzo. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare la co-coltura con 20 microlitri di mezzo fresco integrati con amikacina per pozzo, per eliminare eventuali micobatteri extracellulari rimanenti per due ore.
Seguito da tre lavaggi in mezzo ac fresco, come appena dimostrato. Quindi, aggiungere 200 microlitri di mezzo, integrati con amikacina fresca ad ogni pozzo, seguito dall'aggiunta di cinque volte 10 ai sette batteri Escherichia coli inattivati dal calore. Dopo 48 ore, lisciviare le cellule con 10 microlitri di dodecil solfato di sodio al 10% per pozzo, per 30 minuti a 32 gradi celsius, e stendere cinque microlitri del lisato sulle piastre Columbia Agar contenenti il 5% di sangue di pecora.
Diluire ulteriormente i lysati aggiungendo 25 microlitri di acqua sterile ad ogni goccia. Quando tutti i lisati sono stati placcati, sigillare le piastre con pellicola di paraffina di plastica e incubare le colture per tre o quattro giorni a 37 gradi celsius. Quando le colonie appaiono sulle placche, fotografa le colture e identifica i mutanti compromessi per la crescita intracellulare dai depositi con il minor numero di colonie batteriche.
Per l'estrazione di RNA di micobatteri intracellulari, far crescere per la prima volta m.ascesso in mezzo 7H9 integrato con glicerolo e glucosio alla fase medio-esponenziale in tubi da 50 millilitri a 120 giri/min. Alla fine della coltura, lavare i batteri due volte con 10 millilitri di tampone Ac per lavaggio e misurare l'O.D.600 per stimare la concentrazione di batteri. Quindi, aggiungere 8,5 per 10 agli otto micobatteri a 8,5 per 10 alle sei amebe in 10 millilitri di mezzo Ac fresco per un'incubazione di un'ora a 30 gradi Celsius e 80 RPM.
Alla fine dell'incubazione, raccoglie le cellule per centrifugazione e lava il pellet tre volte in 10 millilitri di tampone Ac fresco per lavaggio nelle stesse condizioni di centrifuga. Quindi sospendere nuovamente le cellule in 10 millilitri di tampone Ac fresco integrato con amikacina per eliminare eventuali batteri extracellulari e incubare le cellule per quattro ore a 30 gradi Celsius e 80 RPM, seguite da due lavaggi in tampone Ac fresco. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendere nuovamente le amebe infette in quattro millilitri di soluzione fredda tre, integrata con 280 microlitri di beta mercaptoetanolo per interrompere l'amebae sul ghiaccio per 10 minuti.
Al termine dell'incubazione, centrifugare il lisato cellulare per pellettare i batteri intracellulari rilasciati e sospendere di nuovo il pellet batterico in un millilitro di soluzione fredda tre. È importante rimuovere tutto il supernatante per evitare la contaminazione con ameba RNA o proteasi che potrebbero aver fatto i campioni. Raccogliere i batteri rilasciati con una seconda centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di tampone di estrazione.
Quindi incubare per 24 ore a -80 gradi celsius. Trasferire la soluzione micobatterica in due tubi a vite millilitro contenenti perline di zirconio fino al segno di gradazione di 500 microlitri e conservare i tubi per altre 24 ore a -80 gradi celsius per facilitare l'attivazione dell'RNA syn e la dissoluzione cellulare. Il giorno dell'analisi, scongelare i campioni sul ghiaccio e liscire le cellule con due cicli di omogeneizzazione a 6000 giri/min per 25 secondi, seguiti da un'omogeneizzazione rotonda a 6000 giri/min per 20 secondi.
Tra ogni ciclo di omogeneizzazione, raffreddare i campioni sul ghiaccio per un minuto per evitare la degradazione dell'RNA. Dopo il terzo ciclo di omogeneizzazione, raffreddare i campioni sul ghiaccio per 20 minuti e aggiungere 200 microlitri di cloroformio diluito in alcol isoamile a ciascun tubo. Vortice per un minuto, quindi centrifugare i campioni e aggiungere 0,8 millilitri di isopropanolo freddo alla fase acquosa per un'incubazione da due a tre ore a -20 gradi celsius.
Al termine dell'incubazione, centrifugare nuovamente i campioni e lavare i pellet in 500 microlitri di etanolo freddo al 70% senza miscelazione. Quindi rimuovere immediatamente l'etanolo per centrifugazione. Aspirare il supernatante per l'essiccazione del pellet in un concentratore centrifugo e sospendere di nuovo i pellet in 100 microlitri di acqua priva di DNA/RNA.
L'estrazione di MRNA micobatterica come dimostrato, consente la valutazione delle famiglie geniche indotte e represse raggruppando i geni in base al loro ruolo nel rispondere a un ambiente limitato nella sua fonte di nutrienti e minerali, o a un ambiente ipossico o acido. Nella resistenza allo stress ossidativo e nitrosativo, o nell'espressione di fattori di virulenza in risposta all'ameba ambientale. Durante il tentativo di tali procedure, è importante ricordare di eseguire la coltura e l'isolamento dell'RNA dei campioni controllati e infetti allo stesso tempo per evitare effetti batch.
Seguendo questa procedura, altri metodi come il sequenziamento duale dell'RNA possono essere preformati per rispondere ad altre domande sulle interazioni patogene ospiti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia verso la virulenza dei micobatteri nel modello ospite dell'ameba. Non dimenticare che lavorare con le amebe potrebbe essere estremamente pericoloso, poiché le amebe potrebbero trasformarsi in cisti se non segui i passaggi descritti nella procedura.
