The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement&#160;n&#176; 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.

Cellule ASM primarie provenienti da individui non-asmatici sono stati isolati da biopsie bronchiali presso l&#39;Ospedale Glenfield (Leicester, UK), come descritto in precedenza. La ricerca è stato approvato dal Comitato Etico Leicestershire ei pazienti hanno dato il loro scritto, consenso informato. 1. Electrospinning PET Ponteggi (Figura 2) <ol><li> Preparare una soluzione (10 ml) di grado bevanda bottiglia in PET in 1: 1 diclorometano (DCMro) - soluzione di acido trifluoroacetico (TFA). Le concentrazioni di PET 8%, 30% e 10% peso / volume (peso / volume) sono richiesti per nanofibre, microfibra e allineati rispettivamente ponteggi e poi mescolare la soluzione O / N a temperatura ambiente per il PET a sciogliere. </li><li> Trasferire la soluzione in PET in una siringa e attaccare un 23-G (per nanofibre) o di un 18-G (per microfibra e allineato) ago alla siringa e inserire la siringa in una pompa a siringa motorizzata. Assicurarsi che la punta dell&#39;ago viene ruotato verso il basso. </li><li> Posizionare la madistanza dalla punta dell&#39;ago ndrel 15 cm, assicurando che l&#39;ago è puntato al centro del tamburo. </li><li> Fissare la fornitura di energia elettrica per la punta dell&#39;ago con pinze e mettere a terra il mandrino (tramite presa banana) a terra. Inserire l&#39;alimentazione del mandrino e la velocità impostata su 60 giri (pari a circa 13,2 m · min -1) per nanofibre e microfibra ponteggi. Impostare la velocità di 2.000 giri al minuto (pari a circa 440 m · min -1) ponteggi per allineate. </li><li> Impostare la pompa a siringa ad una portata di 0,5 ml · h -1 per nanofibre ponteggi casuali e allineate o 2.0 ml · h -1 per ponteggi in microfibra. Lasciare che la pompa di funzionare fino a quando la soluzione è estrusa dalla punta dell&#39;ago per rimuovere l&#39;aria nel ago. Poi fermare la pompa. </li><li> Nella pompa a siringa, impostare il volume totale di soluzione da espellere a 2 ml e avviare la pompa. </li><li> Set tensione a 14 kV, e accendere il supp poterely. </li><li> Electrospin fino a 2 ml di soluzione è stato elettrofilate (4 ore per nanofibre e ponteggi allineati, 1 ora per ponteggi microfibra). </li><li> Tagliare il ponteggio con una lama lungo la larghezza del mandrino. Questo produce un foglio 2D dell&#39;impalcatura la dimensione della superficie del mandrino (in questo caso, un foglio rettangolare di 22 centimetri x 11 cm), che può essere attentamente staccata mandrino). Conservare il patibolo in un foglio di alluminio per ridurre la carica elettrostatica). Nota: impalcature bifasica sono prodotte da sequenziale elettrospinning un&#39;impalcatura nanofibre direttamente su un ponteggio in microfibra. </li></ol> 2. Sterilizzazione dei ponteggi preliminari per l&#39;utilizzo in coltura cellulare <ol><li> Dal foglio patibolo, punch out dischi di ponteggi bifasica o allineati con una penna biopsia 0,8 millimetri di diametro e attenersi a guarnizione inclusa, con acquario colla non tossici. </li><li> Sterilizzare scaffold mediante irradiazione ultravioletta per 30 min su ciascun lato dei ponteggi prima di ammollo in 20% Vol / vol soluzione antibiotica / antimicotico (2x10 5 unità ml -1 penicillina G, 2.000 mg ml -1 solfato di streptomicina e 500 mcg ml -1 amfotericina B) O / N a 4 ° C. </li><li> Lavare ponteggi con PBS 3 volte e quindi memorizzare ponteggi in piastre e TCP in PBS a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 3. cellulari Costituenti cultura dei media <ol><li> Cellule epiteliali Cultura CALU3 nei media DMEM-F12 integrato con siero di 10% vol / vol fetale bovino (FCS), soluzione 2 Nm L-glutammina, 1% vol / vol antibiotico / antimicotico soluzione (10.000 unità ml -1 di penicillina G, 100 mg ml -1 solfato di streptomicina e 25 mcg ml -1 amfotericina B). </li><li> Cultura MRC5 fibroblasti e cellule ASM nei media DMEM supplementato con siero di 10% vol / vol fetale bovino (FCS), soluzione 2 Nm L-glutammina, 1% vol / vol antibiotico / antimicotico soluzione (10.000 unità ml -1 di penicillina G, 100 mg ml -1 solfato di streptomicina e 25 mcg ml -1 amfotericina B). </li><li> Cultura cellule epiteliali-fibroblasti-ASM co-culture in DMEM-F12 70:30: miscela dei media DMEM. </li></ol> 4. Semina di fibroblasti e cellule epiteliali sul bifasica Scaffold <ol><li> In una piastra di coltura tissutale, immergere i ponteggi nei media DMEM-integrati e incubare a 37 ° C per 1 ora prima della semina delle cellule. </li><li> Rimuovere il supporto DMEM-integrati, posizionare la fase in microfibra di ponteggio in direzione apicale e seminare 1.5 x10 4 MRC5 cellule di fibroblasti in 30 ml di media DMEM-integrati. Agitare piastra su un agitatore orbitale per 2 ore, prima di lasciare in un incubatore a 37 ° C 5% di CO 2 in aria O / N. </li><li> Girare il ponteggio su cui la fase di nanofibre di impalcatura volti apicale, semi di 3,0 x10 4 CALU3 cellule epiteliali in 30 ml di media-F12 integrato DMEM sulla fase di nanofibre del patibolo e incubare for 2 ore a 37 ° C, 5% CO 2 in aria prima immergendo l&#39;impalcatura in 70:30 DMEM-F12: DMEM supplementato supporto O / N prima di trasferire al bioreattore. </li></ol> 5. Semina delle cellule ASM sul Allineati impalcatura <ol><li> In una piastra di coltura tissutale, immergere i ponteggi in mezzi DMEM supplementato e incubare per 1 ora a 37 ° C prima della semina 2,5 x10 4 cellule in 30 ml di DMEM-supporti integrati e incubazione per 2 ore (37 ° C, 5% CO 2 in aria). Immergere ponteggio in DMEM supplementato ritorno media per incubatore e lasciare O / N prima di impostare un tri-cultura nel bioreattore. </li></ol> 6. Costituzione il Tri-cultura utilizzando il sistema di bioreattore (Figura 7) <ol><li> Posizionare la guarnizione scaffold bifasico nella scanalatura entro una camera con la fase epiteliale rivolto verso l&#39;alto nella camera. </li><li> Posizionare il ponteggio allineato sotto il ponteggio bifasico (quindi è adiacente al microfiber fase del patibolo bifasica) e bloccare le due camere del bioreattore insieme. </li><li> Assemblare due circuiti di flusso perfusione collegati a due serbatoi medi (i media DMEM-F12-integrati nel serbatoio apicale, DMEM-F12 / media DMEM-integrati nel serbatoio basale) e supporti di pompaggio intorno ai due circuiti di circa 0,1 ml / min con una pompa peristaltica (40 ml supporto viene riciclato attraverso ogni circuito). Casa tutte le parti del sistema in un incubatore a 37 ° C, 5% CO 2 in aria. </li><li> Dopo una settimana, rimuovere il supporto dalla camera apicale, e coltivare le cellule epiteliali del ALI per un&#39;altra settimana prima dell&#39;analisi. </li></ol>

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The Authors have nothing to disclose.

La capacità di electrospin fibre polimeriche con proprietà strutturali paragonabili a ECM naturale è portato a numerosi polimeri naturali o sintetici, o miscugli di polimeri essendo elettrofilate ricreare questi ambienti,. La manipolazione dei parametri di processo (tra cui la scelta del polimero, concentrazione del polimero, solventi, la distanza punta dell&#39;ago e temperatura) tutti possiamo caratteristiche influenza impalcature; tuttavia alcuni parametri possono avere un impatto maggiore sulle proprietà impalcatura di altri 25,. Quando si modifica diametro della fibra PET, abbiamo trovato i parametri chiave per la concentrazione del polimero utilizzato, la velocità alla quale la soluzione polimerica era elettrofilate, e il diametro dell&#39;ago. Quando electrospinning fibre allineate i parametri chiave sono il metodo di raccolta utilizzato (un mandrino rotante), e la velocità con cui ruota il mandrino. Attraverso la riduzione della velocità del mandrino a 60 giri al minuto, abbiamo trovato le impalcature allineate casualmente prodotte hanno mostrato maggiore uni ponteggioformità rispetto ad electrospinning su un piatto collettore piano. Le caratteristiche dei tessuti delle vie aeree decellularized sono stati analizzati a fornire indicazioni per le varie topografie scaffold sviluppati per la cultura di ogni vie aeree tipo cellulare. Nanofibre elettrofilate sono un&#39;impalcatura attraente per replicare strutture membrana basale a causa della piccola dimensione dei pori ma elevata porosità complessiva che permette di aumentare la diffusione metabolita pur limitando il movimento cellulare. 9 ottimizzando i parametri electrospinning, un intervallo di concentrazioni PET e portate sono stati testati. Le fibre più sottili sono stati ottenuti usando una soluzione peso / volume PET 6%, utilizzato in precedenza da altri gruppi. Tuttavia, gli alti livelli di bordatura, e una mancanza di uniformità erano problemi costanti. I primi tentativi per rimuovere la bordatura inclusa l&#39;aggiunta di un tensioattivo cationico, cetiltrimetilammonio bromuro (CTAB), alla soluzione di abbassare la tensione superficiale, e testando varie fontidi PET. L&#39;aggiunta del tensioattivo ridotto la quantità di bordatura, ma non completamente. Dopo aver provato un certo numero di fonti commerciali di pellet di PET, bevanda commestibile bottiglia in PET è stato utilizzato, tagliando bottiglie per bevande e sciogliere questi nella DCM: solvente TFA. Usando questo come sorgente PET ha comportato un aumento in fibra uniformità e una riduzione in fibra bordare. Aumentando la concentrazione della soluzione leggermente a 8% in peso / vol e riducendo il diametro dell&#39;ago (18G a 23G) abbiamo costantemente prodotto nanofibre difetto liberi con un diametro di fibra di circa 250 nm. Ponteggi nanofibre elettrofilate possono essere altamente elettrostatiche al momento del ritiro dal mandrino facendo movimentazione manuale degli scaffold difficili. Questa è stata migliorata memorizzando i ponteggi in un foglio di alluminio dopo la filatura e immersi nel 70% IMS prima dell&#39;uso. Questo sembrava contribuire a dissipare la carica elettrostatica residua sul patibolo dal processo electrospinning. Per fornire topographies simile ai singoli microambienti incontrate dalle tre principali tipi di cellule delle vie aeree all&#39;interno della parete delle vie aeree, un protocollo di base elettrospinning è stato adattato per la produzione di tre ponteggi unici per questi tipi di cellule: da elettrospinning una soluzione bassa concentrazione PET lentamente, sono stati generati nanofibre allineate in modo casuale, su cui le cellule epiteliali sono state seminate (mimando l&#39;RBM). Con electrospinning una soluzione PET concentrazione superiore ad una velocità maggiore, sono stati generati microfibre allineate casualmente (producendo un&#39;impalcatura più poroso), in cui fibroblasti sono stati seminati (mimando l&#39;area sub-mucosa immediatamente sotto la RBM). Con electrospinning una soluzione a bassa concentrazione PET su una elevata velocità mandrino allineato nanofibre rotante sono stati prodotti, su cui le cellule muscolari lisce orientate nella direzione delle fibre, producendo fogli di cellule allineate. Diametri delle fibre ad incrementare il vantaggio di una maggiore dimensione dei pori, permettendo una maggiore penetratio cellularen in impalcature e così contribuire a creare un vero ambiente 3D,. Ponteggi microfibra sono stati impiegati per la coltura di fibroblasti in studio per garantire che le cellule risiedevano su più piani all&#39;interno del ponteggio. Aumentando la concentrazione di PET al 30% peso / volume, sono state prodotte fibre di PET con un diametro medio di 2,5 micron. Fibre di diametro maggiore (≈ 4 micron) sono stati prodotti utilizzando una soluzione di PET peso / volume del 35%, ma uniformità di spessore patibolo è stato perso, e una maggiore variabilità tra le singole fibre era evidente. I pori della patibolo microfibra sono stati oltre 7 volte superiore rispetto a quelli misurati in scaffold nanofibre (10,45 micron vs 1.43 micron, rispettivamente), ma semina ancora statica delle cellule forniti penetrazione cellulare limitato. Questa è stata migliorata mediante inseminazione dinamicamente le cellule utilizzando un miscelatore orbitale, un metodo dimostrato di essere efficace in precedenza. Impalcature nanofibre altamente allineati sono stati creati da elettrospinning 10%wt / vol soluzione PET sul mandrino rotante a 2.000 giri (≈ 440 m · min -1). La concentrazione di PET è stato aumentato da 8% per evitare una morfologia ondulata irregolare che fibre esposte a concentrazioni inferiori. Nonostante l&#39;aumento della concentrazione, allineando le fibre ridotto il diametro medio delle fibre (216 nm contro 255 nm, allineato rispetto casuale). L&#39;alta velocità del mandrino disegnare le fibre fuori prima che abbiano secca è probabile che a causare questo effetto. L&#39;allineamento delle fibre influenzato l&#39;allineamento delle cellule ASM, e ha anche altri effetti fisiologici sulle cellule ASM che sono stati caratterizzati altrove 21. Il principale limite di questo protocollo è l&#39;incapacità di cellule vive di immagine sulla / nella scaffold rendendo cella attaccamento o differenziazione iniziale per un periodo di tempo prolungato impossibile determinare senza sacrificare campioni. Questo significa che la maggior parte di ottimizzazione si verifica dopo il periodo di coltura, cioè fissareing campioni e poi misurare se la coltura cellulare ha avuto successo dopo non durante coltura cellulare. Osservando un cambiamento di colore di ponteggi incubate a alamarBlue (blu al rosa) indica le cellule sono presenti e vitali, ma non è l&#39;ideale. Elettrofilatura polimeri più trasparenti come la gelatina potrebbero aiutare a visualizzare le cellule sulle impalcature. La electrospinning di un ponteggio nanofibrous nel nostro modello ha permesso la replicazione del RBM vie aeree, analogamente composto da nanofibre densi in cui le cellule epiteliali risiedono. È stato precedentemente dimostrato che le cellule strutturali non possono migrare attraverso il nanofibre ponteggio 22, anche se le cellule immunitarie sono in grado di (dati non mostrati). Pur vantaggiosa per coltura di specifici tipi di cellule su una superficie 3D (quali cellule epiteliali ed endoteliali), tale prevenzione della migrazione cellulare strutturale attraverso nanofibre possono essere dannosi per la coltura di altri tipi di cellule. Come muscolatura liscia è in grado di migrare attraverso the allineato nanofibre impalcatura abbiamo assemblato la co-coltura tri-strato con il muscolo liscio e strati di fibroblasti di fronte all&#39;altro (opposizione al patibolo allineati che separa i due tipi di cellule). Mentre questo permette alle cellule di essere in stretta apposizione, questo studio non può concludere se un tipo cellulare (sia fibroblasto o muscolo liscio) avrebbe superato tutto lo strato per un periodo più prolungato coltura. Nonostante queste limitazioni, un modello tri-strato praticabile della parete bronchiale è stato sviluppato che fornisce una piattaforma alternativa per indagare le interazioni tra questi diversi tipi di cellule. Uno studio simile tri-strato è stato recentemente pubblicato in cui fibroblasti sono stati incorporati entro un collagene cilindrica I idrogel con muscolatura liscia seminati sulla superficie esterna e le cellule epiteliali all&#39;interno della superficie luminale 17. La stabilità meccanica degli scaffold elettrofilate sviluppati qui permetterebbe tubolare simile costruisce a formarsi, e rimane un resea correnterch scopo all&#39;interno del nostro gruppo. Mentre lo studio è concentrata sulla vie aeree, diversi organi all&#39;interno del corpo condividono questa unità strutturale mucosa base, e attraverso la modifica inquilini evidenziato in questo studio, piattaforme simili potrebbero essere sviluppati per tessuti contenenti un&#39;unità membrana basale compreso vasi sanguigni, la vescica e la cornea, in cui sono stati impiegati modelli basati multistrato collagene.

Il campo della medicina rigenerativa e dell&#39;ingegneria tissutale sta avanzando rapidamente, con innovazioni nella tracheale e rene rigenerazione due successi recenti di rilievo. I biomateriali sviluppati in ingegneria dei tessuti sono sempre più accessibili, con la possibilità di trasferire tali protocolli per laboratori meno specializzate. Un campo innescato beneficiare attraverso crescente utilizzo di biomateriali è la diagnosi in vitro. Studi in vitro sono una piattaforma importante per indagare vie di segnalazione intra-cellulari all&#39;interno singoli tipi di cellule, e hanno contribuito a delineare meccanismi alla base numerosi pathophysiologies malattia. Questi studi in genere si basano su un singolo tipo cellulare in coltura come un monostrato su coltura tissutale di plastica (TCP); un (2D) superficie rigida bidimensionale molto meno elastica e porosa rispetto ai tridimensionali cellule (3D) di ambiente sono esposti a meno di un tessuto o organo. I modelli animali sono stati tradizionalmente employed confermare effetti riscontrati in vitro anche tradurre al tessuto intero, e può anche essere utilizzato come piattaforme pre-clinici per investigare malattie umane. Tuttavia, le differenze tra le specie minano questo affidamento su modelli animali nella nostra comprensione delle malattie umane -. Ad esempio, molta comprensione dell&#39;asma malattia polmonare si basa su un modello di topo nonostante le differenze intrinseche tra la condizione umana e questo modello compreso poche prove di infiltrazione mastociti delle vie aeree fascio muscolare liscia, o la capacità di sviluppo della malattia spontanea all&#39;interno dell&#39;animale modellare 3,4. Ci sono anche considerazioni etiche riguardanti l&#39;uso di modelli animali, con lo standard &quot;3R&quot; di &quot;sostituzione, affinamento e riduzione&quot; in sperimentazione animale essere incoraggiati nel Regno Unito e in altri paesi. Una valida alternativa potrebbe essere la ricapitolazione di tessuti umani nella struttura creazione vitros per indagare la natura cooperativa tra i tipi di cellule umane adulte in una singola unità. Esistono Cells in strutture pluricellulari 3D all&#39;interno del tessuto, ciascuno all&#39;interno di un micro-ambiente unico. La coltura di cellule su TCP consente solo la cultura di monostrati cellulari, in grado di replicare questo ambiente, o fornire la capacità per la cultura multi-cellule. Biomateriali avanzamento offre l&#39;opportunità di sviluppare entrambe le piattaforme naturali e sintetici 3D per coltura cellulare. ECM decellularized può essere utilizzato per la coltura cellulare 3D quando recellularized con altri tipi di cellule, comprese le cellule staminali 1, tuttavia tali protocolli possono essere complessa e richiede tempo, con la disponibilità limitata di tessuto e in gran parte di origine non umana. Altri protocolli consentono un maggiore controllo sulle ambienti cellulari creati come nanoimprinting, ECM deposizione, tecnologie foglio cellulare o electrospinning. Electrospinning crea tappeti non tessuto 3D porosi di fibre con diametri da nanometro a micrometri, replicating dimensioni ECM naturali. Ponteggi elettrofilate sono sempre più utilizzati come piattaforme di coltura cellulare 3D -. La manipolazione dei parametri elettrofilatura permette il controllo intricato su caratteristiche patibolo come dimensione dei pori, diametro delle fibre, la topografia e l&#39;allineamento, e la chimica di superficie. Alterazioni di tali parametri hanno dimostrato di influenzare direttamente adesione e crescita cellulare, quando le cellule sono state coltivate in isolamento. Questi vantaggi sono state sfruttate nel presente studio per permettere la coltura di tipi di cellule come un unico costrutto tessuto 3D, utilizzando bronchiolo vie aeree come struttura tissutale modello 3D. La parete bronchiole consiste di tre regioni principali (Figura 1). La mucosa è dove le cellule epiteliali delle vie aeree siedono all&#39;interfaccia aria-liquido (ALI), fornendo una barriera importante per l&#39;ambiente esterno. Essi risiedono sulla membrana reticolare seminterrato (RBM), un ECM strettamente compatto composto principalmente di collagen IV, perlecans e laminine. Lo strato sub-mucosa è situato direttamente al di sotto della mucosa, una regione più porosa costituita da più tipi di cellule inclusi i fibroblasti, miofibroblasti e leucociti infiltranti in condizioni di malattia. Infine fasci muscolari lisce avvolgono le vie aeree in modo elicoidale e sono composti da fogli allineate di muscolatura liscia bronchiale (ASM). E &#39;stato contrattile relativo liscio del muscolo che controlla il tono delle vie aeree. L&#39;impiego di ponteggi elettrofilate all&#39;interno del sistema polmonare era fino a poco stato limitato a scopi rigenerativi; con un ricambio tracheale elettrofilate essere trapiantato con successo. Mentre il successo, tali trattamenti sono limitate in numero, e si concentrano sulla trachea a causa della semplice natura relativa della funzione del tessuto. Esistono esempi limitato di modelli vie aeree utilizzate per la diagnostica in vitro, e si concentrano principalmente su misure contrazione della muscolatura liscia,. Il non-tossico e nonn-degradabili polietilene polimero tereftalato (PET) è stata precedentemente elettrofilate, ed è stato impiegato in questo studio per garantire scaffold prodotti possono essere conservati per lunghi periodi senza degradare (permettendo loro di essere utilizzati &quot;off the shelf&quot;), e anche essere adatto per colture cellulari stabili per periodi di tempo prolungati. Studi precedenti del nostro gruppo hanno dimostrato che l&#39;impiego di tre varianti di un protocollo di base elettrospinning, tre singoli ponteggi elettrofilate PET possono essere prodotti per fornire topografie ottimali per la coltura epiteliale delle vie aeree, fibroblasti e cellule muscolari lisce in isolamento 21,22 e il coculture di vie respiratorie cellule epiteliali e fibroblasti 22. Diametro Fiber è stato trovato per influenzare notevolmente la funzionalità epiteliale 22, e l&#39;allineamento fibra ha permesso la generazione di fogli allineate di muscolatura liscia 21. Questi studi sono stati effettuati indipendentemente l&#39;uno dall&#39;altro, in condizioni statiche. Nel presente studio, questi differeponteggi nt, contenenti cellule umane completamente differenziate adulti sono stati messi in coltura per una settimana al ALI in un bioreattore disponibile in commercio come sezione 3D della parete bronchiale, fornendo un fisiologicamente rilevanti modello in vitro per indagare vie aeree risposte intercellulari. Mentre questo protocollo utilizza bronchiolo vie aeree come sistema modello, potrebbe essere adattato come una piattaforma per la coculture 3D di unità mucose da altri organi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET)</td>
			<td>Lucozade (GSK) bottles</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solvent for PET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Solvent for PET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Mandrel</td>
			<td>Built in house</td>
			<td></td>
			<td>Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td></td>
			<td>used in the electrospinning process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Culture medium for CALU3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Culture medium for HASM cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Culture medium for MRC5 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/ antimycotic solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital mixer (Orbital shake 503)</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump&#160;</td>
			<td>Watson Marlow</td>
			<td></td>
			<td>For providing media flow through bioreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3DKube</td>
			<td>Kiyatec</td>
			<td></td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adapting the electrospinning process to provide three unique environments for a tri-layered in vitro model of the airway wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Immagini al microscopio elettronico a scansione di tessuto delle vie aeree decellularized o immagini immunoistologici da biopsie delle vie individuate le caratteristiche desiderabili del ECM vie respiratorie abbiamo voluto introdurre nella elettrofilate topografie scaffold: matrice nativa RBM è costituito da fibre di circa 153 nm ± 30.6 nm (media ± SD n = 50 misurazioni ) di diametro (Figura 3A e 5A), mentre la matrice circostante il meccanismo è stato più poroso in natura (Figura 3C). Sezioni immunoistologiche attraverso fasci muscolari lisce mostrano ASM presenti come fogli allineati di cellule 21 (Figura 3E). Queste informazioni sono state usate per guidare le caratteristiche introdotte nei ponteggi elettrofilate. Un mandrino rotante è in grado di ruotare in modo stabile a velocità elevate (&gt; 2.000 giri / 440 m · min -1) per produrre scaffold con fibre allineate. Lenta rotazione mandrino (60 rpm 13,2 m · min -1) non ha influenzato l&#39;orientamento delle fibre, Ma prodotto scaffold di spessore più uniforme rispetto a quando electrospinning su un piatto statica. Modificando i parametri electrospinning (concentrazione PET e portata di soluzione), è stato possibile creare fibre ponteggi con diametri diversi micrometri o centinaia di nanometri (parametri electrospinning sono indicati nella Tabella 1). Fibre elettrofilate con diametri delle fibre equivalenti alle fibre naturali RBM (150 nm) sono state prodotte utilizzando una soluzione PET 6%, tuttavia a tali concentrazioni basse PET, bordatura delle fibre si è verificato (Figura 4A). Questo è stato eliminato aumentando la concentrazione della soluzione PET all&#39;8% che produceva nanofibre uniformi possedere un diametro medio di 255 nm ± 2,4 nm (media ± SEM) e la dimensione media dei pori di 1,43 micron ± 0,02 micron (Figure 4B, 5A e B). Per electrospin nanofibre è stato necessario ridurre la dimensione degli aghi da 18 G a 23 G, che consente velocità di flusso più lento whilst mantenere una velocità di flusso maggiore e riducendo ago blocco, un problema ricorrente con l&#39;ago più grande. Quando electrospinning microfibre, un aumento in soluzione PET&gt; 30% di piombo PET ad una mancanza di uniformità nel diametro della fibra (Figura 4F) oltre a più blocchi alla punta dell&#39;ago a causa della elevata viscosità della soluzione. Stuoie microfibra uniformi possiedono un diametro medio delle fibre di 2,50 micron ± 0,02 micron (media ± SEM) e la dimensione media dei pori di 10,45 micron ± 0.13 micron sono state prodotte quando electrospinning una soluzione PET peso / volume 30% ad un flusso di 2 ml / h -1 (Figure 4F, 5A e B). Electrospinning sequenziale del ponteggio nanofibre direttamente su un ponteggio microfibra (ancora attaccato al mandrino) ha creato un ponteggio bifasico (Figura 3D). I diametri medie in fibre erano 280 nm ± rispettivamente 20 nm e 2.30 micron ± 0,06 micron per le fasi nanofibre e microfibra,paragonabile alle dimensioni delle singole nanofibre e microfibra ponteggi. Inoltre, lo spessore dello scaffold bifasica era simile alla somma delle singole nanofibre e microfibra scaffold (Figura 5C). Attraverso aumentando la velocità del mandrino (2.000 giri / 440 m · min -1), sono stati prodotti altamente allineati nano o microfibra impalcature. La soluzione PET peso / volume dell&#39;8% non era ottimale per la produzione di nanofibre allineate e fibre prodotte in possesso di una morfologia ondulata (Figura 3F). Un aumento del 10% PET annullato questo effetto, ma ancora determinato un diametro della fibra ridotta (216 nm ± 2,2 nm (media ± SEM)) rispetto ai ponteggi nanofibre allineate in modo casuale. Allineamento delle fibre è stata calcolata determinando la deviazione dell&#39;angolo di ciascuna fibra dall&#39;angolo fibra medio. In ponteggi nanofibre allineate 79% di fibre sono state allineate (± 10 ° angolo di fibra medio) rispetto al 10,2% di fibre in allineate in modo casuale Scaff nanofibreolds (Figura 5D). Il nanofibre patibolo l&#39;8% è stato utilizzato per ricapitolare la RBM in cui le cellule epiteliali risiedono, ed è stato utilizzato per sostenere la coltura di cellule CALU3 (una epiteliale delle cellule-line delle vie aeree). Il peso / volume microfibra patibolo il 30%, essendo più poroso in natura è stato utilizzato per simulare la regione sub-mucosa, e fu colta con MRC5 cellule (fibroblasti una cella della riga delle vie aeree). Il 10% peso / volume nanofibre allineate ponteggio fornite riferimento topologica per garantire l&#39;allineamento delle cellule ASM quando coltivate sul patibolo. Tutti e tre i tipi di cellule hanno mostrato un aumento della redditività quando coltivate sulle impalcature individuali per un periodo di due settimane (figura 6A), e ha espresso delle cellule di tipo proteine ​​specifiche dopo il periodo di due settimane cultura (Figura 6B, 6C, e 6D). Un&#39;ulteriore caratterizzazione delle singole interazioni cellula-patibolo sono stati riportati altrove 21. La elettrofilatura sequenziale del patibolo nanofibresul patibolo in microfibra prodotto un ponteggio bifasico per la co-coltura delle cellule epiteliali CALU3 e cellule di fibroblasti MRC5 sulle fasi di nanofibre e microfibra, rispettivamente. La coltura delle due celle insieme in condizioni statiche stato segnalato altrove 22. Ulteriori lavori tentativo di aggiungere altri strati di cellule o di estendere gli orari di coltura bifasica oltre due settimane in condizioni statiche non ha avuto successo (dati non riportati). Per la cultura di un modello a tre livelli per un periodo prolungato, abbiamo usato un bioreattore a flusso di perfusione. Il CALU3 e MRC5 cellule sono state seminate su scaffold bifasico, e cellule ASM seminate su un ponteggio allineati, ed entrambi sono stati coltivati ​​separatamente per 2 giorni. I due scaffold sono stati poi acquistati insieme per formare un modello a tre strati della parete delle vie aeree nel bioreattore (Figura 7). Entrambe le camere sono stati perfusi con i media per 7 giorni prima della camera di epiteliale apicale aveva i suoi mezzi rimossi e le cellule epiteliali sono state coltivate inALI per altri 7 giorni. Ponteggi erano fissi e uno sezionati e macchiati, o ponteggi interi stati immunostained per i marcatori specifici delle cellule. Sezioni attraverso la cultura tri-strato mostrato nuclei cellulari distribuiti attraverso i tre strati della co-coltura (Figura 8B). Quando le cellule sono state immunostained per marcatori specifici delle cellule, cellule epiteliali popolate fase nanofibre apicale come cella strato confluenti e colorate positive alla citocheratina (Figura 8C), sulla fase microfibra, fibroblasti colorate positivamente per S100A4 (Figura 8D), e i allineate 10% di cellule patibolo ASM colorate positivo per SM22α (Figura 8E), che indica bene la sopravvivenza di ogni tipo cellulare all&#39;interno del modello 3D della parete delle vie aeree. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig1.jpg" /> Figura 1. Il bronchioli vie respiratorie. Biopsia bronchiale da un gravevie aeree asmatico mostrando l&#39;epitelio sulla membrana reticolare seminterrato (MLF), con la regione sottomucosa sottostante popolata con cellule mesenchimali, ed i fasci muscolari lisce circostanti popolati con le cellule muscolari lisce colorate per muscolo liscio alfa-actina (marrone). Bar Scala indica 200 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig2.jpg" /> Figura 2. Un schematica dell&#39;apparecchiatura elettrofilatura. Una siringa contenente la soluzione di polimero / solvente (con ago) è posto su una pompa a siringa fronte al mandrino. Un potenziale elettrico viene stabilito tra le fibre di aghi e mandrino causando di essere espulsi dalla punta dell&#39;ago e depositati sul mandrino rotante. Come la fibra passa attraverso l&#39;atmosfera,il solvente evapora causando deposizione di fibre polimeriche sul mandrino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig3.jpg" /> Figura 3. Confronto di ponteggi elettrofilate per nativo ECM vie respiratorie. Immagini al microscopio elettronico a scansione di membrana decellularized seminterrato (A), via aerea decellularized bronchiole sezione (C) e una sezione istologica di una via aerea fascio muscolare liscio (colorato con ematossilina eosina, scala bar 40 micron) (E) rispetto a nanofibre (B) bifasico (D) e allineate (F) impalcature PET. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere</a>una versione più grande di questa figura. Tabella 1. Parametri utilizzati per electrospinning microfibra, nanofibre e allineati ponteggi individualmente e per il patibolo bifasica. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig4.jpg" /> Figura 4. Alterazione concentrazioni PET incide caratteristiche della fibra. Immagini al microscopio elettronico a scansione di ponteggi elettrofilate filate dal 6%, 8%, 10% (AC), 25%, 30% e 35% (EG) (peso / volume) soluzioni PET . Anche mostrato sono ponteggi allineati prodotte dall&#39;8% (D) e il 30% soluzioni PET (H) peso / volume. DC ripreso a 5,000X ingrandimento, EH ripreso a 1,000X ingrandimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una più grande</a>versione di questa figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig5.jpg" /> Figura 5. Proprietà dei ponteggi PET elettrofilate. Curve (A) di distribuzione che mostra la distribuzione diametro delle fibre dalla membrana reticolare seminterrato matrice extracellulare (RBM ECM), allineate in modo casuale nano e micro-fibra ponteggi, e il patibolo nanofibre allineate. (B) Istogramma che mostra la distribuzione delle dimensioni dei pori relativa in nano e micro-fibra impalcature. (C) Spessore medio delle nanofibre, microfibra, impalcature bifasico e allineate (media ± deviazione standard, n = 6). (D) Istogramma grafico che mostra la deviazione dalla media orientamento delle fibre in ponteggi casuali o allineati nanofibre analisi fibra impalcatura è stata effettuata utilizzando il software ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig5large.jpg" target="_blank">P</a>leasing clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig6.jpg" /> Figura 6. La cultura dei singoli tipi di cellule sulle singole impalcature. (A) i risultati del test di vitalità cellulare alamarBlue per celle ASM su ponteggi allineate, le cellule CALU3 sui ponteggi nanofibre e MRC5 celle scaffolds microfibra (media ± SEM, n = 3- 20). Immagini al microscopio elettronico a scansione di nanofibre, in microfibra e ponteggi fibre allineate (rispettivamente B, C e D) e le immagini di immunofluorescenza di cellule CALU3 colorate per E-caderina (rosso), MRC5 cellule colorate per vinculin (rosso) e le cellule ASM colorate per SM22α (rosso) tutta la loro impalcatura specializzata (E, F e G, rispettivamente). Hoechst è stata utilizzata per colorare i nuclei (blu), barra della scala indica 40 &amp;# 181;. M <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig7.jpg" /> Figura 7. Sistema di perfusione per tri-strato di modello a parete delle vie aeree. (A) Fotografia di nave bioreattore collegato alla pompa peristaltica e 2x serbatoi dei media. (B) Schema degli scaffold tri-strato. (C) Schema dei due circuiti bioreattore quando il modello delle vie aeree si tiene all&#39;interfaccia aria-liquido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig8.jpg" /> Figura 8. Complete 3D modello da parete delle vie aeree. (A) biopsia bronchiale di parete delle vie aeree con lo strato mucoso evidenziato in rosso, la regione sottomucosa evidenziata in verde, e il fascio muscolare liscio evidenziato in oro. (B) Sezione di parete delle vie aeree a tre strati composto da impalcature bifasiche e allineati popolate con epiteliale, fibroblasti e cellule muscolari lisce fisse dopo 2 settimane di co-coltura. Nuclei delle cellule sono state colorate con DAPI (blu) con impalcatura riflettanza (grigio) contemporaneamente ripreso. Ponteggi sono stati fissati e immunostained per marcatori specifici delle cellule dopo 2 settimane, con le cellule CALU3 colorate per citocheratina (verde) (C), MRC5 cellule colorate per S100A4 (verde) (D), e le cellule muscolari lisce colorate per SM22α (red) ( E). Bar Scala indica 200 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Tabella 1.

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Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Adattamento del processo Electrospinning per fornire tre ambienti unici per un Tri-livello<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello della parete delle vie aeree

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

12.3K Views.  University of Nottingham. Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall. 

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Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery under pulsatile deformations. The goal of this study was to mimic the structure of native artery by fabricating a multi-layered electrospun conduit composed of poly(caprolactone) (PCL) with the addition of elastin and collagen with blends of 45-45-10, 55-35-10, and 65-25-10 PCL-ELAS-COL to demonstrate mechanical properties indicative of native arterial tissue, while remaining conducive to tissue regeneration. Whole grafts and individual layers were analyzed using uniaxial tensile testing, dynamic compliance, suture retention, and burst strength. Compliance results revealed that changes to the middle/medial layer changed overall graft behavior with whole graft compliance values ranging from 0.8 - 2.8 % / 100 mmHg, while uniaxial results demonstrated an average modulus range of 2.0 - 11.8 MPa. Both modulus and compliance data displayed values within the range of native artery. Mathematical modeling was implemented to show how changes in layer stiffness affect the overall circumferential wall stress, and as a design aid to achieve the best mechanical combination of materials. Overall, the results indicated that a graft can be designed to mimic a tri-layered structure by altering layer properties.

The aim of this study was to mimic the native three layered architecture of the arterial wall. To accomplish this, electrospinning was employed with the use of a 3-1 (input-output) nozzle and blends of polycaprolactone, elastin, and collagen.

Tri-strato Electrospinning di Mimic nativa Architettura arteriosa utilizzando Policaprolactone, elastina e collagene: uno studio preliminare

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Ricerca

Bioingegneria

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

Tridimensionale pelle umana Ricostruire Modello: uno strumento per studiare la pelle normale e progressione Melanoma

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Un Toolkit per permettere la conversione di idrocarburi in ambienti acquosi

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Investigare la separazione tridimensionale del flusso indotta da un modello di polipo piega vocale

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

In vitro delle cellule Cultura modello per Tossico per inalazione Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Generazione di una tridimensionale a tutto spessore della pelle Equivalent e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Sviluppo di un multicellulare tridimensionale Organotipica Modello della mucosa intestinale umana coltivate in microgravità

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modello del disco intervertebrale Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.