Questo protocollo consente la coltivazione in vitro e la visualizzazione microscopica diretta dei tessuti delle vie aeree isolati durante diverse procedure di manipolazione dei tessuti, come la de-epitelizzazione e la rigenerazione del tessuto delle vie aeree. L'imaging in situ proposto in questo studio consente un monitoraggio rapido e non distruttivo del lume tracheale durante la rimozione controllata guidata dall'imaging dell'epitelio endogeno e la consegna delle cellule esogene. La piattaforma bioreattiva guidata dall'imaging e i protocolli di manipolazione dei tessuti possono essere utilizzati per generare tessuto delle vie aeree bioingegnerizzato per la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci.
La costruzione e l'utilizzo del bioreattore del tessuto delle vie aeree abilitato all'imaging saranno dimostrati da due dottorandi del nostro gruppo di ricerca, Mohammad Mir e Jiawen Chen. Per iniziare a creare un dispositivo di imaging in situ, inserire una lente tubolare in un tubo obiettivo impilabile e fissarla utilizzando un anello di fissaggio. Quindi, montare il gruppo tavolo obiettivo su una telecamera CMOS scientifica tramite un adattatore C-mount.
Utilizzare il software Micromanager per utilizzare la fotocamera e acquisire foto e video. Mentre si mira a un oggetto situato a 10 metri dalla fotocamera, regolare la distanza tra l'obiettivo valvolare e il sensore di imaging della fotocamera fino a quando non si forma un'immagine focalizzata dell'oggetto sullo schermo del computer. Successivamente, utilizzare i componenti del sistema di gabbia ottica, come l'asta di assemblaggio, la piastra filettata della gabbia e il cubo della gabbia per montare una lente filtrante su uno specchio dicroico a doppio bordo, super-risoluzione, e un laser sul dispositivo.
Collegare un obiettivo 20X al dispositivo. Quindi, montare un obiettivo verde con un diametro di 500 micrometri all'estremità distale del tubo dell'obiettivo tramite il traduttore X-Y. Regola la distanza tra le lenti verdi e quelle dell'obiettivo per formare le immagini microscopiche focalizzate.
Per visualizzare il lume della trachea di ratto isolato in campo luminoso o fluorescente, posizionare il bioreattore nella fase di imaging. Successivamente, infondere 500 microlitri dell'estere carbossifluoresceina succinimidyl appena preparato, o soluzione CFSE, ad una portata di cinque millilitri al minuto attraverso la trachea tramite la pompa della siringa collegata al tubo della cannula tracheale. Una volta che la soluzione CFSE riempie la trachea, arrestare la pompa.
Dopo 10 minuti, lavare il lume della trachea infondendo 10 millilitri di PBS utilizzando la pompa della siringa per rimuovere i reagenti CFSE residui non incorporati. Dopo il lavaggio, inserire l'estremità distale della lente verde nella trachea tramite il connettore luer collegato a un'estremità della trachea. Quindi, spostare delicatamente la lente verde all'interno della trachea fino a quando la superficie della trachea non è focalizzata.
Per acquisire le immagini in campo luminoso nel software micromanager, illuminare il lume della trachea con luce bianca attraverso il cubo della gabbia. Quindi, fai clic sull'icona Live per mostrare la superficie lumenale della trachea in tempo reale. Utilizzare l'impostazione Imaging e le schede Esposizione per modificare il tempo di esposizione al valore desiderato.
Per regolare il contrasto e la luminosità delle immagini, utilizzare l'istogramma e la finestra di ridimensionamento dell'intensità per spostare le frecce in bianco e nero nel punto finale della visualizzazione interattiva dell'istogramma. Fai clic su Stop Live per attivare l'icona Snap, quindi fai clic sull'icona Snap per bloccare l'immagine. Quindi, utilizzare l'impostazione Esporta quindi Immagini come schede spostate per salvare le immagini nel formato desiderato.
Per ottenere foto e video in modalità fluorescente, illuminare il lume della trachea con luce laser specifica CFSE attraverso il cubo della gabbia e acquisire le immagini in tempo reale spostando la sonda di imaging avanti e indietro. Una volta ottenute le foto e i video, rimuovere delicatamente l'obiettivo verde dalla trachea. Per la deepitelializzazione della trachea, infondere 50 microlitri del 2% di dodecil solfato di sodio appena preparato attraverso la cannula della trachea per generare un film sottile della soluzione detergente sul lume della trachea.
Dopo l'instillazione, chiudere le connessioni dei tubi del bioreattore utilizzando tappi luer maschio o femmina e trasferire il bioreattore in un incubatore a 37 gradi Celsius per 10 minuti per consentire alla SDS di dimorare all'interno della trachea. Ripeti l'instillazione una volta. Dopo la seconda instillazione, rimuovere l'epitelio lisato e la SDS irrigando tre volte il lume della trachea con 500 microlitri di PBS tramite pompa a siringa ad una portata di 10 millilitri al minuto.
Quindi, posizionare il bioreattore su uno shaker per vibrare meccanicamente a una frequenza di 20 Hertz e un'ampiezza di spostamento di 0,3 millimetri per promuovere fisicamente il distacco delle cellule epiteliali trattate con SDS dal lume della trachea. Mentre la trachea viene vibrata meccanicamente, instillare 500 microlitri di PBS due volte attraverso il lume della trachea per rimuovere la SDS residua e i detriti cellulari. Dopo la rimozione dell'epitelio, valutare la clearance dello strato epiteliale misurando l'intensità del CFSE utilizzando il dispositivo di imaging a lente verde.
Dopo aver preparato una trachea di ratto deepilelializzata, scongelare le cellule staminali mesenchimali congelate, o MSC, per 30 secondi in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Quindi, contare le cellule con un emocitometro, seguito dalla preparazione di una soluzione cellulare con una concentrazione di cinque volte 10 alle sei cellule per millilitro. Quindi, etichettare le cellule in modo fluorescente incubandole con due millilitri di soluzione CFSE 100 micromolare a temperatura ambiente.
Dopo 15 minuti, sciacquare le cellule con cinque millilitri di PBS tre volte prima di risospenderle in un terreno di coltura DMEM fresco ad una concentrazione finale di tre volte 10 alle sette cellule per millilitro. Immediatamente dopo la preparazione del collagene I idrogel, come descritto nel manoscritto, aggiungere le cellule alla soluzione di idrogel con la concentrazione desiderata. Quindi, mescolare le cellule e la soluzione di gel con una micropipetta per ottenere una miscela uniforme di cellule-idrogel.
Quindi, collegare un'estremità della trachea all'interno del bioreattore a una pompa a siringa programmabile attraverso un connettore luer e fornire cinque millilitri di terreno di coltura fresco nella camera del bioreattore a 37 gradi Celsius per coprire la superficie esterna della trachea. Quindi, somministrare 10 microlitri bolo della miscela cellula-idrogel nella trachea deepitelializzata all'interno del bioreattore per generare uno strato di idrogel cellulare sul lume della trachea. Dopo l'iniezione cellulare, posizionare il bioreattore in un incubatore di colture cellulari sterili a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per la gellazione per 30 minuti per consentire la gellazione.
Per visualizzare la distribuzione delle cellule impiantate, sterilizzare la lente verde con alcool isopropilico al 70% o etanolo e posizionare il bioreattore sul palco di imaging per ottenere foto e video sia in modalità campo luminoso che fluorescente. Dopo 30 minuti di semina cellulare, infondere un millilitro di terreno di coltura nel lume della trachea ad una portata di un millilitro al minuto. Infine, coltiva la trachea con semi cellulari all'interno del bioreattore in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per il tempo desiderato.
Durante la coltura cellulare, mantenere statico il fluido all'interno del lume, mentre il fluido all'esterno della trachea viene continuamente perfuso attraverso un flusso unidirezionale. Nelle immagini a campo luminoso e fluorescenti della trachea deepitelializzata, nessun segnale fluorescente è stato osservato prima dell'etichettatura CFSE. Con il CFSE, è stato osservato un segnale fluorescente uniforme in tutto l'epitelio.
Dopo la deepitelializzazione, l'intensità fluorescente è diminuita in modo significativo, indicando l'ablazione dell'epitelio. La colorazione ematossilina ed eosina della trachea deepitelializzata ha illustrato la rimozione dell'epitelio pseudostratificato dal lume della trachea e la conservazione delle cellule e della matrice extracellulare, o microstrutture ECM, negli strati tissutali sottostanti. Inoltre, la colorazione pentacroma e tricroma ha confermato il mantenimento dell'architettura tissutale tracheale e dei componenti ECM, come collagene e proteoglicani.
L'immunofluorescenza delle cellule epiteliali e del collagene I ha rivelato la completa rimozione dell'epitelio e la conservazione del collagene I all'interno del tessuto subepiteliale. Le micrografie elettroniche a scansione indicavano che la trachea nativa era popolata da cellule multicilliate e calici. Nella trachea deepitelializzata, la membrana basale è stata esposta, come indicato da una rete a rete di fibre della matrice extracellulare e dall'assenza di cellule epiteliali.
Le immagini di fluorescenza della trachea deepilelializzata, dopo la semina con PBS e collagene, sono mostrate qui. Rispetto alle cellule seminate attraverso il terreno di coltura, le cellule marcate fluorescenti erogate tramite idrogel sono rimaste aderenti in modo più uniforme attraverso il lume. Lo studio di vitalità cellulare ha dimostrato che la vitalità non è stata influenzata dalla procedura di consegna cellulare e oltre il 90% delle cellule è rimasto vitale.
La creazione di un sottile film di detergente nel processo di de-epitelizzazione e l'utilizzo dell'idrogel come veicolo di consegna per le cellule sono passaggi essenziali per il successo di questo protocollo. Il nostro prossimo obiettivo di ricerca è quello di impiantare cellule primarie o staminali delle vie aeree coltivate in laboratorio sul tessuto delle vie aeree deepitelializzato per indagare se il tessuto funzionale delle vie aeree può essere preparato.
