Questo lavoro è stato sostenuto dal governo sostegno di cui di assegnazione N ° EPS-0903795 assegnati dalla National Science Foundation, NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI), e Grant 8P20 GM103444 (YM PI).

1. Preparazione del substrato contenente gelatina per tridimensionale Bioprinting di alginato idrogel <ol><li> Preparare il substrato di calcio / gelatina seguendo il metodo substrato calcio / gelatina descritto da Pataky e altri 11 per evitare la redditività ridotta associata ad alto contenuto. Il metodo substrato calcio / gelatina è elencato di seguito. <ol><li> Combinare diidrato cloruro di calcio (1.5 wt%), sodio cloruro (0,9% in peso), e la gelatina porcina (2 wt%) in acqua distillata e far bollire per 2 minuti per creare una soluzione di gelatina 100 mM. </li></ol></li><li> Versare 5 ml della soluzione di gelatina / calcio in 100 mm piatti Petri standard, agitare la soluzione attorno a rendere ancor rivestimento sulla superficie, e posto su una superficie piana in frigorifero a gel O / N (permette di gel di almeno 8 hr prima dell&#39;uso). </li><li> Per aumentare l&#39;opacità della superficie del substrato, aggiungere biossido di titanio (0.3 wt%) alla soluzione di gelatina CaCl / 2. Agitare per 10 min. Autoclave soluzione di gelatina / TiO 2 sul ciclo liquidi per 30 min per sterilizzarlo. <ol><li> Aggiungere 3 ml della / soluzione di gelatina TiO 2 alla superficie delle piastre di gelatina precedentemente preparati. Agitare la miscela per assicurarsi che sia distribuito uniformemente su tutta la superficie. Lasciare gel nel 4 ° C frigo O / N (permettere a gel, almeno 8 ore prima dell&#39;uso). I supporti devono essere utilizzati entro 3 giorni. </li></ol></li></ol> 2. alginato Ossidazione <ol><li> Ossidare il bioink alginato di sodio secondo il metodo per alginato parzialmente ossidato Bouhadir et al 30 descritto di seguito. <ol><li> Per fare una soluzione di alginato ossidato 5%, sciogliere 1 g di alginato di sodio in 100 ml di acqua distillata. Aggiungere una soluzione acquosa di periodato di sodio (0,25 M, 0,25 mmol), l&#39;agente ossidante, per produrre una soluzione al 5% di ossidazione. Mescolare per 19 ore a temperatura ambiente. Aggiungere 40 ml di glicole etilenico alla soluzione dopo 24 ore per terminare la reaction. </li><li> Sciogliere 2.5 g di cloruro di sodio in soluzione. Aggiungere una quantità in eccesso di alcol etilico (rapporto 2: 1) per precipitare i alginati ossidati. Centrifugare a 1.000 xg per raccogliere i precipitati e ri-sciogliere in acqua distillata. Ripetere il lavaggio etanolo. </li><li> Liofilizzare il pellet alginato ossidati e conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Determinare il grado di ossidazione misurando la percentuale di sodio periodato consumato prima di essere terminato da glicole etilenico. <ol><li> Preparare una soluzione di ioduro di potassio (20% w / v, pH 7,0 tampone fosfato di sodio) e una soluzione thyodene (10% w / v, pH 7,0 tampone fosfato di sodio). Mescolare le due soluzioni con l&#39;alginato ossidato a RT. </li><li> Gradualmente cadere l&#39;alginato di sodio e soluzione di periodato reagito nella miscela di soluzioni di ioduro di potassio e theodyne. Misurare l&#39;assorbanza della miscela spettrofotometro a 426 nm. Quando ha raggiunto unmassimo, registrare il volume utilizzato di alginato di sodio e soluzione periodato come V 1. </li><li> La reazione è <img alt="Equazione 1" fo:content-width="0.8in" src="/files/ftp_upload/53156/53156eq1.jpg" width="120" /> . La quantità di periodato di sodio non reagito è <img alt="Equazione 1.5" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/53156/53156eq1.5.jpg" width="150" /></li><li> Sottrarre la quantità di periodato di sodio non reagito dalla concentrazione iniziale per determinare la quantità di sodio periodato consumato. Usando la formula precedente, determinare il grado di ossidazione finale del alginato. </li></ol></li></ol> 3. alginato Peptide Coniugazione <ol><li> Leganti coniugati con una sequenza di arginina-glicina-aspartato esposti (peptide) nella alginato ossidato precedentemente preparato seguendo il metodo coniugazione RGD-alginato da Rowley et al 31 di seguito descritto per promuovere l&#39;adesione delle cellule e la diffusione. </li><li> Utilizzare carbod acquosachimica iimide con G 4 RGDSPto coniugato 31. </li><li> Sciogliere 1 g di 5% alginato ossidato in 0,1 M 2- (N-morfolino) Acido etansolfonico (MES) tampone pH = 4. Aggiungere 1-etil- (dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC, 0,54 mmol) e N-Hydroxysuccinimide ( NHS, 0,27 mmol) in rapporto 2: 1 per formare ammide intermedia. </li><li> Aggiungere 0,28 mmol peptide, giunto alla spina dorsale del polimero alginato mediante il terminale amminico. Mescolare a RT O / N. </li><li> Arrestare la reazione di accoppiamento con l&#39;aggiunta di 2,5 g di cloruro di sodio alla soluzione. Aggiungere una quantità in eccesso di alcol etilico (rapporto 2: 1) per precipitare i alginati ossidati. Centrifugare la miscela a 4000 xg per 5 minuti per raccogliere i precipitati. Aspirare i media nel cofano coltura cellulare e ri-sciogliere i precipitati in acqua distillata. Ripetere il lavaggio etanolo. </li><li> Liofilizzare precipitati fino a quando non diventa completamente asciugato (apparirà come una sostanza polverosa bianca) e conservare in frigo a -20 ° C per più tardiutilizzare. </li></ol> 4. adiposo umano Cellule tessuto stromale coltura cellulare (di hADSC) <ol><li> Cultura adiposo umano cellule stromali tessuto (di hADSC) in 75 cm trattati boccette di coltura cellulare (fiasche T75), coperto con 15 ml basso DMEM glucosio con il 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina-streptomicina, 1% glutamina e 1% antimicina. Modificare i media, nel cofano coltura cellulare, ogni due giorni fino a quando non hanno raggiunto confluenza (80-90%). </li><li> Una volta confluenti, trasferire i fiaschi T75 alla cappa coltura cellulare e sospendere la hADSC del utilizzando il metodo tripsina digestione enzimatica. <ol><li> Nella cappa, aspirare tutti i terreni di coltura cellulare spento delle cellule. Sciacquare con 5 ml di Dulbecco fosfato-Buffered Saline con calcio e magnesio (DPBS ++). Aspirare il DPBS ++ fuori delle cellule. </li><li> Mentre nella cappa, fare una soluzione di tripsina e DPBS ++ miscelando 1 ml tripsina e 4 ml DPBS ++. Ogni beuta richiede 5 ml della solution, in modo da rendere il volume appropriato per il numero di flaconi confluenti. Aggiungere 5 ml della tripsina / DPBS ++ per ogni pallone e metterli in incubatrice per 2 min. </li><li> Dopo 2 minuti, togliere i flaconi e battere leggermente ai lati del loro di allentare le cellule dai fondi. Guardare ogni beuta sotto un microscopio per assicurare le cellule sono sospese. Collocare i flaconi di nuovo nel cofano coltura cellulare e aggiungere 3 ml di mezzi appropriati di coltura cellulare per ogni pallone. Questo termina la reazione tripsina. </li><li> Trasferire i mezzi di comunicazione cellula-carico da ogni pallone e mettere in una conica da 50 ml. Li centrifugare a 1000 xg per 5 min. Le celle dovrebbero apparire come una piccola pallina bianca sul fondo del cono. Rientro alla cappa coltura cellulare e aspirare i media. Risospendere le cellule in 2 ml di colture cellulari. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro al microscopio. Una volta che le cellule sono state contate, nella cappa coltura, un&#39;aliquota la quantità di materiale contenente ~ 1,3 million cellule e trasferimento in una conica da 15 ml. Centrifugare la conica 15 ml contenente nuovamente le cellule per 5 minuti a 1000 x g. </li><li> Nel cofano cultura, reseed le restanti celle in più T-75 palloni, l&#39;aggiunta di una concentrazione di ~ 350.000 cellule per ogni pallone. Aggiungere 15 ml di media DMEM e tornare alla incubatore fino confluenti di nuovo. </li><li> Terminato il ciclo di centrifuga, riportare la conica 15 ml per la coltura cellulare. Aspirare il supporto dal pellet cellulare, e risospendere le cellule in soluzione acquosa di alginato ad una concentrazione di 1,3 milioni di cellule per millilitro di bioink, terteriating la soluzione spesso così vi è una distribuzione omogenea di cellule in tutto il bioink. Caricare la soluzione di cellule-carico in una siringa da 3 ml compatibile stampante sterile e avvitare la sterile 22 G punta di plastica. </li></ol></li></ol> 5. Bioprinter Setup <ol><li> Accendere il bioprinter, ogni computer dispenser, e la recirculating bagnomaria. <ol><li> Impostare manualmente la temperatura del bagno a ricircolo d&#39;acqua per per il meccanismo di gelificazione. </li><li> Impostare manualmente i parametri di stampa per ogni dispenser sul computer distributore di correlazione. Impostare il volume di erogazione di 230 nl, il numero di backsteps a 0, e la velocità di erogazione di 10μl -sec. </li></ol></li><li> Aprire il software di progettazione e il programma per la visualizzazione del display della videocamera USB del computer. <ol><li> Utilizzando il software, inserire manualmente le coordinate per una matrice di punti 5 x 5 con 2,4 millimetri spaziatura tra gocce. </li><li> Impostare i parametri di stampa per essere: distanza tra fine punta e superficie del substrato = 0,1 millimetri; siringa altezza viene sollevato tra deposizioni = 20 mm; la quantità di tempo per deposizione = 1 sec. </li><li> Salvare il programma e inviarlo al robot. </li></ol></li><li> Porre la capsula di Petri di gelatina / TiO2 -contenenti sul palco della stampante C 4 °. Chiudere e bloccare la porta della camera. </li><li> Utilizzare il PLC per initialize le fonti di luce ultravioletta, e sterilizzare la camera per 90 sec. </li><li> Una volta che la sterilizzazione è completo, aprire la camera e caricare la siringa contenente del hADSC sospeso in alginato in Gun 1. Chiudere e bloccare la porta della camera. </li><li> Utilizzare il PLC per accendere il sistema di ventilazione, attendere 30 secondi per l&#39;equilibrio della pressione interna. </li><li> Sul computer, eseguire il programma contenente i parametri pathway e stampa geometrica. </li><li> Durante tutto il processo di stampa, vedere lo schermo della telecamera USB del computer per confermare la stampa accurata e uniforme. </li><li> Una volta che la stampa è terminata, consentire i costrutti di gel per 40 min. </li></ol> 6. cellulare vitalità Assessment <ol><li> Coprire i costrutti che non stanno andando per essere ripreso immediatamente dopo la stampa in DMEM e conservare in incubatrice fino al momento di imaging. </li><li> Per quantificare la vitalità dei costrutti, macchia utilizzando un test di fattibilità / citotossicità fluorescenti-based, unimmagine nd utilizzando la microscopia confocale. <ol><li> Seguendo le istruzioni del kit, preparare una soluzione colorante contenente calceina AM e etidio omodimero-1. Per fare 10 ml di soluzione colorante, aggiungere 20 ml di etidio omodimero-1 e 5 ml della calceina am a 10 ml di sterile, coltura di tessuti di prima scelta di Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (+ magnesio, + calcio; DPBS ++). </li><li> Immergere i costrutti bioprinted nella soluzione macchia per 15 minuti al buio. </li><li> Immagine costrutti colorate utilizzando un sistema di microscopio confocale a giorni 0 e 8. Prendete più foto di ogni costrutto bioprinted, utilizzando parametri Z-stack da 30 fette ottici su una profondità di 300 micron, e contano manualmente le cellule. Se le cellule appaiono di colore giallo o verde li contano come vivi, e se rosso, contarli come morto. </li></ol></li><li> Calcolare la percentuale vitalità cellulare come il numero di cellule vive diviso per il numero totale di cellule nel costrutto; La vitalità cellulare = numero dicellule vive (verde + giallo) / numero di cellule totali (verde + giallo + rosso) x 100%. </li><li> Calcolare la quantità di proliferazione cellulare per ogni campione come il numero di cellule del giorno 8 diviso per il numero di cellule al giorno 0; La proliferazione cellulare = numero di cellule dal vivo il giorno 8 / cellule vive contare il giorno 0 x 100%. </li></ol> 7. RGD peptide Coniugazione Analisi <ol><li> Per analizzare il successo di RGD peptide coniugazione in alginato, alginato confrontare RGD coniugato e alginato non-coniugato. Per fare questo, immagine i costrutti stampati con (4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) e falloidina macchie. <ol><li> Effettuare le phalloidins soluzione di lavoro diluendo 5 ml di soluzione madre metanolica con 200 ml di DPBS ++. Conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Effettuare una soluzione stock di 300 micron della macchia DAPI seguente equazione: (0,10509 g / L) / (350,3 g / mol) = 3 × 10 -4 M = 0,0003 M = 0.300 mm = 300 micron. Fai °e DAPI soluzione di lavoro diluendo la soluzione madre 1: 100 in DPBS ++ per ottenere 3 micron soluzione. Conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Completamente immergere il campione in paraformaldeide al 4%. Incubare per 1 ora a RT. Lavare tre volte con DPBS ++, permettendo la soluzione a sedere per 5 minuti ogni lavaggio. Trasferire il campione di gel dal pozzo di un vetrino, lanciando il gel sopra nel processo. Immergere il gel in 0.1% Triton X-100 (0,1 g / 100 ml) in DPBS ++ per 10 min. Lavare tre volte con DPBS ++, permettendo a 5 minuti per ogni lavaggio. </li><li> Colorare i costrutti stampati con falloidina immergendole nella soluzione di lavoro. Coprire con un foglio e incubare per 4 ore. Rimuovere la macchia falloidina e lavare tre volte con DPBS ++. Il primo lavaggio dovrebbe essere veloce, questi ultimi lavaggi dovrebbero sedere per 5 minuti ciascuno. </li><li> Colorare i costrutti stampati con DAPI immergendole nella soluzione di lavoro DAPI. Coprire con un foglio e incubare a temperatura ambiente per 30 min. lavaggiotre volte con DPBS ++, permettendo ogni lavaggio a sedere per 5 min. Osservare e immagine dei campioni su un sistema microscopio confocale. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

L&#39;obiettivo principale di ingegneria dei tessuti è quello di colmare il divario tra la carenza di organi e le esigenze di trapianto attraverso lo sviluppo di sostituti biologici in grado di ripristinare, mantenere, o migliorare functio tessuto nativo. Questo ha portato alla realizzazione di ponteggi diretta con un complesso, anatomicamente corretta geometria esterna e controllo preciso sul geometr interna. Bioprinting tridimensionale è una metodologia utilizzata per generare costrutti tridimensionali di varie dime...

L&#39;ingegneria dei tessuti utilizza i principi della biologia e ingegneria nello sviluppo di sostituti funzionali a mantenere, ripristinare o migliorare tessuto nativo e. La capacità di generare costrutti biomimetici tridimensionali su richiesta faciliterebbe progressi scientifici e tecnologici in ingegneria dei tessuti, così come nei sensori basati su celle, droga / proiezione tossicità, modelli di tessuto o di tumore, e altri. L&#39;organizzazione tridimensionale dei costrutti tissutale è un componente fondamentale del metodo di fabbricazione perché deve strettamente mimare l&#39;interazione altamente organizzato di cellule e matrice extracellulare in tessuto nativo. Scaffold tridimensionali biodegradabili e di forma che formano sono fattori critici nel generare nuovi costrutti di tessuto perché le cellule migrano per formare uno strato bidimensionale di celle, ma non hanno la capacità di crescere in favorita tridimensionale. L&#39;impalcatura serve come base temporanea per cellulareattaccamento e la proliferazione, quindi deve essere costruito con materiali porosi controllabile e biodegradabilità, e sufficiente integrit meccanica. I materiali scaffold non dovrebbero essere citotossici o creare una risposta avversa dall&#39;host. Gli idrogel sono stati comunemente usati nelle tecniche di ingegneria tissutale, e per la loro idrofilia, gli idrogel consentire scambio fluido e gas in tutta la structur. Grazie alla combinazione di diverse idrogeli, le proprietà del idrogel sintetizzato sono modificabili per soddisfare le richieste di applicazione distinti. L&#39;approccio di ingegneria tissutale convenzionale prevede la creazione di acellulari scaffold sacrificali porosi che sono seminati con cellule post-fabricatio. Sono state impiegate molte tecniche, come ad esempio la fibra bonding, colata di solvente, e fondere stampaggio, ma rivelato minimamente successo per applicazioni di ingegneria tissutale. Metodi leganti di fibre consentono di fibre da allineare in forme specifiche, ma sono solo in grado di produrre patibolo molto sottile. Metodi di fusione di solventi prodotte costrutti altamente porosi, tuttavia la membrana più grande prodotto è stato solo 3 mm thic. Pertanto, la creazione costrutti tridimensionali non è possibile utilizzando queste tecniche. Tecniche di stampaggio Melt rivelate efficaci nel produrre scaffold tridimensionali, ma tali temperature elevate, sono necessari materiali biologici non possono essere utilizzati nel procedimento di produzione. Ponteggi seminate post-fabbricazione sono limitate nella loro capacità di soddisfare i requisiti di ingegneria dei tessuti per la produzione di scaffold tridimensionali con microstrutture predefinite o controllabili e. Un altro grosso problema con le tecnologie impalcatura seeding solidi è la carenza di vascolarizzazione e poveri meccanico. Bioprinting è stata estesa a tre dimensioni attraverso l&#39;uso di,, gel termo-reversibile biodegradabili atossici per superare gli svantaggi della convenzionale. Alcuni del solido a forma libera fabbricazione techniques attualmente in fase di impiegati sono bioprinting ea getto d&#39;inchiostro di stampa laser assistita. Tecniche bioprinting laser assistita utilizzano una sorgente laser impulsata, piastra segnale, e un substrato di ricezione per generare tridimensionale. Tuttavia, questa tecnica è limitata a causa della bassa produttività, bassa vitalità cellulare, e può produrre solo disposizioni limitate di strutture fabbricate perché solo prepolimeri photocrosslinkable possono essere utilizzati per formare un idrogel reticolato. Stampa a getto d&#39;inchiostro è stato sviluppato come un metodo senza contatto che riproduce i dati di immagine digitali su un substrato depositando inchiostro picolitri. Tuttavia, la stampa a getto d&#39;inchiostro non produce un&#39;alta risoluzione costrutto, costruisce esperienza rapida denaturazione proteica, e molte delle cellule sono lisati durante la deposizione. Attualmente, sono stati sviluppati nuovi metodi di produzione di additivi bioprinting. In questi sistemi cellule, proteine, fattori di crescita e idrogel biomimetici sono tipicamente integrati in mater matriceIALS durante il processo di fabbricazione e contestualmente depositata tramite attuatori controllati dal computer per generare costrutti cellulari carichi basati impalcatura-tridimensionali che imitano da vicino la microarchitettura di natale. Gli idrogeli cellule cariche costituiscono il bioink, che può essere eterogenea, costituita da più tipi di cellule, o omogenea. Additivo sistemi produttivi deposito bioink goccia a goccia o layer-by-layer con siringhe monouso e suggerimenti su una fase controllata da computer in grado di muoversi nelle direzioni x, ye z. Attraverso software, l&#39;architettura di scaffold stampati può essere facilmente manipolato a seconda delle esigenze dell&#39;applicazione. A differenza delle tecniche tradizionali, tecnologie mediche tridimensionali (risonanza magnetica per immagini, tomografia computerizzata) possono essere incorporati nei disegni, generando costrutto paziente-specifici. Questi metodi consentono anche la possibilità di produrre sostituzioni vascolarizzati perché costrutti sono prodotti con un più alto ldensità cellulare Ocal, permettendo interazioni cellula-cellula e migliorare la probabilità di post-impianto Surviva. La stampante Palmetto è personalizzato costruito un sistema multi-dispenser tridimensionale che utilizza metodi di fabbricazione robotizzati programmabili per generare costrutti eterogenei tessuto tridimensionale (Figura 1). Esso consente l&#39;utilizzo di una pluralità di materiali in combinazioni uniche per produrre strutture eterogenee. L&#39;inizializzazione del bioprinter è uno dei passi più importanti nella bioprinting perché permette di impostare una serie di parametri per ottimizzare la stampabilità dei costrutti bioprinted. Il bioprinter comprende un processo di tipo batch con avvio, uso e arresto sequenze controllati da un controllore logico programmabile (PLC), che l&#39;utente opera attraverso un pannello di controllo touch screen interattivo (Figura 1, A). Per impedire la contaminazione biomateriali logici il bioprinter è racchiuso in un poli positivo-pressione (metilmetacrilato) (PMMA) camera con un arrestance particelle ad alta efficienza (HEPA) -filtered sistema di circolazione dell&#39;aria (Figura 1, B, C). L&#39;interno della stampante può essere sterilizzato usando le fonti di luce ultravioletta incorporate (Figura 1, D). Il componente centrale del bioprinter è un posizionamento robot completamente programmabile che può riproducibile collocare il puntale dispenser con una precisione di 10 micrometri (Figura 1, E). Ci sono tre dispenser, che sono in grado di depositare volumi piccoli come 230 nl utilizzando una vite rotante (Figura 1, F). Essi sono indipendentemente programmabili tramite computer separati che regolano i parametri di stampa per ciascun erogatore (Figura 1, G). Rotary-vite erogazione utilizza la rotazione di una vite motorizzata per spostare bioink giù una siringa e dalla punta della siringa. Questi distributori sono montati su un pneumaticoStrumento Nest controllata ly (Figura 2A, B), che consente al robot di cambiare erogatore montato sul braccio robotico asse Z sotto controllo programmata (Figura 1, H). Il robot XYZ riceve istruzioni per la stampa da un computer dotato di software di progettazione (Figura 1, I). Ogni programma contiene sedi di erogazione, le routine di calibrazione e protocolli-dispenser che cambia. La progettazione di costrutti generati costituito principalmente le coordinate XYZ dove ogni distributore depositerà materiale. Il bioprinter comprende due sensori ottici ottici (Figura 2C) che determinano le coordinate XYZ della fine punta della siringa. Tali sensori inviano informazioni al robot, che usa per calcolare le posizioni delle estremità punta dell&#39;erogatore coordinate. C&#39;è un laser spostamento supplementare (Figura 2D) che proietta un 633 nm diodo rosso raggio laser di dimensioni dello spot 30 x 100 micrometri per misurare la distanza con un accuracy di 0,1 micrometri. Quando il raggio è altamente focalizzato il robot determina la distanza Z della superficie di stampa. Questa misura, e sensori di luce ottica misurazione della estremità di punta in Z, permette di calcolare accurate Z coordinate usato per posizionare la punta dell&#39;erogatore rispetto alla superficie di stampa. I puntali si muovono lateralmente e verticalmente attraverso il sensore di luce ottica X-asse orientato per trovare i centri Y e Z, e lateralmente attraverso un sensore asse Y per trovare il centro dell&#39;asse X. La superficie di stampa è mappato utilizzando la formula per una superficie piana in spazio xyz: ax + by + cz = d per determinare dove la superficie è relativo alla posizione dell&#39;estremità ago erogatore. La fase di stampa (Figura 1, J) detiene un piatto Petri campione fino a 80 mm di diametro e utilizza un bagnomaria ricircolo per mantenere la temperatura impostata (Figura 1, K). Temperatura di fase può essere impostato in un intervallo compreso tra -20 e rimane stabile all&#39;interno. C&#39;è una fotocamera USB montatasul robot Z-braccio per fornire una vista ingrandita della punta di erogazione durante il processo di stampa (Figura 1, L). Vi è una seconda telecamera montata verso la parte superiore della camera di interni che fornisce una visione completa della bioprinter durante il processo di stampa (Figura 1, L). Un software di disegno progettazione assistita da computer determina il pattern di deposizione e permette all&#39;utente di generare goccioline incrementale distanziati e strutture complesse (Figura 3). Percorsi tridimensionali possono essere codificati manualmente nel software di progettazione compatibile con stampante o importati da un software separato computer-aided disegno di progetto (Figura 4, tabella 1). Il software compatibile con stampante consente variazioni di parametri di stampa, come il metodo di deposizione (deposizione singola gocciolina o percorso continuo deposizione), la geometria tridimensionale dei percorsi, velocità di deposizione, la distanza tra la fine punta della siringa e substtasso superficie di stampa, la quantità di tempo per depositare una goccia individuale, e l&#39;altezza e velocizzare la siringa viene sollevato tra la deposizione delle gocce. Ogni programma contiene XYZ sedi di erogazione, le routine di calibrazione punta e protocolli-dispenser che cambia per fornire un ambiente sterile, senza l&#39;intervento dell&#39;operatore, durante la stampa. Il controllore logico programmabile (PLC) del robot riceve istruzioni dal computer che esegue il software di progettazione e controlla la temporizzazione degli eventi dai controllori esterni (ad esempio, i dispensatori). Per fare questo, il PLC utilizza un meccanismo di loop per controllare i distributori , dispositivo di posizionamento robotico, e fattori ambientali. Tridimensionale bioprinting-scrittura diretta utilizzando una vite rotante, sistema di erogazione del liquido permette al processo di deposizione cellule per essere più efficiente, accurato e più facile rispetto ai metodi precedenti. Questo studio dimostra l&#39;bioprinter su misura è in grado di generare cell carico di costrutti idrogel con la vitalità delle cellule di alta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Positioning Robot (JR2000 XYZ)</td>
			<td>Janome&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers</td>
			<td>Fishman Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Light Sensors:&#160;</td>
			<td>Keyensce</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Displacement Laser: OD Mini</td>
			<td>SICK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirculating Water Bath: Polystat</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-12122-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP</td>
			<td>AnMo Electrionics/YSC Technologies</td>
			<td>AD7013MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points</td>
			<td>Janome</td>
			<td></td>
			<td>Comes with purchase of Janome Robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder</td>
			<td>RatioServ</td>
			<td></td>
			<td>Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer 3 cc Syringes:&#160;</td>
			<td>Fishman Corporation</td>
			<td>122051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G Dispenser Tips</td>
			<td>Fishman Corporation</td>
			<td>Z520122&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium Dioxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13462-67-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate)</td>
			<td>FMC BioPolymer</td>
			<td>9005-38-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Mallinckrodt Baker, Inc</td>
			<td>9300-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Periodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7790-28-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hADSC</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5006</td>
			<td>Store in vials in liquid nitrogen until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>Store in the dark at -80&#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td>Store in the dark at -80&#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1769&#160;</td>
			<td>10 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14040133</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RGD Peptides</td>
			<td>International Peptides</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>A22283</td>
			<td>Store at -20&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4&#8217;, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R37606</td>
			<td>Store at -20&#176;C until use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viability of bioprinted cellular constructs using a three dispenser cartesian printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

I risultati dimostrano la bioprinter è in grado di depositare idrogel cellulari carichi in specifiche posizioni tridimensionali accuratamente e coerentemente con il software assistita da computer. Questi software determinano il posizionamento di ciascuna gocciolina e controllano molti dei parametri di erogazione (Figura 3,4). La ripetibilità del bioprinter per depositare in modo appropriato biomateriali è fondamentale per il suo successo nelle applicazioni di ingegneria tissutale. <p class="jove_...

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Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Viabilità di Bioprinted cellulari Costruisce Utilizzando un dispenser stampante cartesiana Tre

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K Views.  Medical University of South Carolina. A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Video: Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

Tridimensionale pelle umana Ricostruire Modello: uno strumento per studiare la pelle normale e progressione Melanoma

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Ricerca

Bioingegneria

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

Creazione transitori pori della membrana cellulare utilizzando una stampante a getto d&#39;inchiostro standard

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

In Vivo quantitativa valutazione della struttura del miocardio, la funzione, la perfusione e sostenibilità Utilizzando cardiaca micro-tomografia computerizzata

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting Cellularized Costruisce Utilizzando un tessuto-specifici idrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Layered alginato costrutti: Una piattaforma per la cooperazione culturale delle popolazioni cellulari eterogenee

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &amp;#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Here we present a fluorophore based imaging technique to detect cell viability on a non-transparent titanium scaffold as well as to detect glimpses of the scaffold impurities. This protocol troubleshoots the drawback of imaging cell-cell or cell-metal interactions on non-transparent scaffolds.

Viabilità imaging cellulare su scaffold non trasparenti - con l&#39;esempio di un romanzo a maglia Titanium Implant

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, and translation of findings is often poor. Thus, there is ample opportunity for alternative experimental approaches. Here we present an approach in which human cells are isolated from human anterior cruciate ligament tissue remnants, expanded in culture, and used to form engineered ligaments. Exercise alters the biochemical milieu in the blood such that the function of many tissues, organs and bodily processes are improved. In this experiment, ligament construct culture media was supplemented with experimental human serum that has been &#39;conditioned&#39; by exercise. Thus the intervention is more biologically relevant since an experimental tissue is exposed to the full endogenous biochemical milieu, including binding proteins and adjunct compounds that may be altered in tandem with the activity of an unknown agent of interest. After treatment, engineered ligaments can be analyzed for mechanical function, collagen content, morphology, and cellular biochemistry. Overall, there are four major advantages versus traditional monolayer culture and animal models, of the physiological model of ligament tissue that is presented here. First, ligament constructs are three-dimensional, allowing for mechanical properties (i.e., function) such as ultimate tensile stress, maximal tensile load, and modulus, to be quantified. Second, the enthesis, the interface between boney and sinew elements, can be examined in detail and within functional context. Third, preparing media with post-exercise serum allows for the effects of the exercise-induced biochemical milieu, which is responsible for the wide range of health benefits of exercise, to be investigated in an unbiased manner. Finally, this experimental model advances scientific research in a humane and ethical manner by replacing the use of animals, a core mandate of the National Institutes of Health, the Center for Disease Control, and the Food and Drug Administration.

We present a model of ligament tissue in which three-dimensional constructs are treated with the human exercise-conditioned serum and analyzed for collagen content, function, and cellular biochemistry.

Trattamento delle strutture ligamentali con serum esercitato-condizionato: un modello di ingegneria tessuto transazionale

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Fabbricazione di una matrice di multiplex artificiale microambiente cellulare

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic respiration. However, the extent to which both pathways contribute to the landscape of cellular energy production is consistently overlooked. Transformed cells cultured in saturating levels of glucose often show a decreased dependency on oxidative phosphorylation for ATP production, which is compensated by an increase in substrate-level phosphorylation. This shift in metabolic poise allows cells to proliferate despite the presence of mitochondrial toxins. In neglecting the altered metabolic poise of transformed cells, results from a pharmaceutical screening may be misinterpreted since the potentially mitotoxic effects may not be detected using model cell lines cultured in the presence of high glucose concentrations. This protocol describes the pairing of two powerful techniques, respirometry and calorimetry, which allows for the quantitative and noninvasive assessment of both aerobic and anaerobic contributions to cellular ATP production. Both aerobic and anaerobic respirations generate heat, which can be monitored via calorimetry. Meanwhile, measuring the rate of oxygen consumption can assess the extent of aerobic respiration. When both heat dissipation and oxygen consumption are measured simultaneously, the calorespirometric ratio can be determined. The experimentally obtained value can then be compared to the theoretical oxycaloric equivalent and the extent of the anaerobic respiration can be judged. Thus, calorespirometry provides a unique method to analyze a wide range of biological questions, including drug development, microbial growth, and fundamental bioenergetics under both normoxic and hypoxic conditions.

This protocol describes calorespirometry, the direct and simultaneous measurement of both heat dissipation and respiration, which provides a noninvasive approach to assess energy metabolism. This technique is used to assess the contribution of both aerobic and anaerobic pathways to energy utilization by monitoring the total cellular energy flow.

Calorespirometry: Un approccio potente, non invasivo per studiare il metabolismo energetico cellulare

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

Progettazione di una stampante 3D Open-Source, a basso costo per l'estrusione di bioink e di fusione alimentare

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...