The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.

NOTA: Questo protocollo inizia dopo che si è isolato mitocondri dal muscolo scheletrico rosso. I mitocondri sono stati isolati come precedentemente descritto da ~ 75 - 100 mg di rosso muscolo scheletrico 13. Tra 5-10 mg / mL di proteine ​​mitocondriali sarà raggiunto da questa quantità di tessuto risospendendo il pellet finale mitocondriale in ≤50 ml di buffer di isolamento per i mitocondri (IBM) 2 (Cfr Frisard et al 13). 1. Setup <ol><li> Preparare una soluzione madre (Tabella 1) e la soluzione di analisi mitocondriale (MAS) miscele (Tabella 2) per le analisi successive. Nota: La maggior parte della preparazione per i test può essere fatto in anticipo come la maggior parte delle soluzioni di titoli e MAS possono essere memorizzati. </li><li> Idratare una cartuccia test respirometrico in 1 ml di soluzione di calibrazione la sera prima l&#39;esperimento in un non-CO 2 incubatore a 37 ° C. </li><li> Il giorno dell&#39;esperimento, take fuori scorte congelate (substrati e modulatori mitocondriali, mix MAS, MAS w / o BSA, tabella 1) e disgelo a 37 ° C bagno o incubatore. </li><li> Preparare tutte le soluzioni di substrato (Tabella 3) e iniezioni (Tabella 4-5) e pH regolare, se lo desideri (pH 7,4). Dopo che il pH viene regolato, memorizzare su ghiaccio. </li><li> Programmare la macchina di misura del consumo di ossigeno più bene a giusto mix, aspettare, e parametri di misura (vedere Tabella 6) e lo sfondo dell&#39;etichetta e di gruppo / condizione pozzi immettendo prima il software di analisi, seguita dalla modalità &quot;Standard&quot;. <ol><li> Entra nel forum &quot;Guest&quot; e cliccare su &quot;Assay Wizard&quot;. Una volta in &quot;Assay Wizard&quot;, cliccare su &quot;Protocollo&quot; per cambiare miscela, aspettare, e misurare i parametri. Etichettare i pozzetti di fondo con il &quot;Back. Correzione scheda &quot;ed essere sicuri di evidenziare&quot; Do correzione del fondo &quot;. </li><li> Etichetta condizioni di primo clic sulla scheda &quot;Gruppi &amp; etichette&quot;, quindi la scheda &quot;Info Gruppo&quot;. Dopo questi parametri vengono immessi, fare clic su &quot;Fine&quot;, seguito da &quot;Salva modello&quot;. </li></ol></li></ol> 2. Il test Run <ol><li> Caricare le soluzioni di iniezione in una cartuccia sessione d&#39;analisi e avviare la calibrazione inserendo prima il software di analisi, seguita entrando nella modalità &quot;Standard&quot;. Entra nel forum &quot;Guest&quot;. Aprire il modello salvato nel passaggio 1.5 sotto l&#39;unità &quot;XF&quot;, nella scheda &quot;Modelli&quot;. Una volta aperta, fare clic su &quot;Start&quot; per iniziare la calibrazione. Nota: La cartuccia sessione d&#39;analisi deve essere inserito nella macchina con l&#39;angolo dentellato in basso a sinistra. Questa operazione richiede circa 30 min. Fare attenzione per iniettare soluzioni nelle porte appropriate. Iniezioni in Tabella 4-5 sono elencati in ordine di carico. </li><li> Delicatamente, ma mescolare bene il mitochondria magazzino agitando la soluzione con un puntale 200 pl, seguita dalla triturazione delicatamente il brodo con una pipetta punta di 200 microlitri, che ha avuto il suo orifizio ampliato tagliando ~ 3 mm l&#39;estremità della punta con le forbici. </li><li> Eseguire un test dell&#39;acido bicinconinico (BCA) per determinare la concentrazione di proteine ​​dello stock mitocondriale. </li><li> Utilizzando la concentrazione della acquisita dal punto 2.3, risospendere 10 mg di proteina mitocondriale / 200 microlitri della miscela substrato succinato / rotenone (Tabella 3). Risospendere 14 mg di proteina mitocondriale / 200 ml di rimanenti miscele di substrato (questo deve essere fatto per ogni miscela substrato) (tabella 3). Inserite tutte le proteine ​​mitocondriali / substrato mescola su ghiaccio. Nota: La quantità ottimale di proteine ​​mitocondriali per bene per ogni test è stato determinato come descritto in precedenza 9. È stato stabilito che il piruvato / malato, palmitoil carnitina / malato, glutammato / malato und flusso di elettroni saggi utilizza 3,5 mg di proteina mitocondriale, mentre il saggio succinato / rotenone utilizza 2,5 mg di proteina mitocondriale per pozzetto. Pertanto, il ricercatore ha bisogno per sospendere di nuovo abbastanza proteine ​​mitocondriali per 4 repliche in questo passaggio in quanto o 2,5 mg o 3,5 mg ogni 50 ml viene caricato per bene (vedere il punto 2.6). </li><li> Mescolare le soluzioni mitocondri / substrato delicatamente, ma accuratamente agitando la soluzione con un puntale 200 pl, seguita dalla triturazione delicatamente il brodo con una pipetta punta di 200 microlitri che ha avuto ~ 3 millimetri della sua fine tagliati fuori. </li><li> Collocare una piastra di coltura cellulare su ghiaccio e in triplice copia, carico di 50 ml / pozzetto di ciascuna delle miscele mitocondri / substrato. Gli sviluppatori del saggio respirometrico micropiastra raccomandano lasciando un minimo di due vuoto (nessun mitocondri) pozzi, preferibilmente su entrambi i lati sulla piastra di coltura cellulare. </li><li> Spin piastra di coltura cellulare a 2.000 g per 20 minuti a 4 ° C. Mentre la piastra è spinning, riscaldare le soluzioni di substrato in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Dopo la rotazione è completa, caricare accuratamente 450 ml di ciascuna soluzione di substrato sopra dei suoi rispettivi pozzetti (cioè, caricare il piruvato / malato substrato nei pozzetti che hanno mitocondri inizialmente risospese in questa soluzione di substrato). Accertarsi di caricare la piastra a temperatura ambiente. Nota: i pozzi vuoti devono essere caricati con 500 ml di substrato. Pozzetti del bianco designate per l&#39;analisi del flusso di elettroni devono essere caricati con il substrato flusso degli elettroni (Piruvato / Malato + FCCP), mentre i test accoppiato pozzetti del bianco possono essere caricati con qualsiasi substrato test di accoppiamento. Nota: Se si effettuano le analisi di flusso di elettroni accoppiati e sulla stessa piastra, il ricercatore deve riassegnare pozzi di fondo ai rispettivi test dopo la sessione d&#39;analisi è completa utilizzando la piattaforma &quot;XF Reader&quot; nella scheda &quot;Instrument&quot;. Una volta all&#39;interno l&#39;impostazione &quot;strumento&quot;, cliccare su &quot;Amministrazione&quot;scheda, seguito da &quot;Correzione sfondo&quot;. Hit &quot;End Modo Impostazioni dello strumento&quot; al termine. Questo perché la combinazione di ascorbato / TMPD può consumare O 2, quindi una correzione del fondo separata è necessaria per ogni tipo di saggio. </li><li> Dopo il 450 ml di substrato viene aggiunta a ciascun pozzetto, visualizzare lo strato di mitocondri nel pozzo per garantire che i mitocondri sono dispersi uniformemente in un unico monostrato (20X di ingrandimento [Cfr Rogers 9, Figura 4]). Wells che non sembrano avere un monostrato uniformemente distribuita possono essere rimossi post hoc. </li><li> Dopo aver controllato per l&#39;adesione mitocondriale, inserire la microplacca nello strumento test respirometrico e avviare il test eseguito facendo clic su &quot;OK&quot;. Nota: La calibrazione dal punto 2.1 deve essere completa prima che la corsa avrà inizio. Una volta che il ricercatore fa clic su &quot;OK&quot;, la macchina viene espulso il piatto di utilità che è stato utilizzato per la calibrazione. <ol> &lt;li&gt; Rimuovere la piastra utilità e posizionare la piastra di coltura cellulare che contiene i mitocondri sul vassoio. La tacca blu sulla piastra di coltura cellulare deve essere posto in basso a sinistra del vassoio. Clicca su &quot;continua&quot; per avviare la sessione d&#39;analisi. </li></ol></li><li> Dopo la corsa è terminata, estrarre la piastra di coltura cellulare e la cartuccia premendo il tasto &quot;Eject&quot; sullo schermo. <ol><li> Una volta che il piatto viene espulso, rimuovere ed eliminare la piastra di coltura cellulare e la cartuccia e fare clic su &quot;Continua&quot; sullo schermo. Il percorso sarà salvato automaticamente come file xls nel file &quot;Dati&quot;. </li></ol></li><li> Aprire questo file e modificare la visualizzazione da &quot;O2&quot; a &quot;OCR&quot; premendo la freccia verso il basso sotto il &quot;Y1:&quot; marcatore. <ol><li> Prossimo cambiamento &quot;Middle Point&quot; a &quot;Point-to-Point tariffe&quot; sotto la &quot;Data Rate visualizza come:&quot; l&#39;opzione. Fare clic su &quot;OK&quot; per applicare le modifiche. </li></ol&gt; </li><li> Fare clic sulla scheda &quot;Modalità Gruppo Well&quot; in basso a sinistra dello schermo per i pozzi di gruppo di condizioni simili insieme. Infine, fare clic sulla scheda &quot;Campione Media / Standard Error&quot; verso il centro dello schermo, a sinistra. In alternativa, questi comandi possono essere impostati prima che il test inizia l&#39;impostazione &quot;Assay Wizard&quot;. Nota: Ogni condizione avrà una media ± deviazione standard visualizzato per ogni classe e ogni condizione. Ci sono la misurazione della frequenza prese per condizione (Stato 2 [Accoppiamento] / State3u [Electron flusso] respirazione seguito da quattro iniezioni). Utilizzare la media della frequenza della seconda misura Stato 2, determinare Stato 4o al punto minimo dopo oligomicina iniezione, utilizzare il punto massimo per Stato 3 e 3u Stato dopo ADP e iniezione FCCP, rispettivamente, e utilizzare il punto di minimo per Antimicina A respirazione indotta per i saggi di accoppiamento. Utilizzare il punto di massimo per piruvato / malato indotta Stato 3u respirazione, utilizzare il minimopunto per rotenone indotta respirazione, utilizzare il punto di massimo per succinato indotta 3u Stato respirazione, e utilizzare il punto di minimo per Antimicina Una respirazione indotta per il saggio Electron Flow. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti 3 volte ed i dati indicati sono i risultati di un tracciato rappresentativo. </li></ol>

<ol>
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George W. Rogers è un dipendente di Seahorse Bioscience che produce lo strumento per il quale sono stati sviluppati questi test.

I metodi presentati in questo articolo forniscono le istruzioni passo-passo per l&#39;esecuzione di una raccolta di saggi su micropiastra respirometrici utilizzando mitocondri isolati 75-100 mg di topo muscoli scheletrici. Questi saggi possono essere eseguite con alta precisione come evidenziato dalla deviazione standard stretto tra i pozzetti in triplicato. È importante sottolineare che questi test permettono di individuare respirometriche di dove anomalie e / o adattamenti possono essere presenti nel ETC, ciclo TCA, β-ossidazione percorso, trasportatori substrato, ecc in un modello animale di uso comune. E &#39;importante sottolineare il razionale per l&#39;utilizzo di diversi combustibili e inibitori utilizzati in questo protocollo. Il piruvato / malato e glutammato / malate saggi respirometrici permettono la valutazione del complesso I respirazione mediata, nonché la valutazione dei rispettivi trasportatori, e nel caso di glutammato, deaminasi 15. In alternativa, la combinazione disuccinato / rotenone permette di valutare il flusso respiratoria mitocondriale attraverso Complesso II della ETC da rotenone inibisce complesso I e succinato fornisce elettroni Complesso II attraverso la riduzione della flavina adenina dinucleotide (FADH 2) 15. Questi test forniscono informazioni specifiche substrato da efficienza di accoppiamento e la respirazione massima. Il test di flusso di elettroni è unico in quanto la combinazione di substrati e inibitori permette di valutare più complessi durante flusso respiratoria mitocondriale 9. Il mix substrato iniziale di piruvato / malato + FCCP permette la valutazione della respirazione massima guidato da complesso I, mentre l&#39;iniezione di rotenone seguita da succinato consente la respirazione valutazione massima spinto da Complesso II. L&#39;iniezione di Antimicina A, un inibitore del complesso III, seguito dall&#39;iniezione di ascorbato / TMPD consentono per la valutazione della respirazione guidata da Complesso IV poiché l&#39;ascorbato / TMPD è undonatore di elettroni di citocromo C / Complesso IV. Mentre si ottiene nessuna informazione sulla efficienza di accoppiamento, il metodo è ideale per molto campioni di piccole dimensioni che precludono l&#39;esecuzione di più supporti in modo indipendente. Infine, l&#39;uso di palmitoil carnitina / malato consente la valutazione del coordinamento tra β-ossidazione e l&#39;ETC in quanto l&#39;equivalente riducendo prodotta dalla ossidazione di acido palmitico (β-ossidazione) alimentato nel ETC attraverso l&#39;elettrone trasferimento flavoproteina 15. Va notato che i saggi di flusso di accoppiamento e di elettroni possono essere usati anche in tandem per identificare cambiamenti nella funzione mitocondriale causa di qualche intervento (trattamento farmacologico, manipolazione genetica). L&#39;elevata precisione conseguito per questi test è dovuto principalmente alla completa miscelazione dei mitocondri, sia prima della determinazione della proteina, o con le soluzioni del substrato. Lungo queste linee, una volta che i mitocondri è resuspendend nel solutio substratons, è fondamentale mescolare questa soluzione accuratamente prima di caricare la piastra di coltura cellulare come descritto al punto 2.2, con una punta foro pipetta allargata. La mancata mescolare i mitocondri accuratamente porterà a grande variazione nel dosaggio. Inoltre, utilizzando un sottile puntale orifizio creerà forze di taglio durante la miscelazione mitocondri e aumenta il potenziale di danneggiare le membrane mitocondriali e il rilascio di citocromo C. La fase aderenza (2.7) è anche un passo fondamentale in questo protocollo. La mancata girare la piastra di coltura cellulare carico lungo / abbastanza veloce si tradurrà in aderenza incompleta dei mitocondri al pozzo, determinando in tal modo una maggiore variabilità tra i pozzi e le misurazioni. Il protocollo descritto è stato ottimizzato per includere: il caricamento di una quantità ottimale di proteine ​​mitocondriali per pozzetto, utilizzando le corrette concentrazioni / metodi di preparazione per fare azionari e substrato soluzioni, alterando la sessione d&#39;analisi per garantire mitocondriale pla statoteaus, e adeguata miscelazione dei mitocondriali azionari e mitocondriale / substrato mix. Prima di questi sforzi di ottimizzazione, gli autori incontrano insidie ​​nella corsa dosaggio. Di seguito si illustrano i metodi di risoluzione dei problemi / modifiche che erano utile per ottimizzare questo protocollo. Per quanto riguarda il carico ottimale, carico troppo poco mitocondri non suscitare una risposta forte, durante il caricamento di troppo mitocondri, si esaurirà la dell&#39;ossigeno all&#39;interno della microcamera e portare a misurazioni imprecise. Rogers et al 9 fornisce esempi di determinazione ottimale quantità di carico dei mitocondri per pozzetto per micropiastra saggi respirometrici. Più spesso, troppo mitocondri viene caricato per bene come evidenziato dallo stato 2 quote sopra 100-200 pmol / min / bene e stato 3 quote&gt; 1500 pmol / min / bene. Se si verifica sopra caricamento, eseguire un esperimento con diverse concentrazioni di proteina mitocondriale (per esempio tra 1 -. 10 mg) per sollecitare OCRs all&#39;interno r dinamicaange della macchina di misura del consumo di ossigeno. Operazioni preliminari e la corretta concentrazione di substrati e degli stock è della massima importanza. Usare sempre la forma di substrati / iniezioni e regolare il pH con idrossido di potassio o HCl; tamponi di sodio / soluzioni non sono raccomandati. Inoltre, i substrati risospendendo / scorte in DMSO o etanolo al 100% si tradurrà in un fallimento o un errore di misura. Assicurarsi di utilizzare il 95% di etanolo dove indicato. E &#39;comune per palmitoil carnitina per precipitare fuori dalla etanolo al 95% dopo lo scongelamento dello stock congelato, causando grande variabilità. Assicurarsi di scaldare il brodo palmitoil carnitina e vortice bene prima dell&#39;uso. Inoltre, un piruvato / malato risultato saggio altamente variabile può essere dovuto all&#39;essere piruvato magazzino&gt; 2 settimane di vita. Assicurati di rifare aliquote congelate di piruvato ogni 2 settimane. La sessione d&#39;analisi è stato modificato per 2 min misure per garantire altipiani statali mitocondriali. Se si desidera l&#39;osservazione di esaurimento della ADP, il ricercatore puòestendere il tempo di misura nella scheda &quot;Protocollo&quot; sotto il forum &quot;Assay Wizard&quot;. Infine, grande variabilità si verifica quando il azionari mitocondriale e mitocondri più substrato soluzioni non sono omogeneizzati completamente prima del carico. Se la variabilità tra i pozzi è alta dopo la sessione d&#39;analisi, assicuratevi di mescolare completamente la soluzione di substrato prima del prossimo esperimento. Mai vortice le soluzioni mitocondri / substrato, piuttosto mescolare, mash, e triturare delicatamente con la punta della pipetta foro allargato. Ci sono alcuni limiti di questa tecnica che sono degni di nota. In primo luogo, il numero di pozzetti sulla piastra di coltura cellulare utilizzato per questi test è relativamente bassa (cioè., 24 pozzetti e almeno 2 designata per pozzetti di bianco). Se si desidera eseguire tutti 5 di questi saggi su una piastra, il ricercatore è solo in grado di esaminare le risposte da un mouse alla volta. Tuttavia, va notato che gli strumenti 96 e sono disponibili per higheil throughput r. In secondo luogo, ci sono punti di forza e di debolezza insiti nella valutazione disfunzione mitocondriale nei mitocondri isolati rispetto al cellule intatte 1. Alcune debolezze includono avente rilevanza fisiologica meno rispetto alle cellule intatte e che inducono artefatti dal processo di isolamento. Infine, il successo di questo metodo è subordinato alla qualità del processo di isolamento mitocondriale. Sebbene alcuni di questi saggi sono stati sia sviluppate in sistemi differenti o sono stati convalidati in altri modelli animali, i metodi qui presentati sono i primi di sintetizzare tutte le saggi suddetti per l&#39;utilizzo ottimale in un multi-well macchina di misura del consumo di ossigeno usando il mouse muscolo scheletrico. È importante sottolineare che tutti e 5 di queste analisi può essere eseguita con la quantità di mitocondri isolati da ~ 75 - 100 mg di topo muscoli scheletrici, fornendo in tal modo un elevato throughput con il materiale minimo. Di grande importanza, la capacità di multi-welltecnologie consumo di ossigeno per eseguire saggi con quantità minime di mitocondri, combinate con un metodo di isolamento ottimizzato, permette al ricercatore di eseguire una moltitudine di altri esperimenti con il resto del tessuto muscolare scheletrico (ad es., western blot, RT-PCR, saggi enzimatici, ecc), che è spesso una lotta con questo modello animale. In conclusione, i metodi qui presentati forniscono istruzioni passo-passo per l&#39;esecuzione di una raccolta di saggi su micropiastra respirometrici utilizzando quantità minime di topo muscoli scheletrici. Soprattutto, i metodi presentati richiedono minime quantità di tessuto e mitocondri. Una volta masterizzato, le tecniche qui descritte consentiranno ai ricercatori di determinare un potenziale meccanismo di un prodotto composto o gene sul consumo di ossigeno mitocondriale in un modello animale comunemente utilizzato.

Il ruolo fisiologico principale mitocondri muscolari scheletriche è produrre ATP da fosforilazione ossidativa 1. È importante sottolineare che i mitocondri dei muscoli scheletrici svolgono un ruolo specifico nella capacità di esercizio 2, 3 invecchiamento, malattia degenerativa 4 e diabete di tipo II 5. Come una società che invecchia, e diabete di tipo II è il 7 ° causa di morte negli Stati Uniti 6, la necessità di metodi che valutano la funzione mitocondriale è diventato sempre più prevalente nella ricerca biomedica 7,8. In particolare, la misurazione del consumo di ossigeno ha utilità eccezionale per la valutazione della funzione mitocondriale in quanto rappresenta la funzione coordinata tra genomi mitocondriali e nucleari per esprimere i componenti funzionali di fosforilazione ossidativa 9. Esistono diverse tecnologie che consentono la misurazione del consumo di ossigeno in cellule intatte e isolared mitocondri 7-10. Inoltre, i saggi sono stati sviluppati per più tipi di cellule e tessuti, e in una varietà di specie che consentono la misurazione di percorsi mitocondriali e controllo respiratorio 9,11,12. Tuttavia, non esiste attualmente un vuoto nella letteratura per quanto riguarda la raccolta di tutti questi saggi utilizzando mitocondri isolati da topo muscoli scheletrici per uso in tecnologie di consumo di ossigeno su micropiastra. È importante sottolineare che l&#39;uso di micropiastra saggi respirometrici sta crescendo tra i biologi mitocondriali e consente misurazioni di throughput elevati con quantità minime di mitocondri isolati 9. Pertanto, una raccolta di saggi su micropiastra respirometrici sono stati sviluppati che permettono di individuare dove anomalie e / o adattamenti possono essere presenti nella catena di trasporto degli elettroni (ETC). Inoltre, due saggi respirometriche su micropiastra supplementare sono stati sviluppati che permettono la valutazione del coordinamento between l&#39;acido (TCA) Ciclo tricarbossilici e l&#39;ETC, e tra i ß-ossidazione e la ETC. È importante sottolineare che i metodi presentati forniscono un modo chiaro e conciso per misurare i cambiamenti meccanicistici nella funzione mitocondriale in un modello animale di uso comune.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63559</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essentially Fatty&#160;</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A6003</td>
			<td rowspan="2">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Free- BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9512</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-) Malic Acid, BioXtra, &#8805;95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">L-Glutamic acid</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">G1251</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">T7394</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99%, powder [TMPD]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl L-carnitine chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A, &#8805; 95% (HPLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)</td>
			<td rowspan="3">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="3">C2920</td>
			<td rowspan="3">Store at 2-8&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylhydrazone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8805;98% (TLC), powder [FCCP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A5285</td>
			<td rowspan="2">Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

La figura 1 rappresenta consumi di ossigeno (OCR) per la piruvato / malato, succinato / rotenone, palmitoil carnitina / malato, e glutammato / saggi malato (accoppiamento Assays). Questi tracciati del test vengono visualizzati come consumo di ossigeno Rate, o OCR, in funzione del tempo, sono sfondo correceted, e vengono visualizzati come i tassi di point-to-point. Ogni pannello rappresenta il consumo di ossigeno in diversi stati mitocondriali come descritto da Chance e Williams 14. Il primo pannello rappresenta il consumo di ossigeno basale, o Stato 2. Il secondo pannello, dopo l&#39;iniezione di ADP, rappresenta la massima accoppiato respirazione, o Stato 3. Il terzo pannello, dopo l&#39;iniezione di oligomicina A (un inibitore del Complesso V), rappresenta la respirazione a causa a perdita di protoni, o dello Stato 4o. Il quarto pannello, dopo l&#39;iniezione di FCCP, rappresenta la massima respirazione disaccoppiati, o 3U Stato. Infine, il quinto pannello, dopo l&#39;iniezione di Antimicina A, rappresenta l&#39;inibizione della respirazione ossidativa. In particolare, all stati mitocondriali hanno deviazione standard minimo. Ciò è dovuto alla completa miscelazione dello stock mitocondriale e miscele mitocondri / substrato, e il raggiungimento di un unico monostrato di mitocondri dopo lo spin aderenza (punto 2.6). D&#39;altra parte, caricando mitocondri disuguali in ciascun pozzetto e non conseguire un singolo monostrato di mitocondri nel pozzetto della micropiastra porta ad un aumento deviazione standard in ogni stato come mostrato nella Figura 2. I tracciati in figura 1 mostra gli altipiani per ogni stato mitocondriale e per ogni substrato. Il plateau raggiunta dopo due cicli di misurazione suggerisce buona qualità mitocondriale e che i mitocondri rimangono attaccati al bene per tutta la durata del test. Inoltre, il conseguimento dei tassi massimi raggiunto il plateau può essere più desiderabile poiché questo consente al ricercatore di prendere la media OCR questi stati mitocondriali, riducendo distorsione che può verificarsiselezionando un punto arbitrario. La quantità di mitocondri per pozzetto è stato determinato mediante prove di ottimizzazione. La quantità ottimale di mitocondri per bene dovrebbe portare a Stato 2 tassi tra 100-200 pmol / min / e statali e 3 quote &lt;1.500 pmol / min / bene, dal momento che questi valori sono all&#39;interno del campo di rilevamento dell&#39;ossigeno dinamica di ossigeno multi-bene macchina di misura del consumo. Caricamento troppe proteine ​​mitocondriale per pozzetto può comportare OCRs oltre la gamma dinamica dello strumento (Figura 3A). Figura 3 illustra il caricamento di 3,5 mg di proteina mitocondriale per pozzetto (tracciato blu) rispetto al carico 2,5 mg di proteina mitocondriale per pozzetto (rosso tracciamento) per il saggio succinato / rotenone. Caricamento troppe proteine ​​mitocondriale per pozzetto può anche portare all&#39;esaurimento di ossigeno all&#39;interno della microcamera del pozzo, impedendo così la misurazione accurata di OCR per ogni successiva misura 9 (Figura 3B &lt;/ strong&gt;). Point-to-point OCR è il tasso istantaneo di variazione del OCR. Se piatta, l&#39;OCR è costante / stabile, ma se in calo, allora ci potrebbe essere un problema biologico o tecnico. Il forte calo delle OCR in Stato 3 e la respirazione 3U Stato (figura 3A) è causata dai mitocondri estenuanti la fornitura di ossigeno prima della fine della misurazione (Figura 3B). Figura 4 rappresenta OCR in funzione del tempo per il saggio flusso di elettroni. Il tracciato è corretto e visualizzato come descritto per Figura 1. Il primo pannello in questo test rappresenta Stato 3U respirazione su piruvato / malato via I. Complesso Il secondo pannello, dopo l&#39;iniezione di rotenone, rappresenta l&#39;inibizione del complesso I respiratorio mediata. Il terzo pannello, dopo l&#39;iniezione di succinato, rappresenta il substrato stimolato 3U Stato con gli elettroni di entrare nel ETC al Complesso II (Complesso II respirazione mediata). Il quarto pannello, dopo l&#39;iniezione di Antimycin A, rappresenta l&#39;inibizione del complesso III e la respirazione quindi totale. Infine, il quinto pannello, dopo l&#39;iniezione di acido ascorbico / TMPD, rappresenta Complesso IV respirazione mediata. Simili i tracciati in figura 1, tutti gli stati mitocondriali avere deviazione standard minimo, e ogni aliquota ha o quasi ha raggiunto un plateau. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig1.jpg" /> Figura 1. accoppiamento Assays (A) malato piruvato 10 mM / 5 mM, (B) succinato / 2 mM rotenone, (C) 40 mM 1 malato palmitoil carnitina / mM, e (D) 10 mM glutammato / 10 mM. 10 mM malato accoppiato mitocondriali tracciati del test di respirazione come determinato dalla misurazione multi-bene di consumo di ossigeno. I valori sono espressi come media ± SD. Proteina mitocondriale caricato per bene è stata di 3,5 mg per tutti i test tranne succinato / rotEnone, che utilizza 2,5 mg di proteina mitocondriale per pozzetto. Dati rappresentano n = 3 repliche biologiche appaiati. OCR = consumo di ossigeno Tasso; ADP = adenosina difosfato; Oligo = Oligomicina A; FCCP = carbonile cyanide- 4 - (trifluorometossi) fenilidrazone; Anti-A = Antimicina A; PYR = piruvato; SUCC = succinato; ROT = Rotenone; PAL-C = palmitoil carnitina; GLUT = glutammato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig1large.png" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig2.jpg" /> Figura 2. altamente variabili piruvato / malato Assay. Altamente variabile 10 mM piruvato / 5 mM saggio malato causati da incompleta mescolando mitocondri dallo stock mitocondriale nel substrato / mix MAS, determinando in tal modo pro mitocondriale variabileTEIN carico in ogni pozzetto. Proteina mitocondriale caricato per bene era di 3,5 mg. Dati rappresentano n = 3 repliche biologiche appaiati. OCR = consumo di ossigeno Tasso; ADP = adenosina difosfato; Oligo = Oligomicina A; FCCP = carbonile cyanide- 4 - (trifluorometossi) fenilidrazone; Anti-A = Antimicina A; PYR = piruvato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig3.jpg" /> Figura 3. Il sovraccarico mitocondriale di proteine ​​per la succinato / Rotenone Assay. (A) consumi di ossigeno al di fuori della gamma dinamica della macchina di misura del consumo di ossigeno più pozzetti causato dal caricamento 3,5 mg di proteina mitocondriale per pozzetto (tracciato blu) rispetto al carico 2,5 mg di proteina mitocondriale per pozzetto (tracciato rosso). (B ) OxyGen tensione prossimi allo zero dopo ADP e iniezioni FCCP causati dal caricamento eccessivo proteina mitocondriale (3,5 mg) per bene (tracciato blu) rispetto al caricamento di una quantità ottimale (2,5 mg) di proteine ​​mitocondriali per bene (tracciato rosso). Dati rappresentano n = 3 repliche biologiche appaiati per quantità proteina mitocondriale. OCR = consumo di ossigeno Tasso; ADP = adenosina difosfato; Oligo = Oligomicina A; FCCP = carbonile cyanide- 4 - (trifluorometossi) fenilidrazone; Anti-A = Antimicina A; SUCC = succinato; ROT = Rotenone; O 2 = ossigeno; mm Hg = millimetri di mercurio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig4.jpg" /> Figura 4. Electron dosaggio a flusso. 5mM piruvato / 1 mM malato + 4 micron FCCP, elettrone fbasso mitocondriale tracciamento test respirazione come determinato dalla misurazione multi-bene di consumo di ossigeno. I valori sono espressi come media ± SD. Proteina mitocondriale caricato per bene era di 3,5 mg. Dati rappresentano n = 3 repliche biologiche appaiati. OCR = consumo di ossigeno Tasso; Anti-A = Antimicina A; Asc = ascorbato; TMPD = N, N, N &#39;, N&#39; -tetramethyl- pag fenilendiamina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Concentrazione di stock </td><td> MW </td><td> Volume finale </td><td> Messa Aggiunto </td><td> Commenti / Descrizione </td></tr><tr><td></td><td> (M) </td><td> (g / mol) </td><td> (ml) </strong&gt; </td><td> (go ml) </td><td></td></tr><tr><td> EGTA, pH 7,2 </td><td> 0.1 </td><td> 380,35 </td><td> 100 ml di 1M Tris Base </td><td> 3,801 g </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 </td><td> 238,3 </td><td> 250 ml di DIH 2 O </td><td> 59. 57 g </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> MgCl 2, esaidrato </td><td> 1 </td><td> 203,31 </td><td> 250 ml di DIH 2 O </td><td> 50.82 g </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> Piruvato pH 7,4 </td><td> 0.1 </td><td> 88.06 (14.11 M Viene come soluzione) </td><td> 40 ml di DIH 2 O </td><td> 0,283 ml di acido piruvico </td><td> Fai 1 ml aliquote e conservare a -20 ° C, rendono fresco ogni due settimane </td></tr><tr><td> Succinate pH 7,4 </td><td> 0.5 </td><td> 118.09 </td><td> 100 ml di dih 2 O </td><td> 9,4 g di suAcido ccinic </td><td> Fai 1 ml aliquote e conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Malate, pH 7,4 </td><td> 0.5 </td><td> 134.09 </td><td> 100 ml di etanolo al 95% </td><td> 6,7 g di acido malico </td><td> Rendere 200 microlitri aliquote e conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> TMPD </td><td> 0.01 </td><td> 164.25 </td><td> 10 ml </td><td> 0,0164 g </td><td> Rendere 300 microlitri aliquote e conservare a -20 ° C; Mescolare con una quantità equimolare di ascorbato per mantenere TMPD ridotto </td></tr><tr><td> Palmitoil L-carnitina cloruro </td><td> 0.01 </td><td> 436,07 </td><td> 1,14 ml di etanolo al 95% </td><td> 0.005 g </td><td> Fai 40 microlitri aliquote e conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Oligomicina A </td><td> 0.006 </td><td> 791,06 </td><td> 0,987 ml di etanolo al 95% </td><td> 0.005 g </td><td> Fai 20 microlitri aliquote e conservare a -20 ° C </td></tr&gt; <tr><td> FCCP </td><td> 0.01 </td><td> 254,17 </td><td> 3,9 ml di etanolo al 95% </td><td> 0,01 g </td><td> Fai 40 microlitri aliquote e conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 0.001 </td><td> 394,4 </td><td> 10 ml di etanolo al 95% </td><td> 0,0039 g </td><td> Conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Antimicina A </td><td> 0.005 </td><td> 548,63 </td><td> 9.12 ml di etanolo al 95% </td><td> 0.025 g </td><td> Conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> K + ADP </td><td> 0.5 </td><td> 501,32 </td><td> 3,9 ml di dih 2 O </td><td> 1,0 g </td><td> Conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Acido malico, pH 7,4 </td><td> 0.5 </td><td> 134.09 </td><td> 40 ml </td><td> 2.68 g </td><td> Rendere 200 microlitri aliquote e conservare a -20 ° C </td></tr></tbody></table><strong&gt; Tabella 1. Immagini Solutions <table border="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Reagente </td><td> Concentrazione di stock </td><td> Messa Aggiunto </td><td rowspan="2"> Molarità Finale / Percentuale </td></tr><tr><td> (M) </td><td> (go ml) </td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> - </td><td> 11.98 g </td><td> 70 MM </td></tr><tr><td> Mannitolo </td><td> - </td><td> 20.04 g </td><td> 220 mm </td></tr><tr><td> Potassio fosfato monobasico </td><td> - </td><td> 0,34 g </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2, esaidrato </td><td> 1 </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 </td><td> 1,0 ml </td><td> 2 mm </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.1 </td><td> 5.0 ml </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Essenzialmente acidi grassi Free-BSA </td><td> - </td><td> 1,0 g </td><td> 0.20% </td></tr></tbody></table> . Tabella 2. MAS Mix pH 7.4, 500 ml: 25 ml aliquote e conservare a -20 ° C * Nota: Escludere BSA per mix MAS usato per le iniezioni di analisi. <table border="0"><tbody><tr><td> Substrato media </td><td> Concentrazione finale </td><td> Quantità di magazzino (ml) </td><td> Importo del MAS * (ml) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Piruvato / Malate </td><td rowspan="2"> 10 mM / 5 mM </td><td> Piruvato: 1.000 </td><td rowspan="2"> 9 </td></tr><tr><td> Malate: 100 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Succicinate / Rotenone </td><td rowspan="2"> 10 mm / 2 micron </td><td> Succinate: 200 </td><td rowspan="2"> 10 </td></tr><tr><td> Rotenone 20 </td></tr><tr><td rowspan="3"> * Piruvato / Malato + FCCP </td><td rowspan="3"> 5 mm / 1 mm / 4 micron </td><td> Piruvato: 500 </td><td rowspan="3"> 10 </td></tr><tr><td> FCCP: 4 </td></tr><tr><td> Malate: 20 </td></tr><tr><td> Palmitoil L-carnitina / Malate </td><td> 40 mM / 1 mM </td><td> Palmitoylcarnitine: 40 Malate: 20 </td><td> 10 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Il glutammato / Malate </td><td rowspan="2"> 10 mM / 10 mM </td><td> Il glutammato: 400 </td><td rowspan="2"> 10 </td></tr><tr><td> Malate: 200 </td></tr></tbody></table> Tabella 3. substrato Soluzioni pH 7,4: Rendere fresco il giorno dell&#39;esperimento. * Soluzione test flusso di elettroni. <table border="0"><tbody><tr><td> Iniezione media </td><td> Concentrazione </td><td> Quantità di magazzino (ml) </td> &lt;td&gt; Importo del MAS (ml) </td><td> Importo iniettato nella cartuccia </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> (Dopo iniettato in lamiera) </td></tr><tr><td> ADP </td><td> 50 mm </td><td> 300 microlitri </td><td> 3 </td><td> 50 microlitri </td><td> 5,0 mm </td></tr><tr><td> Oligomicina A </td><td> 20 micron </td><td> 10 microlitri </td><td> 3 </td><td> 55 microlitri </td><td> 2.0 micron </td></tr><tr><td> FCCP </td><td> 40 mM </td><td> 12 ml </td><td> 3 </td><td> 60 microlitri </td><td> 4,0 micron </td></tr><tr><td> Antimicina A </td><td> 40 mM </td><td> 24 microlitri </td><td> 3 </td><td> 65 microlitri </td><td> 4,0 micron </td></tr></tbody></table> Tcapaci 4. Iniezioni di saggi accoppiate pH 7,4:. Rendere fresco il giorno dell&#39;esperimento. * Analisi di accoppiamento includono (ma non sono limitati a) piruvato / malato, succinato / rotenone, palmitoil carnitina / malato, e il glutammato / malato. <table border="0"><tbody><tr><td> Iniezione media </td><td> Concentrazione </td><td> Quantità di magazzino (go ul) </td><td> Importo del MAS (ml) </td><td> Importo iniettato nella cartuccia </td><td> Concentrazione finale (dopo iniettato in lamiera) </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 20 micron </td><td> 60 microlitri </td><td> 3 </td><td> 50 microlitri </td><td> 2.0 micron </td></tr><tr><td> Succinate </td><td> 50 mm </td><td> 300 microlitri </td><td> 3 </td><td> 55 microlitri </td><td> 5,0 mm </td></tr><tr><td> Antimicina A </td><td> 40 mM </td><td> 24 μ; l </td><td> 3 </td><td> 60 microlitri </td><td> 4,0 micron </td></tr><tr><td> TMPD / Ascorabte </td><td> 1 mM, 100 mM </td><td> TMPD: 300 ml </td><td> 3 </td><td> 65 microlitri </td><td> 100 micron, 10mm </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Ascorbato: 0.059 g </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 5. Iniezioni per il flusso di elettroni test pH 7,4:. Fai fresco il giorno dell&#39;esperimento <table border="0"><tbody><tr><td> Comando </td><td> Tempo (min) </td><td> # Dei cicli </td></tr><tr><td> Calibrare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aspettare </td><td> 10 minuti (per consentire targa di riscaldarsi dal passo aderenza) </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1 minuto </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> MeAsure </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Iniettare A </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1 minuto </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Misura </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Iniettare B </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1 minuto </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Misura </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Iniettare C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1 minuto </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Misura </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Iniettare D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1 minuto </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Misura </td><td> 2 min </td></tr></tbody></table> Tabella 6. Strumento Run protocollo.

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Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Utilizzo di mitocondri isolati da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per High micropiastre rendimento respiratorie Misure

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.5K Views.  Virginia Tech. The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Induzione di acuta muscolo scheletrico Rigenerazione da cardiotossina Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Preparazione e la cultura di cellule miogeniche Precursore / mioblasti primari dal muscolo scheletrico di adulti e esseri umani invecchiati

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

Isolamento delle pericelle di tipo I e II di muscoli scheletrici del mouse

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

Applicazione di stimolazione cronica per lo studio del ratto indotta da attività contrattile del muscolo scheletrico fenotipica adattamenti

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Identificazione delle cellule satelliti del muscolo scheletrico dall'immunofluorescenza con Pax7 e Laminin anticorpi

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal muscle. Mouse skeletal muscle has been shown to produce high quality X-ray diffraction patterns on third generation synchrotron beamlines providing an opportunity to link changes at the level of the genotype to functional phenotypes in health and disease by determining the structural consequences of genetic changes. We present detailed protocols for preparation of specimens, collecting the X-ray patterns and extracting relevant structural parameters from the X-ray patterns that may help guide experimenters wishing to perform such experiments for themselves.

We present detailed protocols for performing small-angle X-ray diffraction experiments using intact mouse skeletal muscles. With the wide availability of transgenic mouse models for human diseases, this experimental platform can form a useful test bed for elucidating the structural basis of genetic muscle diseases

Diffrazione a raggi X del muscolo scheletrico Murine intatto come strumento per studiare la base strutturale della malattia muscolare

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

Isolamento, cultura, caratterizzazione e differenziazione delle cellule del progenitore muscolare umano dalla procedura di biopsia muscolare scheletrica

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

Esecuzione di Xenografi muscolari scheletrici umani in topi immunodeficienti

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...