Questo protocollo è significativo perché può essere utilizzato per creare xenografti muscolari scheletrici umani, che possono essere utilizzati per modellare le malattie muscolari e per effettuare test terapeutici preclinici. Questo modello di xenoinnesto consente ai ricercatori di studiare il muscolo umano in vivo per comprendere meglio la biologia delle cellule muscolari umane e sviluppare nuovi modelli per malattie muscolari rare o acquisite. Dopo aver ottenuto una biopsia muscolare umana, posizionare il campione in una piastra di Petri di 100 x 15 millimetri contenente mezzo muscolare e utilizzare un microscopio stereo e forbici chirurgiche per rimuovere qualsiasi fascia o tessuto adiposo rimanente.
Sezionare la biopsia muscolare in pezzi di circa sette per tre per tre millimetri, facendo attenzione che le fibre siano disposte longitudinalmente all'interno del campione. Successivamente, trasferire la piastra di Petri contenente il muscolo sezionato sul ghiaccio e posizionare suture sintetiche non assorbibili in una piastra di Petri da 100 per 15 millimetri del 70% di etanolo. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedino in un topo NOD-Rag-gamma anestetizzato di otto-12 settimane, applicare un unguento agli occhi dell'animale immunodifeso e usare un trimmer per rimuovere i capelli sovrascritti dalla caviglia al ginocchio.
Quindi, applicare la crema depilatoria sulla pelle esposta per un minuto prima di disinfettare il sito chirurgico con soluzione di povidone-iodio e 70%etanolo. Per innestare il tessuto umano, prima nastro lungo la gamba del topo, e fare un'incisione dritta sul tibiale anteriore originato ai tendini distali e terminando sotto il ginocchio. Usa la dissezione smussata per separare la pelle dal tessuto muscolare e usa le forbici per fare un'incisione inferiore a 0,5 millimetri attraverso l'epimisio del muscolo anteriore della tibialis, a partire dal tendine e terminando al ginocchio.
Dopo aver tagliato il tendine distale della tibialis anteriore, afferrare il tendine con le forcep dell'iride e tirare il muscolo verso l'alto verso il ginocchio. Quindi, tagliare il tendine distale del digitorum longus estensore e tirare il digitorum longus estensore verso il ginocchio. Una volta visibile il tendine prossimale del muscolo longus peroneso, rimuovere l'estensore digitorum longus e il tibialis anteriore con le forbici.
Utilizzare una salvietta chirurgica bagnata con PBS per applicare una leggera pressione fino a raggiungere l'emostasi e infilare una sutura attraverso il tendine longo peroneso prossimale, lasciando un pezzo di filo di circa 1,5 pollici su entrambi i lati del tendine. Fare la prima metà di un nodo quadrato chirurgico a due mani senza stringere per formare un cerchio e posizionare uno xenoinnesto nel cerchio, stringendo l'anello per fissare il tessuto di innesto. Completare l'altra metà del nodo quadrato per suturare lo xenoinnesto al tendine prossimale del longus peroneo e infilare la sutura attraverso il tendine longus peroneso distale per ripetere la tecnica del nodo quadrato al tendine distale.
Quando entrambe le estremità dell'innesto sono state fissate, tirare la pelle sul muscolo xenografato, sigillare l'incisione con colla chirurgica e posizionare da due a tre graffette chirurgiche sulla colla. Quindi, posizionare il mouse in una gabbia pulita su un cuscinetto riscaldato con monitoraggio fino a piena reclinazione. Da quattro a sei mesi dopo l'intervento, posizionare un becher coperto contenente 200 millilitri di 2-metilbutano in una scatola di ghiaccio secco per almeno 30 minuti prima della raccolta dello xenografto.
Quando il 2-metilbutano si è raffreddato, confermare una mancanza di risposta al dito del dito e rimuovere i capelli sovrastante la tibialis anteriore dalla caviglia al ginocchio con un trimmer e crema depilatoria. Le suture che tengono lo xenoinnesto in posizione devono essere osservate attraverso la pelle. Fissare la gamba con del nastro adesivo e utilizzare forbici e forcep dell'iride per aprire la pelle sopra lo xenograft fino a quando entrambe le suture non vengono scoperte.
Utilizzare un bisturi per tagliare tra lo xenograft e la tibia per liberare un lato dello xenoinnesto prima di tagliare tra il muscolo longus peroneso e il muscolo gastrocnemio. Tagliare sotto la sutura distale e attraverso il tendine distale del longus peroneo, e utilizzare le forcelle dell'iride per afferrare e deviare la sutura verso il ginocchio mentre si usano le forbici per tagliare lo xenoinnesto lontano dal tessuto muscolare sottostante. Quindi, utilizzare le forbici per tagliare sopra la sutura prossimale per rimuovere lo xenograft e il longus peroneso e posizionare l'esemplare raccolto su un piccolo pezzo di cartone.
Fissare il tessuto il più vicino possibile alle suture allungando delicatamente il muscolo per garantire che l'orientamento della fibra venga mantenuto durante il processo di congelamento a scatto. Quando i perni sono saldamente in posizione, far scorrere il muscolo verso l'alto dei perni in modo che il tessuto si riposi appena sopra il cartone e agganciare congelare lo xenograft nel 2-metilbutano pre-raffreddato per una conservazione di meno 80 gradi Celsius. Uno xenoinnesto di successo dimostra una robusta rigenerazione delle miofibre umane identificate con anticorpi specifici dell'uomo.
La colorazione positiva della miosina embrionale all'interno di una proporzione di miofibre indica che il processo di rigenerazione è ancora in corso. Al contrario, una scarsa tecnica chirurgica o un campione inadeguato possono portare a una scarsa rigenerazione delle fibre muscolari. Gli xenoinnesti eseguiti da un paziente a cui è stata diagnosticata una miopatia infiammatoria idiopatica mostrano un numero moderato di miofibre umane rigenerate in raccolte di quattro e sei mesi e la colorazione della miosina embrionale persiste a sei mesi.
Le cellule infiammatorie sono presenti anche all'interno dello xenografto, come osservato dalla colorazione H ed E. Le singole dimensioni della miofibra sono simili tra i quattro e i sei mesi negli xenografti della miopatia infiammatoria idiopatica. Fibre rare che mostrano un'area di sezione trasversale superiore a 3.500 micrometri al quadrato sono osservate all'interno degli xenoinnesti ma non nelle biopsie della miopatia infiammatoria idiopatica, indicando che alcune delle miofibre negli xenografti possono rigenerarsi in un'area di sezione trasversale simile per dimensioni alle miofibre sane.
Le parti più importanti di questa procedura sono identificare tutti i tendini nella caviglia dopo che l'incisione iniziale è stata fatta e tagliare con successo attraverso l'epimisio. La competenza funzionale degli xenoinnesti può essere valutata isolando enzimaticamente singole miofibre e testando transitori di calcio o eseguendo misurazioni forzate evocate a seguito della stimolazione elettrica.
