The authors would like to acknowledge the University of Lille and the Pasteur Institute of Lille, especially Thierry Chassat and Jean-Pierre Decavel, responsible for animal housing breeding safety and husbandry. This work was supported by the "Soci&#233;t&#233; de Pathologies Infectieuses de Langue Fran&#231;aise" (SPILF).

Il comitato regionale etico regionali per esperimenti su animali ha approvato questo metodo, in accordo con cura nazionale e internazionale degli animali e l&#39;uso di linee di ricerca in fase di sperimentazione. 1. Raccolta dei campioni <ol><li> Conservazione del campione <ol><li> Raccogliere tutti i campioni e immediatamente conservare a - 20 ° C o su ghiaccio fino magazzini frigoriferi per evitare il deterioramento. Posizionare fosfato sterile salina tamponata (PBS) su ghiaccio per migliorare lavaggi bronco-alveolare (BAL) di prestazioni. </li></ol></li><li> Chirurgia <ol><li> Sterilizzare tutti apparecchi chirurgici in autoclave. NOTA: Se possibile, si consiglia di utilizzare due diversi tipi di strumenti per i passaggi addominale e toracica per evitare la contaminazione incrociata. Attrezzature dissezione richiesto è dettagliata in figura 4A </li></ol></li></ol> 2. I topi, batteriche e lievito Ceppi <ol><li> Topi Casa in conformità con l&#39;uso locale di animali in reDirettive del comitato di ricerca in un rack ventilato senza superiore a 5 topi per gabbia, con cibo e acqua ad lib, in una struttura alloggiativa livello di biosicurezza 2 a causa dell&#39;uso di livello di biosicurezza 2 microrganismi: P. aeruginosa e C. albicans. </li><li> Mantenere i ceppi batterici a -80 ° C in 40% glicerolo medio. <ol><li> Aggiungere i batteri direttamente dal magazzino congelato in provetta contenente 3 ml di sterile Luria-Bertani brodo usando un ciclo inoculazione 10 ml. Lasciare O / N a 37 ° C con scuotimento orbitale (400 rpm) il giorno prima instillazione. </li><li> Batteri Harvest per centrifugazione a 2.000 xg per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante in un appropriato smaltimento dei rifiuti a rischio biologico chiuso. Osservare bianco pellet aderenti al fondo della provetta. </li><li> Lavare e di sospendere il pellet con 5 ml di PBS. </li><li> Ripetere i passaggi da 2.2.2 a 2.2.3 una seconda volta per eseguire un secondo lavaggio. </li><li> Risospendere i batteri pellet con 1 ml di PBSe breve vortex. </li><li> Determinare la densità di inoculo con densitometro ottico a 600 nm utilizzando un misuratore di densità ottica. Una densità di 0,9 corrisponde a 10 9 CFU / ml per PAO1, diluire conseguenza. NOTA: Questo risultato deve essere ottenuto per ogni ceppo utilizzato determinando la densità di diluizioni successive di un inoculo calibrato. </li><li> Verificare l&#39;inoculo per diluizioni logaritmiche seriali e piastra 100 ml di ogni diluizione su agar viola bromocresolo (BCP) piatti e cultura O / N. Somministrare ogni topo intranasale 50 microlitri della soluzione contenente 1 x 10 8 al 2 x10 8 CFU per ml (5 x 10 6 al 1 x10 7 CFU per topo). </li></ol></li><li> Usa C. albicans SC5314 come un ceppo di riferimento. Conservare il ceppo nel 40% medio glicerolo a -80 ° C. <ol><li> Supplemento Lievito-peptone-destrosio brodo con 0,015% amikacina per evitare la contaminazione batterica e facilitare ulteriormente conteggio. </li><li> Aggiungete il lievito utilizzando 10 &amp;# 181; l &#39;inoculazione del ciclo in preparato YPD-brodo integrato con amikacina O / N a 37 ° C. </li><li> Lievito raccolta per centrifugazione a 2.000 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante in un appropriato smaltimento dei rifiuti bioharzard. Bianco pellet aderente deve osservare nel fondo della provetta. </li><li> Lavare e sospendere i batteri pellet con 5 ml di PBS e breve vortex. </li><li> Ripetere i passaggi da 2.2.2 a 2.2.3 una seconda volta per eseguire un secondo lavaggio. </li><li> Risospendere il pellet con 1 ml di PBS e breve vortex. </li><li> Determinare la dimensione dell&#39;inoculo contando su un hematocytometer Mallassez utilizzando un microscopio standard al 40x. NOTA: Concentrazione (in CFU / ml) è ottenuto utilizzando la seguente formula: (numero di lievito 5 x 10) / (numero di rettangoli griglia contati sulla hematocytometer Mallassez). </li><li> Verifica mediante diluizione logaritmica seriale 10 -5 e 10 -6 confermare che soluzione contiene 2 x 10 6 CFU / ml. </li><li> Piatto su piastre di agar YPD integrato con 0,015% amikacina. </li></ol></li></ol> 3. Airways colonizzazione di C. albicans NOTA: Dopo adattamento ambientale, i topi sono pesate due volte al giorno. <ol><li> Sotto cappa, deposito 500 ml di sevoflurano SU UN 4 cm x 4 cm di garza (tecnica open-drop) 14. <ol><li> Immediatamente collocare la garza sul pavimento di una camera di circa 750 ml di induzione. Porre immediatamente una piattaforma maglia sollevata sopra la garza per evitare il contatto diretto tra l&#39;animale e la garza. </li><li> Chiudere coperchio ermetico e aspettare 1-2 minuti per consentire la diffusione di Sevorane nella camera. </li><li> Trasferire il mouse dalla gabbia a maglie piattaforma e chiudere il coperchio. Anestesia leggera con la respirazione spontanea conservato dovrebbe essere realizzato in 30-45 secondi. </li><li> Monitor per ipotonia osservando perdita del riflesso di raddrizzamento a questo punto il mouse può essere rimosso fRom la scatola e instillato. </li></ol></li><li> Instillazione intranasale (può essere eseguita in 10 secondi da un operatore qualificato). <ol><li> Tenete il mouse con una sola mano situato sul dorso tenuto in posizione verticale (Figura 4B). </li><li> Usando il dito indice, sostenere la testa e usare il pollice per mantenere la mascella chiusa per evitare espettorazione (Figura 4C). </li><li> Come descritto al punto 2.3.8, in modo che il preparato C. soluzione albicans contiene 2 x10 6 CFU per ml per un volume di 50 ml instillato. NOTA: Il secondo punto critico è il volume infuso. Un volume inferiore a 50 ml potrebbe tradursi in una colonizzazione insufficiente o instillazione disomogeneo di vie aeree, un volume maggiore può indurre annegamento / soffocamento e di morte. </li><li> Instillare il mouse intra-nasale avvicinando la pipetta alle narici. </li><li> Pipettare una goccia 50 ml formando una bolla contenente la soluzione sulle narici, poi inalato dal spontaneously del mouse respirazione. </li><li> Posto del mouse in una zona di recupero (ad esempio, una grande gabbia nuda ben aerato con una lampada di riscaldamento in testa). I topi deve essere monitorato fino a completa risveglio. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale e riflesso di raddrizzamento. A questo punto, il mouse può essere restituito a un normale gabbia di alloggiamento. </li></ol></li></ol> 4. P. aeruginosa indotta acuta polmonare Infezione NOTA: I topi sono pesati durante i quattro giorni successivi. Normalmente, i topi aumentano di peso durante C. colonizzazione delle vie aeree albicans mediata (Figura 2A). <ol><li> Preparare la sospensione contenente P. aeruginosa il giorno della instillazione dopo O / N crescita (sezione 2.2). </li><li> Anestetizzare brevemente utilizzando inalato Sevoflurane come descritto in precedenza (punto 3.1). NOTA: Per eseguire l&#39;infezione polmonare acuto, raccomandato carica batterica sono suggeriti inTabella 1. </li><li> Instillare il mouse come descritto in precedenza (punto 3.2), con particolare attenzione al recupero post-instillazione. </li></ol> 5. Misura di Lung Injury Index <ol><li> Preparare una soluzione contenente albumina coniugati con fluoresceina. Iniettare questa soluzione 2 ore prima l&#39;eutanasia degli animali. <ol><li> Pesare 0,2 mg di albumina-FITC con l&#39;attrezzatura adeguata. </li><li> Aggiungere 0,2 mg in 1 ml di PBS. Brevemente vortice. Se non utilizzato immediatamente, mettere la soluzione in stagnola per evitare l&#39;esposizione alla luce ambientale. </li><li> Iniettare intra-peritoneally 200 ml di soluzione di albumina coniugati con fluoresceina per ogni mouse. </li></ol></li><li> Eutanasia <ol><li> Pesare i topi per gli ultimi dati di peso. </li><li> L&#39;eutanasia un singolo mouse secondo l&#39;uso locale di animali nelle linee guida del comitato di ricerca che utilizzano una iniezione intraperitoneale di overdose letale di pentobarbital: 300 ml di 5,47% pentobarbital. </li><li> Rimuovere il mouse dalla gabbia e riceve liniezione Ethal dall&#39;operatore. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, trasferire il mouse solo a un&#39;altra gabbia, nascosto da tutti gli altri animali. Osservare il mouse fino assenza di movimento. Confermare la morte è per mancanza di movimento, il movimento particolare delle vie respiratorie, la mancanza di impulsi. </li><li> Eseguire la raccolta di campioni chirurgici su animali morti, quindi senza anestesia né analgesici. </li></ol></li><li> Raccolta del campione chirurgica: fase toracica. NOTA: Per mantenere condizioni di sterilità, tutta la chirurgia viene eseguita utilizzando materiale sterile in un ambiente di livello di biosicurezza 2. <ol><li> Applicare etanolo sulla pelle. Eseguire una incisione cutanea mediana da sterno a metà addome con le forbici. Dalla linea mediana incise lungo la gabbia toracica su entrambi i lati. Ripiegare la pelle su entrambi i lati del torace per visualizzare la gabbia toracica. </li><li> Eseguire un&#39;incisione verticale della gabbia toracica ai lati salendo verso clavicole per poter reclinare l&#39;intera parete anteriore petto con la poppaum permettendo la visualizzazione perfetta del cuore e dei polmoni (Figura 5A, 5B). </li><li> Raccogliere il sangue con una siringa pre-heparined perforando il cuore accanto all&#39;arteria interventricolare. Prelevare un minimo di 500 microlitri di ottenere almeno 100 ml di plasma. Posizionare il campione di sangue su ghiaccio. </li><li> Eseguire un&#39;incisione mediana cervicale per visualizzare la trachea (Figura 5B e 5C). Sezionare con cura la fascia intorno alla trachea. Collocare una sutura dietro la trachea (Figura 5C e 5D). Successivamente la sutura sarà chiusa intorno all&#39;ago cannulating per garantire il corretto lavaggio. </li><li> Cateterizzarla trachea utilizzando l&#39;ago 20-G modificato gavage (Figura 5D e 4A). Un nodo chirurgico intorno alla trachea cannulato con la sutura precedentemente posizionato. </li><li> Per eseguire lavaggi broncoalveolare (BAL), dolcemente e progressivamente iniettare e disegnare 500 ml di PBS ghiacciato nel / dal polmone. Mettere il campione sul ice per evitare lisi cellulare. </li><li> Ripetere il passaggio 5.3.6, 3 volte per ottenere un totale di 1.500 campioni microlitri BAL fluido e piscina di lavaggio in un tubo da centrifuga da 2 ml (Figura 5E). </li><li> Rimuovere i polmoni dal petto. Collocare un segmento polmonare (dimensione dovrebbe corrispondere alla metà di un polmone o un lobo) in 1,5 ml provetta da centrifuga e memorizzare rapidamente a - 80 ° C. </li><li> Posizionare un segmento del polmone in un tubo emolisi pre-pesato contenente PBS per determinare la carica batterica e posizionarlo sul ghiaccio. </li></ol></li><li> Raccolta del campione chirurgica: fase addominale. <ol><li> Eseguire un&#39;altra incisione sul lato sinistro dell&#39;addome. Osservare la milza attraverso il peritoneo. </li><li> Rimuovere la milza e posto in un secondo tubo emolisi contenente 1 ml di PBS e posto sul ghiaccio. </li></ol></li><li> Indice danno polmonare NOTA: la membrana alveolo-capillare permeabilità viene valutata misurando coniugati con fluoresceina-albumina perdita dal compartimento vascolare al alveolo-interstVano itial. <ol><li> Centrifugare campione di sangue e fluido BAL per 10 min a 1500 x g. Raccogliere i surnatanti in nuove provette. Il pellet corrispondono a plasmacellule o BAL assunti e dovrebbero essere immessi sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 100 ml di ogni surnatante del sangue (plasma, giallo) o BAL surnatante in una piastra a 96 pozzetti trasparente (300 pozzi microlitri). Posizionare un foglio sulla piastra, se non utilizzato immediatamente. </li><li> Misurare i livelli di fluorescenza nel plasma e sovranatanti BAL utilizzando un lettore a fluorescenza micropiastre (eccitazione, 487 nm, emissione, 520 nm). </li><li> Determinare l&#39;indice di danno polmonare calcolando il rapporto di fluorescenza [(BAL surnatante surnatante / sangue) x 100]. </li></ol></li><li> Lavaggio broncoalveolare (BAL) conta cellulare differenziale. NOTA: utilizzare il pellet cellulare ottenuto dalla centrifugazione di BAL al punto 5.5.1. <ol><li> Se necessario, utilizzare un tampone di lisi rosso-cellulare. Aggiungere 500 pl di tampone di lisi eritrociti nel tubo da centrifuga contenente il cell pellet. Brevemente vortex e lasciare 10 minuti in ghiaccio. Aggiungere 500 microlitri di PBS per fermare lisi rosso-cellulare. </li><li> Celle di raccolta per centrifugazione per 10 min a 1500 x g. Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet di cellule in 1 ml di PBS sterile. Enumerare le cellule su un hematocytometer Mallassez. Utilizzando un emocitometro Conteggio di celle. Concentratevi cellule su un vetrino con un cytospin. </li><li> Cellule macchia con kit di colorazione che consenta l&#39;identificazione delle cellule e la conta (macrofagi, linfociti, dei neutrofili). </li></ol></li><li> Polmone carica batterica e la diffusione batterica NOTA: Per valutare polmone carica batterica e la diffusione di batteri, i polmoni e la milza sono stati, rispettivamente, raccolto e conservato in provette pre-pesati emolisi contenenti 1 ml di PBS (fase 5.3.9). <ol><li> Pesare i tubi emolisi contenenti 1 ml di PBS e sia polmonari o milza. Omogeneizzare i campioni con un omogeneizzatore tessuto per ottenere omogenati polmonari e omogenati milza. </li><li> Deposita 100 ml di homo tessutogenates in provette contenenti 900 ml di PBS sterile per ottenere diluizioni logaritmiche seriali. </li><li> Piastra le ultime due campioni diluiti appropriati (10 -3 e 10 -2) su entrambi BCP-agar per P. aeruginosa o agar YPD-amikacina-integrato per C. albicans polmone e della milza determinazione degli oneri. </li><li> Incubare le piastre O / N a 37 ° C. Il giorno seguente, enumerare le colonie su piastre. </li><li> Indice il risultato al peso del polmone per ottenere un CFU per grammo di polmone. Dimensioni del campione polmone non sono gli stessi, i risultati sono espressi in CFU per grammo di polmone. Formula per l&#39;indice è: [CFU] x [peso del tubo emolisi e polmoni] - [peso del tubo emolisi]. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

I modelli animali, in particolare i mammiferi, sono utili per chiarire i meccanismi complessi di interazione ospite-patogeno nei campi di immunità. Naturalmente, la necessità di informazioni ottenibili solo dai modelli animali devono essere essenziale; altrimenti, l&#39;uso di animali deve essere sostituito da modelli in vitro. Questo modello animale illustra l&#39;intuizione che può essere fornita solo da un modello animale in quanto l&#39;interazione tra gli agenti patogeni è mediata da una rispo...

Modelli animali, soprattutto topi, sono stati ampiamente utilizzati per esplorare risposte immunitarie contro gli agenti patogeni. Anche se l&#39;immunità innata e acquisita diversa tra roditori e nell&#39;uomo 7, la facilità di allevamento e lo sviluppo di fori per numerosi geni, i topi fanno un ottimo modello per studiare le risposte immunitarie 8. La risposta immunitaria è complesso e può derivare dalla interazione di un agente patogeno, la flora residente microbica e diversi immunitarie (linfociti, neutrofili, macrofagi) e non immunitarie (cellule epiteliali, cellule endoteliali) tipi cellulari 2. Studi in vitro non consentono l&#39;osservazione queste interazioni complesse e si concentrano principalmente sulle interazioni uniche cellula-patogeno. Mentre modelli animali devono essere usati con cautela e limitate a domande molto specifiche e pertinenti, modelli murini forniscono una buona conoscenza della risposta immunitaria mammifero in vivo e possono riguardare parti di importanti quesiti clinici 7. 6. Mentre ciò che costituisce un &quot;normale&quot; microbioma vie aeree rimane da stabilire, le comunità residenti sono spesso polimicrobiche, e provengono da diverse fonti ecologiche. I pazienti con malattia suppurativa cronica polmonare (fibrosi cistica, bronchectasis) o pazienti in ventilazione meccanica presentano una particolare flora dovuta alla colonizzazione delle vie aeree da parte di microrganismi dell&#39;ambiente acquisite 9. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans sono entrambi problema patogeni 5, spesso isolata insieme da campioni tracheobronchiali , e responsabile di una grave infezione opportunistica in questi pazienti, in particolare nel reparto di terapia intensiva (ICU) 4. L&#39;isolamento di questi microrganismi durante polmonite acuta nei risultati di terapia intensiva in trattamento antimicrobico contro P. aeruginosa blievito ut non sono di solito considerato patogeno in questo sito 5. le interazioni in vitro tra P. aeruginosa e C. albicans sono state ampiamente riportate e ha dimostrato che questi microrganismi possono influenzare la crescita e la sopravvivenza di loro ma studi non avrebbero potuto concludere se la presenza di C. albicans è dannosa o benefica per l&#39;host 10. Modelli di topo sono stati sviluppati per affrontare questa rilevanza di P. aeruginosa e C. albicans in vivo, ma l&#39;interazione tra i microrganismi non era il punto chiave. In effetti, il modello è stato istituito per valutare il coinvolgimento di C. albicans in risposta immunitaria, e il risultato. Un modello precedente stabilito dalla Roux et al già utilizzato un colonizzazione iniziale con C. albicans seguito da un&#39;infezione polmonare acuta indotta da P. aeruginosa. Usando il loro modello, gli autori hanno trovato un ruolo deleterio di prior C. albicans colonizzazione da 11. Tuttavia Roux et al ha utilizzato un carico elevato di C. albicans nel loro modello con 2 x 10 6 CFU / topo durante 3 giorni consecutivi. Abbiamo stabilito un modello di 4 giorni di C. albicans colonizzazione delle vie aeree, o almeno la persistenza senza danno polmonare, in questo modello C. albicans è stato recuperato fino a 4 giorni dopo una singola instillazione di 10 5 CFU per mouse (Figura 2B) 12,13. Dopo 4 giorni, è stata osservata alcuna evidenza di reclutamento di cellule infiammatorie, la produzione di citochine infiammatorie né danno epiteliale. A 24 - 48 ore, in presenza di C. picco albicans, anche se è stata osservata una risposta immunitaria innata cellulare e citochine, non vi era alcuna evidenza di danno polmonare. Sorprendentemente, i topi così colonizzato con C. albicans 48 ore prima endonasale instillazione di P. aeruginosa era attenuato infezione rispetto ai topi con P. infezione aeruginosa da solo. ioel resto, i topi esposti danno polmonare minore e una diminuzione della carica batterica 12,13. Diverse ipotesi potrebbe spiegare questo effetto benefico della colonizzazione prima con C. albicans su P. aeruginosa mediata infezione polmonare acuta. In primo luogo, un cross-talk interspecie che coinvolge ogni microrganismi sistemi quorum sensing, il P. basato homoserinelactone- Sistema aeruginosa e la base farnesolo-C. Sistema albicans, sono stati valutati. Second, C. albicans agisce come bersaglio &quot;esca&quot; per P. aeruginosa deviare patogeno da cellule epiteliali polmonari è stata studiata. Entrambe le ipotesi sono state invalidate (dati non pubblicati). La terza ipotesi è quella di un &quot;priming&quot; del sistema immunitario innato da C. albicans responsabile di una successiva risposta innata maggiore contro P. aeruginosa. Quest&#39;ultima ipotesi è stata confermata. Infatti C. colonizzazione albicans ha portato ad un adescamento di immunità innata through IL-22, secreta principalmente dalle cellule linfoidi innate, con conseguente aumento della clearance batterica e riduce il danno polmonare 12. In conclusione, il padrone di casa è un attore centrale nell&#39;interazione tra microrganismi che modulano la risposta immunitaria innata e che coinvolgono diversi tipi di cellule infiammatorie. Mentre queste interazioni immunitario complessi possono essere sezionato in vitro le ipotesi iniziali possono essere forniti unicamente da appropriati modelli in vivo. Il protocollo che segue fornisce un esempio di studio in vivo del patogeno host-mediata, che può essere adattato per altri microrganismi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="729">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sevorane, Sevoflurane</td>
			<td style="width:185px;">Abott</td>
			<td style="width:161px;">05458-02</td>
			<td style="width:167px;">250 mL plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluorescence Reader Mithras&#160; LB940</td>
			<td style="width:185px;">Berthold Technologies</td>
			<td style="width:161px;">reference in first column</td>
			<td>no comment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromo-cresol purple agar</td>
			<td style="width:185px;">Biomerieux</td>
			<td align="right" style="width:161px;">43021</td>
			<td>x20 per unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pentobarbital sodique 5,47%</td>
			<td style="width:185px;">CEVA</td>
			<td align="right" style="width:161px;">6742145</td>
			<td>100 mL plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-headed valve&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Distrimed</td>
			<td align="right" style="width:161px;">92831</td>
			<td>no comment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile inoculation loop 10 &#181;L</td>
			<td style="width:185px;">Dutscher</td>
			<td align="right" style="width:161px;">10175</td>
			<td>x1000 conditioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insuline syringes 1 mL</td>
			<td style="width:185px;">Dutscher</td>
			<td align="right" style="width:161px;">30003</td>
			<td>per 100 conditioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 positions Culture tube 8 mL</td>
			<td style="width:185px;">Dutscher</td>
			<td align="right" style="width:161px;">64300</td>
			<td>no comment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultrospec 10&#160;</td>
			<td style="width:185px;">General Electric life sciences</td>
			<td style="width:161px;">80-2116-30</td>
			<td>no comment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemolysis tubes 13 x 75 mm&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Gosselin</td>
			<td style="width:161px;">W1773X</td>
			<td>per 100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PBS - Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:185px;">Life technologies</td>
			<td align="right" style="width:161px;">10010023</td>
			<td>packaged in 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">amikacin 1g</td>
			<td style="width:185px;">Mylan</td>
			<td align="right" style="width:161px;">62516778</td>
			<td>per 10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Heparin 10 000 UI in 2 mL</td>
			<td style="width:185px;">Pan pharma</td>
			<td align="right" style="width:161px;">9128701</td>
			<td>x 10 per unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RAL 555 coloration kit</td>
			<td style="width:185px;">RAL Diagnostics</td>
			<td align="right" style="width:161px;">361550</td>
			<td>3 flacons of 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1,5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">55.526.006</td>
			<td>x&#160; 1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transparent 300 &#181;L 96-well plate</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">82 1581500</td>
			<td>no comment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yest-peptone-Dextrose Broth</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:161px;">95763</td>
			<td>in powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC-albumin</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A9771</td>
			<td>in powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Luria Bertani Broth</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">L3022</td>
			<td>in powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">25-gauge needle</td>
			<td style="width:185px;">Terumo or unisharp</td>
			<td style="width:161px;">A231</td>
			<td>x100 conditioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A78300003</td>
			<td>no comment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying microbial communities in vivo: a model of host-mediated interaction between candida albicans and pseudomonas aeruginosa in the airways

Studiare interazione ospite-patogeno ci permette di comprendere i meccanismi alla base della patogenicità microbica durante l&#39;infezione. La prognosi di accoglienza dipende dal coinvolgimento di una risposta immunitaria adeguata contro l&#39;agente patogeno 1. La risposta immunitaria è complesso e risultati di interazione degli agenti patogeni e diversi tipi cellulari del sistema immunitario o non immuni 2. Studi in vitro non possono caratterizzare queste interazioni e concentrarsi su interazioni delle cellule-patogeno. Inoltre, nelle vie respiratorie 3, in particolare nei pazienti con malattia polmonare cronica suppurativa o nei pazienti in ventilazione meccanica, le comunità polimicrobiche sono presenti e complicano interazione ospite-patogeno. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans sono entrambi problema patogeni 4, spesso isolati da campioni tracheobronchiale, e associato a gravi infezioni, soprattutto nel reparto di terapia intensiva 5. Interazioni microbiche hannostato segnalato tra questi agenti patogeni in vitro, ma l&#39;impatto clinico di queste interazioni non è chiara 6. Per studiare le interazioni tra C. Albicans e P. aeruginosa, un modello murino di C. colonizzazione albicans vie respiratorie, seguita da una P. è stata eseguita infezione polmonare acuta aeruginosa- mediata.

Come visto in precedenza durante la descrizione del protocollo, l&#39;esperimento ha bisogno di 5 giorni a completare (Figura 1: esperimento temporale). Un operatore viene sollecitato durante l&#39;intera esecuzione dell&#39;esperimento e può gestire i processi fino ad un massimo di 10 topi. Se sono necessari più animali, sono necessarie due persone in particolare per la raccolta del campione chirurgico. In effetti tutti i campioni devono essere raccolti in meno di 2 ore al fine di evitare un aumento ...

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Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Studiare comunità microbiche<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di interazione ospite-mediata tra<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nei Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

8.4K Views.  Université Lille. While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

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RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso di un terreno dell&#39;espettorato artificiale per testare l&#39;efficacia degli antibiotici contro<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In condizioni più rilevanti al polmone Fibrosi Cistica

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Modello

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

Vieni nel lato di luce: In Vivo monitoraggio di Pseudomonas aeruginosa Biofilm infezioni nelle ferite croniche in un modello murino Hairless diabetico

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Uso complementare di tecniche microscopiche e lettura di fluorescenza nello studio delle interazioni Cryptococcus-Amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Visualizzazione degli albicani Candida nel tratto gastrointestinale Murine utilizzando l'ibridazione fluorescente in Situ

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

Un modello di inoculazione ritardata dell'infezione cronica di Pseudomonas aeruginosa Wound

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

Chiarire e imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important role in the dissemination and pathogenesis of this opportunistic fungal pathogen. However, methods to visualize fungal hyphae in the GI tract in vivo are challenging which limits the understanding of environmental signals in controlling this morphogenesis process. The protocol described here demonstrates a novel ex vivo method for visualization of hyphal morphogenesis in gut homogenate extracts. Using an ex vivo assay, this study demonstrates that cecal contents from antibiotic treated mice, but not from untreated control mice, promote C. albicans hyphal morphogenesis in the gut content. Further, adding back specific groups of gut metabolites to the cecal contents from antibiotic-treated mice differentially regulates hyphal morphogenesis ex vivo. Taken together, this protocol represents a novel method to identify and investigate the environmental signals that control C. albicans hyphal morphogenesis in the GI tract.

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

The ex vivo assay described in this study using gut homogenate extracts and immunofluorescence staining represents a novel method to examine the hyphal morphogenesis of Candida albicans in the GI tract. This method can be utilized to investigate the environmental signals regulating morphogenetic transition in the gut.

Un saggio ex vivo per studiare Candida albicans Morphogenesi ifale nel tratto gastrointestinale

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.

Studiare comunità microbiche

Riepilogo

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