Il protocollo dimostrato in questo video ci permette di comprendere il ruolo dei metaboliti intestinali sulla morfogenesi ifogenesi fungina. Questa tecnica ex vivo è più o meno l'approssimazione più vicina dell'intestino per lo studio della morfogenesi ifossica fungina in un modo che nessuno studio in vitro può replicare. Questo metodo può essere applicato per studiare il ruolo dei metaboliti intestinali su altri agenti patogeni enterici.
Sezionare topi usando forbici e forcep sterilizzate sterilizzate autoclavate. Dopo l'eutanasia, fissare l'animale a una superficie di dissezione inchiodando tutti gli arti per esporre l'addome. Spruzzare la regione addominale con il 70% di etanolo per evitare che la pelliccia si attacchi a forcep, forbici o sezioni intestinali.
Utilizzare pini per pizzicare e sollevare una sezione di pelle alla base dell'addome e creare una piccola incisione attraverso la pelle e la fascia sottostante facendo attenzione a evitare di forare il cieco o la parete intestinale. Estendere questo taglio alla gabbia toracica esponendo parzialmente la cavità peritoneale, quindi effettuare un taglio a partire dal punto dell'incisione iniziale su entrambi i lati e estendendosi verso l'alto e lateralmente. Tirare questi lembi lateralmente e fissarli alla superficie di sezionazione per esporre completamente la cavità peritoneale.
Estrarre il tratto GI con le forcep mentre si usano le forbici per effettuare tagli superiori allo stomaco e nella regione distale dell'intestino crasso per garantire la raccolta della massima quantità di contenuto intestinale. Quando si rimuove il tratto GI, fare attenzione a evitare di rupturing i singoli componenti. Separare lo stomaco, l'intestino tenue, il cieco e l'intestino crasso alle estremità prossimali e distali.
Per la raccolta del contenuto intestinale da ogni sezione, effettuare una singola incisione all'estremità distale, quindi espellere manualmente il contenuto intestinale in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri con forcep. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius per i test ex vivo. Striare una nuova coltura di C.albicans SC5314 su una piastra di agar YPD e incubarla durante la notte a 30 gradi Celsius.
Il giorno successivo, scegli due o tre colonie individuali di medie dimensioni e sospendile in un millilitro di PBS. Recuperare il contenuto intestinale congelato dal congelatore e scongelarli a 25 gradi Celsius. Trasferire circa 150 milligrammi di contenuto intestinale in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e riprendarli con 150 microlitri di PBS.
Vortice il campione ad alta velocità per 30 secondi per omogeneizzare il contenuto intestinale e permettergli di sedersi a temperatura ambiente per circa un minuto. Centrifugare gli omogenei a 1.000 volte G per tre minuti, quindi trasferire il supernatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri facendo attenzione a non trasferire detriti. Dopo aver ripetuto la centrifugazione, aggiungere 10 microlitri dell'inoculo C.albicans al supernatante, mescolare bene e incubare il campione a 37 gradi Celsius per quattro o cinque ore.
Per testare l'effetto dei metaboliti esogeni sui C.albicans, aggiungere la concentrazione desiderata di metaboliti al contenuto intestinale e alla miscela PBS, quindi vortice il campione ad alta velocità per 30 secondi, lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 10 minuti ed eseguire centrifugazione e inoculazione come descritto in precedenza. Centrifugare la coltura cellulare fungina a 1.000 volte G per due minuti e scartare il supernatante. Fissare i campioni in 100 microlitri del 2%PFA per 15 minuti, quindi ripetere la centrifugazione e scartare il supernatante.
Lavare i campioni due volte con un millilitro di PBS secondo le indicazioni manoscritte, quindi incubare i campioni a temperatura ambiente in 100 microlitri di PBS con anticorpo policlonale C.albicans per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare il campione altre tre volte con PBS, lavorando in condizioni di scarsa illuminazione per evitare il fotobleaching. In una stanza buia, incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti in 100 microlitri di PBS contenenti anticorpo anti-coniglio IgG Alexa Fluor 488 a una diluizione da uno a 500.
Dopo aver lavato il campione tre volte con un millilitro di PBS, riprendarlo in 100 microlitri di PBS e trasferirlo su una piastra da 96 pozzetti per l'imaging. Immagine delle cellule fungine con un microscopio per immagini a fluorescenza utilizzando lenti obiettivo 20X e 40X e un filtro proteico fluorescente verde. Quando i C.albicans vengono coltivati ex vivo in estratti di omogenato intestinale prelevati dallo stomaco, dall'intestino tenue e dall'intestino crasso di topi non trattati e trattati con antibiotici, si sviluppa generalmente con una morfologia del lievito.
Tuttavia, se coltivato nell'estratto cecale da topi trattati con antibiotici, il C.albicans subisce prontamente la morfogenesi con conseguente lievito e forme di ife. Ciò indica che il trattamento antibiotico causa cambiamenti nell'ambiente cecale, che inducono morfogenesi ifale di C.Albicans. L'aggiunta esogena di glucosio all'omogeneato cecale dei topi trattati con antibiotici ha mostrato un massiccio sviluppo iphal ex vivo.
Questi risultati suggeriscono che l'aggiunta di metaboliti intestinali all'omogeneato cecale dei topi trattati con antibiotici regola in modo differenziato la morfogenesi dei C.albicans. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che l'ottimizzazione della diluizione del contenuto intestinale garantisce una raccolta sufficiente di metaboliti intestinali senza raccolta di detriti. Non superare una diluizione del contenuto media-intestino due a uno e mirare a una diluizione inferiore, se possibile.
Questa tecnica viene utilizzata ora per esplorare come metaboliti specifici nello sviluppo dell'intestino imparti, consentendo ai ricercatori di comprendere meglio il ruolo dei metaboliti intestinali sulla patogenesi fungina.
