Questo protocollo è significativo perché descrive un modello per l'infezione cronica della ferita pseudomonas aeruginosa senza la necessità di impianto di materiale estraneo o soppressione immunitaria. L'inoculazione ritardata con Pseudomonas aeruginosa 24 ore dopo il mento escizionale a pieno spessore protalls la rapida clearance e diffusione dei batteri, stabilendo un'infezione che dura da sette a 10 giorni. Questo modello unico sarà uno strumento utile per le indagini sulla patogenesi batterica, sulle interazioni patogene ospiti e sullo sviluppo di nuove terapie per le infezioni croniche della ferita da Pseudomonas aeruginosa.
Ad assistermi in una dimostrazione della procedura sarà Dan Liu, uno studente di medicina del Laboratorio Bollyky. Prima di iniziare la procedura, pesare un mouse anestetizzato di otto-12 settimane per ottenere un peso di base e posizionare il mouse nella posizione prona. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale, iniettare per via sottocutanea il mouse con 250 microlitri di cloruro di sodio sterile pre-riscaldato allo 0,9% su ciascun fianco.
Utilizzare un rasoio elettrico per rimuovere i capelli dalla zona dorsale del mouse e applicare un sottile strato di crema depilatoria sulla pelle esposta. Dopo 20-60 secondi, rimuovere i capelli e la lozione in eccesso con garza inumidita in acqua tiepida. Per la chirurgia della ferita escizionale a pieno spessore, utilizzare prima un ago calibro 25 per iniettare per via sottocutanea da 0,6 a un milligrammi per chilogrammo di buprenorfina a rilascio prolungato nella zona medio-dorsale del mouse e pulire il sito chirurgico in modo circolare con tre betadine sterili alternative e tamponi di alcol.
Posizionare un drap di plastica avvolgente sul sito chirurgico e allungare la pelle tesa caudally. Quando la pelle si è asciugata, utilizzare un pugno sterile per la biopsia cutanea di sei millimetri di diametro per fare un'incisione iniziale attraverso l'epidermide dorsale sinistra, seguita da una seconda incisione sull'epidermide dorsale destra. Usa le forcep per tendere la pelle dal centro dell'area della ferita delineata a sinistra e usa le forbici per asportare gli strati epidermico e dermico.
Dopo aver ripetuto l'incisione sulla zona della ferita delineata a destra per creare ferite esciciionali simmetriche, lavare entrambe le ferite con 50 microlitri di soluzione salina sterile. Quando il sito chirurgico e la pelle circostante si sono asciugati, coprire le ferite e il dorsum con una medicazione trasparente del film e posizionare il mouse in una gabbia pulita su una pastiglia riscaldante con monitoraggio fino a piena rimo clemenza. 24 ore dopo l'intervento, pesare nuovamente il topo riaestetizzato e iniettare l'animale per via sottocutanea con 250 microlitri di cloruro di sodio sterile preri riscaldato allo 0,9% su entrambi i fianchi.
Successivamente, caricare 100 microlitri della sospensione del ceppo luminescente P.aeruginosa in una siringa a cappuccio di sicurezza tubercorina da 500 microlitri dotata di un ago calibro 27 e iniettare 40 microlitri di sospensione batterica attraverso la medicazione trasparente del film in ogni ferita. Assicurarsi che la sospensione batterica sia ben miscelata e che la medicazione trasparente sia intatta. Assicurarsi di forare la medicazione trasparente una sola volta con il lato della lunetta dell'ago verso l'alto.
Quindi riportare il mouse nella sua gabbia su una pagina di riscaldamento con monitoraggio e fornire pasta di integratori alimentari ipercalorici sandwich tra pellet alimentari sul pavimento della gabbia. Placcare l'inoculo rimanente su una piastra di agar LB e contare le colonie per confermare il numero di batteri che sono stati somministrati. Per l'imaging in vivo delle ferite infette, seguire il livello di biosicurezza due protocolli di contenimento per il trasporto dei topi da e verso lo strumento di imaging e posizionare il topo anestetizzato nella posizione prona all'interno della camera di imaging.
Nel software di imaging, impostare il tempo di esposizione, il binning, l'f-stop e il campo visivo in base alle esigenze dell'esperimento. Successivamente, creare una regione di interesse nel sito della ferita e misurare il flusso medio rilevato nei fotoni al secondo. Per misurare lo sfondo, creare un'area di interesse su un'area casuale sulla piattaforma di imaging e sottrarre il numero di sfondo dei fotoni al secondo.
Alla fine dell'esperimento, in un armadietto di sicurezza bio, utilizzare forbici sterili e forcep per asportare i letti avvolti e posizionare ogni letto in un millilitro di PBS sterile in un tubo di polipropilene da 1,5 millilitri. Tritare il tessuto della ferita con le forbici e incubare i pezzi di tessuto su uno shaker a quattro gradi Celsius in 300 rotazioni al minuto per due ore. Al termine dell'incubazione, vortice per ogni tubo per 10 secondi prima di diluire serialmente l'effluente batterico in PBS e placcare l'effluente batterico diluito sull'agar LB per quantificare il carico batterico.
Questa immagine rappresentativa ottenuta utilizzando un sistema ottico di imaging dimostra che questo modello si traduce in luminescenza rilevabile. In questo esperimento, l'infezione raggiunse il picco al terzo giorno dopo l'inoculazione e persistette sette giorni dopo l'inoculazione basata sia sulla bioluminescenza che sul conteggio delle colonie. La coltura dei batteri isolati dalla ferita dimostra inoltre che le unità quantificate di formazione della colonia per ferita sono correlate alla luminescenza rilevata.
Sebbene ci sia una rapida perdita di peso iniziale immediatamente dopo l'iniezione, le iniezioni saline e la nutrizione supplementare possono riportare i topi al loro peso iniziale. La dose calcolata di inoculazione di cui il 50% delle ferite sarà sostanzialmente infettata è stata determinata in circa 7,7 volte 10 alla seconda colonia formando unità per millilitro. Dosi superiori a uno per 10 alla quarta colonia che forma unità per millilitro si traducono in un tasso di infezione del 100%.
Vari trattamenti topici e sistemici possono essere applicati dopo le procedure di mento e inoculazione per indagare nuove potenziali terapie per Pseudomonas aeruginosa. Tutto il lavoro con Pseudomonas aeruginosa e topi infetti deve essere condotto con precauzioni di sicurezza BSL-2 in conformità con le linee guida istituzionali del comitato per la biosicurezza e l'uso degli animali del ricercatore.
