La coltura di espianto è una tecnica in cui interi tessuti e organi vengono rimossi, o "espiantati", da un feto o da un embrione e vengono coltivati fuori dal corpo, o"ex vivo". Questi metodi forniscono una finestra unica per aiutarci a comprendere il processo di sviluppo consentendo osservazioni dirette della crescita di organi e tessuti, un processo chiamato organogenesi.
Questo video esaminerà i principi di base della cultura di espianto, delineerà i passaggi chiave della procedura, discuterà le manipolazioni tipiche e fornirà applicazioni specifiche di questa tecnica negli studi sullo sviluppo.
Prima di descrivere come colturare gli espianti, esaminiamo alcuni dei principi alla base di questa tecnica.
La coltura di espianto è applicabile a una varietà di tessuti embrionali da una vasta gamma di organismi. Questa tecnica è ideale per lo studio dello sviluppo degli organi, in quanto i cambiamenti strutturali, noti come morfogenesi, possono essere osservati direttamente in funzione del tempo. Inoltre, i tessuti possono essere trattati con molecole sperimentali per determinare il loro impatto sullo sviluppo. Inoltre, quando la coltura di espianto è combinata con strumenti molecolari per alterare l'espressione genica e la microscopia a fluorescenza, diventa un potente strumento per affrontare le questioni della differenziazione cellulare e tissutale.
Successivamente, esaminiamo un protocollo per la coltura di espianto dei tessuti dei mammiferi.
Per iniziare la procedura, gli embrioni vengono rimossi da un roditore incinta eutanasizzato. Dopo la rimozione delle membrane circostanti, l'embrione viene isolato. I tessuti o gli organi di interesse vengono quindi isolati dall'embrione estratto e trasferiti in piastre per la crescita. Vengono aggiunti mezzi contenenti antibiotici e le piastre vengono coltivate in un incubatore impostato per 37 ° C. Gli espianti di tessuto sono ora pronti per la manipolazione.
Una volta stabilite le colture di espianto, è possibile eseguire diversi tipi di manipolazioni.
Ad esempio, il tessuto espiantato può essere geneticamente manipolato per testare il ruolo di un gene di interesse su uno specifico processo di sviluppo. Ciò può essere ottenuto introducendo materiale genetico nel tessuto utilizzando tecniche come l'elettroporazione, in cui un campo elettrico viene utilizzato per guidare il DNA iniettato nelle cellule vicine.
Gli espianti sono anche frequentemente usati per testare i ruoli che le molecole di segnalazione, come i fattori di crescita, svolgono nell'organogenesi. Il tessuto coltivato in vitro è particolarmente utile per questi tipi di studi perché il trattamento con il composto è semplice come aggiungerlo ai mezzi di coltura. Tuttavia, piccole perle imbevute di composti sperimentali possono anche essere impiantate nel tessuto per un approccio più controllato al trattamento chimico.
Indipendentemente dall'approccio, uno dei principali vantaggi della tecnica di espianto è che gli effetti delle manipolazioni sperimentali possono essere facilmente visualizzati in tempo reale, utilizzando la microscopia leggera o fluorescente.
Ora, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni specifiche della coltura ex vivo.
In primo luogo, gli espianti rappresentano un sistema modello in cui lo sviluppo del tessuto può essere visualizzato direttamente. Ad esempio, questi ricercatori hanno rimosso il pancreas in via di sviluppo da topi embrionali e lo hanno coltivato su piatti con fondo di vetro per migliorare l'imaging.
Lo sviluppo del tessuto può essere osservato al microscopio ottico, ma l'uso di tessuto transgenico che esprime marcatori fluorescenti fornisce una visione ancora più dettagliata dei processi di sviluppo, come il germogliamento dei tubuli. Il tessuto espiantato può anche essere sottoposto a immunostaining, che consente ai ricercatori di monitorare lo sviluppo di specifici tipi di cellule, come le cellule produttrici di insulina mostrate qui in blu e verde.
Un'altra applicazione delle colture di espianto è quella di aiutare a decifrare il ruolo di molecole specifiche, come i fattori di crescita, nell'organogenesi.
Qui, gli espianti polmonari fetali sezionati da embrioni di topo E12.5 sono stati coltivati in presenza o assenza di un fattore di crescita per un massimo di 48 ore. I risultati indicano che questo fattore di crescita inibisce la formazione delle vie aeree nel polmone fetale.
Infine, gli espianti da embrioni precoci possono essere utilizzati per determinare i meccanismi che controllano l'espressione genica durante le prime fasi dell'embriogenesi.
Questi ricercatori hanno espiantato due diversi tipi di cellule dallo stadio a 16 cellule degli embrioni di rana: quelli che sono destinati a formare strutture dorsali e quelli che contribuiranno alle strutture ventrali. Gli espianti sono stati lasciati sviluppare per circa un giorno prima della colorazione per caratterizzare il modello di espressione di un gene specifico per il tessuto dorsale.
Poiché l'espressione di questo gene è stata osservata solo negli espianti della regione dorsale, si è concluso che i programmi di espressione genica erano codificati in queste cellule embrionali, piuttosto che essere diretti da interazioni cellula-cellula che si verificano più tardi nello sviluppo.
Ora abbiamo visto i sistemi di coltura di espianto e osservato come può essere utilizzato negli studi sullo sviluppo. Questa tecnica è un potente strumento che facilita la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base dello sviluppo animale. Grazie per l'attenzione!
