A cultura explanta é uma técnica na qual tecidos e órgãos inteiros são removidos, ou "explantados", de um feto ou embrião e são cultivados fora do corpo, ou "ex vivo". Esses métodos fornecem uma janela única para nos ajudar a entender o processo de desenvolvimento, permitindo observações diretas do crescimento de órgãos e tecidos - um processo chamado organogênese.
Este vídeo examinará os princípios básicos da cultura explant, delineará etapas-chave do procedimento, discutirá manipulações típicas e fornecerá aplicações específicas dessa técnica em estudos de desenvolvimento.
Antes de descrever como cultivar explanações, vamos rever alguns dos princípios por trás dessa técnica.
A cultura explanta é aplicável a uma variedade de tecidos embrionários de uma ampla gama de organismos. Essa técnica é ideal para o estudo do desenvolvimento de órgãos, pois mudanças estruturais, conhecidas como morfogênese, podem ser observadas diretamente em função do tempo. Além disso, os tecidos podem ser tratados com moléculas experimentais para determinar seu impacto no desenvolvimento. Além disso, quando a cultura da explant é combinada com ferramentas moleculares para alterar a expressão genética e a microscopia de fluorescência, torna-se uma poderosa ferramenta para abordar questões de diferenciação celular e tecidual.
Em seguida, vamos rever um protocolo para a cultura explant de tecidos mamíferos.
Para iniciar o procedimento, os embriões são removidos de um roedor grávida eutanizado. Após a remoção das membranas circundantes, o embrião é isolado. Os tecidos ou órgãos de interesse são então isolados do embrião extraído e transferidos para placas de crescimento. São adicionadas mídias contendo antibióticos e as placas são cultivadas em uma incubadora com 37°C. Explantas teciduais estão prontas para manipulação.
Uma vez estabelecidas culturas de explant, vários tipos de manipulações podem ser realizadas.
Por exemplo, o tecido explantado pode ser geneticamente manipulado para testar o papel de um gene de interesse em um processo específico de desenvolvimento. Isso pode ser conseguido introduzindo material genético no tecido usando técnicas como eletroporação, na qual um campo elétrico é usado para conduzir DNA injetado em células próximas.
Explantas também são frequentemente usadas para testar os papéis que as moléculas de sinalização, como fatores de crescimento, desempenham na organogênese. O tecido cultivado in vitro é especialmente útil para esses tipos de estudos porque o tratamento com o composto é tão simples quanto adicioná-lo à mídia cultural. No entanto, pequenas contas encharcadas em compostos experimentais também podem ser implantadas no tecido para uma abordagem mais controlada ao tratamento químico.
Independentemente da abordagem, uma grande vantagem da técnica de explant é que os efeitos das manipulações experimentais podem ser facilmente visualizados em tempo real, usando microscopia leve ou fluorescente.
Agora, vamos olhar para algumas aplicações específicas da cultura ex vivo.
Em primeiro lugar, as explantas representam um sistema modelo no qual o desenvolvimento de tecidos pode ser diretamente visualizado. Por exemplo, esses pesquisadores removeram o pâncreas em desenvolvimento de camundongos embrionários e o cultivaram em pratos de fundo de vidro para melhor imagem.
O desenvolvimento do tecido pode ser observado por microscopia leve, mas o uso de tecido transgênico expressando marcadores fluorescentes fornece uma visão ainda mais detalhada dos processos de desenvolvimento, como o brotamento de túbulos. O tecido explantado também pode ser submetido à imunostenção, o que permite aos pesquisadores monitorar o desenvolvimento de tipos celulares específicos, como as células produtoras de insulina mostradas aqui em azul e verde.
Outra aplicação das culturas explant é ajudar a decifrar o papel de moléculas específicas, como fatores de crescimento, na organogênese.
Aqui, as explanações pulmonares fetais dissecadas a partir de embriões de camundongos E12,5 foram cultivadas na presença ou ausência de fator de crescimento por até 48 horas. Os resultados indicam que esse fator de crescimento inibe a formação das vias aéreas no pulmão fetal.
Finalmente, explantas de embriões primitivos podem ser usadas para determinar os mecanismos que controlam a expressão genética durante os primeiros estágios da embriogênese.
Esses pesquisadores explanaram dois tipos de células diferentes do estágio de 16 células de embriões de sapo: aqueles que estão destinados a formar estruturas dorsais, e aqueles que contribuirão para estruturas ventrais. As explantas foram autorizadas a desenvolver-se por cerca de um dia antes da coloração para caracterizar o padrão de expressão de um gene específico do tecido dorsal.
Uma vez que a expressão desse gene foi observada apenas em explantas da região dorsal, concluiu-se que programas de expressão genética foram codificados nessas células embrionárias, em vez de serem dirigidos por interações célula-células que ocorrem posteriormente em desenvolvimento.
Agora vimos sistemas de cultura explant e observamos como ele pode ser usado em estudos de desenvolvimento. Esta técnica é uma ferramenta poderosa que facilita nossa compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento animal. Obrigado por assistir!
