Name: the complete and updated "rotifer polyculture method" for rearing first feeding zebrafish
Uploaded: 2016-01-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish at JoVE.com

La cura e l&#39;uso di pesce generato per risultati rappresentativi descritti in questo protocollo è stata eseguita in piena conformità con le linee guida stabilite dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale presso Hospital di Boston dei bambini, protocollo # 14-05-2673R.

1. Rotifer Cultura <ol><li> I componenti di base di un sistema di coltura utilizzando un Vessel 100 L Cultura <ol><li> Raccogliere tutti i componenti per l&#39;installazione coltura di rotiferi. La configurazione coltura di rotiferi è costituito da un recipiente di coltura (CV) a crescere i rotiferi; una nave simile a mantenere rotiferi feedout (feedout vaso cultura, FCV); un vaso a fondo tondo cova (feed Reservoir, FR) per la conservazione della miscela di alimentazione alghe (AFM); una riserva d&#39;aria (AS) per aerare il CV, FCV e la FR; una pompa peristaltica con un temporizzatore di dosaggio (PMT) per controllare la consegna dei mangimi alghe nel CV e FCV; e un filtro antiparticolato filo (FPF) che si trova all&#39;interno del curriculum. NOTA: L&#39;elenco completo delle forniture e dei componenti è previsto nella lista dei materiali. </li></ol></li><li> Configurazione <ol><li> Elevare il CV e FCV su un supporto o un tavolo in modo che le culture possono essere facilmente raccolte tramite uno scarico montaggio in un cont collezioneAiner (Figura 1). Utilizzare tubi flessibili di alimentazione dell&#39;aria per collegare i AS ad una lunghezza di tubo rigido in ciascun recipiente di coltura. Assicurarsi che il tubo è abbastanza lungo per fornire aria al fondo del CV o FCV. </li><li> Utilizzare una linea di aria piccola capacità per collegare gli AS ad una lunghezza di tubo rigido che si estende fino al fondo della FR che contiene l&#39;AFM. Installare una valvola in ciascuna linea d&#39;aria per regolare il flusso d&#39;aria. Collegare il FR alla PMT con tubo di erogazione mangime, ed eseguire il tubo dalla PMT in un foro nel lato del CV / FCV, vicino alla parte superiore. Figura 1. </li></ol></li><li> Avviare <ol><li> Riempire il recipiente di coltura al 90% del volume disponibile con osmosi inversa (RO). Se RO non è disponibile, utilizzare acqua pulita e comunale senza cloro; tuttavia, una valutazione del rischio biosicurezza deve essere eseguita per garantire che nessun microrganismi potenzialmente patogeni sono presenti in acqua di fonte. NOTA: Tale analisi può essere effettuatada qualsiasi laboratorio di prova d&#39;acqua qualificato. </li><li> Dosare l&#39;acqua recipiente di coltura con sale acquario per raggiungere una salinità di 15 g / L. Impostare il flusso d&#39;aria nel recipiente in modo che mantenga una &quot;bollire rolling&quot;, e quindi aggiungere lentamente la quantità misurata di sale al recipiente di coltura fino a completa dissoluzione della aerazione. Continuare aerare l&#39;acqua per&gt; 1 ora per assicurarsi che sia completamente ossigenato. </li><li> Rendere la miscela di alimentazione alghe. Per 3 L di pulito, dechlorinated fresco (0 ppm) acqua aggiungere 100 g di NaHCO3 e 100 g di ammoniaca neutralizzatore (hydroxymethylsulfonate sodio). Questo ultimo reagente offre l&#39;ulteriore vantaggio di neutralizzare qualsiasi cloro residuo da acqua di rubinetto o candeggina residui di sanificazione delle apparecchiature cultura. E &#39;fondamentale per garantire che questi composti sono completamente sciolti. Poi aggiungere 1 L di alghe concentrato (biomassa peso secco ~ 15%). Aggiungere la miscela di alimentazione per la FR e conservare a 4 ° C. </li><li> Aggiungere una cultura antipasto di 5-10.000.000 <em&gt; rotiferi Brachionus plicatilis al CV contenente 15 g di acqua di salinità / L aerato. Se i rotiferi sono stati refrigerati durante il trasporto o la conservazione, dovrebbero essere gradualmente (durante 30 min o più) acclimatati alla temperatura dell&#39;acqua nel recipiente di coltura (25 - 27 ° C). </li><li> Accendere il PMT e iniziare a pompare il feed alghe nel vaso coltura di rotiferi. Utilizzando la funzione timer del PMT, impostare la portata di miscela di alimentazione alghe in modo che ~ 1,6 ml di miscela di alimentazione alghe viene consegnato per milione di rotiferi nella cultura, al giorno. Distribuire le alimentazioni in piccole porzioni a intervalli regolari nel corso di un periodo di 24 ore; la più frequente delle alimentazioni, meglio è. </li><li> Calibrare la portata della pompa agendo manualmente sulla PMT per un determinato periodo (ad esempio, 1 min) e raccogliere le alghe che esso pompa durante questo intervallo in un cilindro o cilindro graduato. Ad esempio, se le dosi PMT 5 ml di alghe in 1 min, quindi la dose sarebbe5 ml alghe / min. </li><li> Calcolare il tasso di alimentazione giornaliera richiesta moltiplicando il numero di rotiferi presenti, in milioni, di 1,6 ml. Ad esempio, una cultura rotifero con una dimensione della popolazione di 100 milioni di rotiferi richiederebbe ~ 160 ml di mangime al giorno (100 x 1,6 ml). </li><li> Impostare la PMT per dosare il fabbisogno alimentare giornaliero totale a intervalli regolari durante un periodo di 24 ore. Ad esempio, la consegna di una quantità di trasporto giornaliera totale di 160 ml potrebbe essere consegnato in porzioni volta ogni 3 ore in un periodo di 24 ore utilizzando una serie PMT con un tasso pompa dosatrice di 5 ml / min per 4 min, 8 volte al giorno (5 ml / min x 4 = numero minimo di 20 ml x 8 poppate = 160 ml). </li><li> Lasciare che la cultura a crescere fino a che non genera la popolazione richiesta, di solito per 48-72 ore, prima della raccolta. A 24 ore dopo l&#39;avvio, aggiungere i filtri antiparticolato filo interdentale al recipiente di coltura ed iniziare la normale manutenzione. </li></ol></li><li> Manutenzione NOTA: La cultura funziona su base continua e richiede routine manutenzione che idealmente dovrebbe essere eseguita alla stessa ora ogni giorno, nella seguente sequenza. <ol><li> Riempire la FCV al 90% del volume disponibile con pulito, senza cloro acqua dolce, dosata con 10 g / L di sali acquario. Assicurarsi che l&#39;acqua è ben miscelati, e che tutto il sale è completamente dissolto. Impostare il flusso d&#39;aria nel recipiente in modo che mantenga una &quot;bollore&quot;. Misurare la salinità con un rifrattometro e garantire che la salinità è di 10 g / L. E &#39;fondamentale per raggiungere questo obiettivo e di non superarla. </li><li> Assaggiate i rotiferi del CV: Assicurarsi che la cultura è ben miscelato, quindi raccogliere 3 campioni di 2-3 ml con una pipetta di trasferimento o autopipettor, provenienti da diverse parti della cultura. Combinare questi campioni in un tubo o fiala di dimensione conveniente (ad esempio, 10 ml). </li><li> Transfer 1 - 2 ml del campione combinato su una capsula di Petri in modo che possa essere visualizzato sotto un microscopio da dissezione. Controllare la qualità della cultura (nuoto comportamentorotiferi, presenza di uova staccati, contaminando protozoi). </li><li> Immobilizzare il rotiferi del campione combinato restante aggiungendo 100 ml di 50% soluzione di iodio Lugol al campione. In pochi secondi dopo l&#39;aggiunta dei Lugol, osservare i rotiferi per fermare il nuoto. Ora, facilmente contare i rotiferi. NOTA: L&#39;etanolo, candeggina diluita, o aceto possono essere utilizzati al posto di Lugol. Aceto (2 gocce / 10 ml) ha il vantaggio di essere non pericolosi, senza perdere forza nella memoria come soluzioni di lavaggio e di iodio può, e non fare il contratto rotiferi, così la corona delle ciglia e il &quot;piede&quot; rimanere estesa e la animali aspetto più naturale. </li><li> Assicurarsi che il campione è ben miscelato (rotiferi immobilizzate si depositano rapidamente), poi prendere rapidamente un ml sottocampione ~ 2 in una pipetta di plastica e dispensare 1 ml in una diapositiva che conta Sedgewick-Rafter (20 x 50 1 mm quadrati) (Figura 2 ). Utilizzando un microscopio da dissezione o composto, contare i rotiferi intatti e il tNumero otale di uova attaccate a queste rotiferi (Figura 2). Conte come gran parte della zona diapositiva come necessario contare ~ 100 rotiferi. Calcolare il numero di rotiferi per ml, e registrare questo in un foglio di calcolo o giornale di bordo. </li><li> Harvest ~ 30% del volume dei rotiferi nel CV: Rimuovere l&#39;alimentazione dell&#39;aria e filtro filo, aprire lentamente la valvola sul fondo del CV e permettere all&#39;acqua di fluire in un collettore di plancton con uno schermo di maglia 53 micron. Raccogliere l&#39;acqua che scorre fuori dal fondo del collettore dopo il filtraggio in un secchio o scarico. Utilizzare un dolce a moderato flusso per evitare di danneggiare i rotiferi. Non permettere che i rotiferi asciugare sullo schermo. </li><li> Per motivi di coerenza, è opportuno stabilire il FCV con un numero standard di rotiferi ogni giorno. Pertanto, sulla base del noto volume di CV densità rotifero e il raccolto, regolare il volume totale FCV per ottenere una densità finale coerente (ad es., 1.500 rotiferi / ml). Aggiungere il roti raccoltofers al FCV: trasferire delicatamente i rotiferi dallo schermo raccolta utilizzando una bottiglia di lavaggio riempita con acqua salata pulita (10-15 g / l). Capovolgere lo schermo sopra la FCV e lavare i rotiferi in FCV con una leggera corrente di acqua salata. Avviare la PMT per fornire alimentazione (~ 1,57 ml per milione di rotiferi al giorno) per il FCV. </li><li> Scrub l&#39;intero all&#39;interno del CV con una spazzola di nylon morbido e pulito o pad macchia. </li><li> Preparare una nuova miscela di 15 g di acqua / L aggiungendo la quantità appropriata di sale ad una quantità misurata di acqua pulita RO in un secchio da 5 galloni per sostituire il volume di acqua persa per raccogliere. Aggiungere il sale all&#39;acqua nel secchio e mescolare vigorosamente fino a completa dissoluzione, e quindi aggiungere al CV. </li><li> Usando uno spray ad alta pressione in un lavandino, lavare il filtro filo fino a quando è libero di detriti, e poi tornare al CV. </li><li> Regolare velocità di avanzamento di alghe consegnato al CV cambiando la durata di ogni evento di dosaggio, in base al conteggio giornaliero di rotiferi / ml.Utilizzare i calcoli forniti al punto 1.3.8, al di sopra di determinare la giusta quantità di mangime da consegnare. </li><li> Circa 24 ore dopo, ripetere il processo. Avviare raccogliendo i rotiferi rimanenti nel FCV (che non erano necessari per il giorno precedente) nello stesso modo precedentemente descritto (punti 1.4.2 - 1.4.10). Concentrarli in 2 litri di acqua fresca e pulita senza cloro (5 g / l di sale). Questi possono essere conservati a 4 ° C come alimentazione di riserva, o utilizzati per alimentare le fasi successive di pesce, al di là di quanto descritto in questo protocollo. NOTA: Questo protocollo permette fino a 2 - 3 giorni di ridotta manutenzione cultura (con alimentazione automatica normale), perché i rotiferi nel curriculum può tollerare l&#39;omissione dei raccolti senza gravi conseguenze. </li></ol></li></ol> 2. Policoltura <ol><li> Impostare <ol><li> Raccogliere embrioni di zebrafish da un evento di deposizione delle uova versando embrioni generati attraverso un colino da tè e poi risciacquare delicatamente con fis sterilih di acqua (o di qualsiasi altra fonte non contaminata della soluzione opportunamente condizionata, ad esempio, di media embrione, E3, etc.) da un flacone di lavaggio in capsule di Petri. </li><li> Incubare gli embrioni a 25 - 28 ° C in piastre Petri ad una densità di 40 - 50 embrioni per piastra per 5 giorni. </li><li> Iniziare la fase polyculture il giorno 5 dopo la fecondazione, o quando più del 90% delle larve schiuse attivamente nuotando nella colonna d&#39;acqua. </li></ol></li><li> Inoculazione <ol><li> Aggiungere 500 ml di coltura di rotiferi direttamente dal FCV ad un serbatoio vivaio 3,5 L; inclusione di acqua coltura di rotiferi prevede algale che mantiene il contenuto nutrizionale dei rotiferi durante policoltura. </li><li> Delicatamente versare le larve da una capsula di Petri nel serbatoio vivaio. Assicurarsi che nessun larve rimangono nel piatto. </li><li> Aggiungere 500 ml di acqua pulita e pesci condizionata da un sistema di ricircolo o fonte d&#39;acqua dedicata al serbatoio per raggiungere un volume finale di 1 litro e il s finalealinity di 5 g / L. NOTA: Questo salinità è fondamentale perché la sopravvivenza delle larve zebrafish sarà influenzato negativamente se la salinità è&gt; 7 g / L e di sopravvivenza rotiferi sarà influenzato negativamente se la salinità &lt;2 g / l. </li></ol></li><li> Fase policoltura NOTA: La fase di policoltura dovrebbe durare per un massimo di 4 giorni post-inoculazione (per un totale di 5 giorni, corrispondenti a 5-9 giorni dopo la fecondazione). <ol><li> Osservare il serbatoio policoltura almeno una volta al giorno durante questo periodo per assicurare che rotiferi e pesce sono presenti e in crescita. Assicurarsi che i rotiferi sono visibili in tutta la colonna d&#39;acqua. Assicurarsi che i le fishs sono visibili anche all&#39;interno della colonna d&#39;acqua, nuotando tra i rotiferi. </li><li> Inizia flusso d&#39;acqua normale attraverso il serbatoio. Posizionare uno schermo o deflettore attraverso la porta di scarico per garantire che le larve non vengono trasferite dal serbatoio. NOTA: Al termine di questa fase, i pesci saranno abbastanza grande da consumare prede più grandi come Artemiaelementi del feed naupli o trasformati nella gamma di dimensioni di 75-125 micron. NOTA: Le dinamiche demografiche rotifero all&#39;interno di un serbatoio di polyculture rappresentante sono stati misurati mediante campionamento / conteggio rotiferi dal serbatoio allo stesso modo come descritto ai punti 1.4.2 - 1.4.5. Ciò è stato fatto una volta al giorno a partire dall&#39;inizio della fase polyculture finché fu completata. </li></ol></li></ol>

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CE Henry è impiegato da Reed Maricoltura, Inc., una società che fornisce rotiferi, concentrati di alghe, e altre forniture ai mercati hobbysti di acquacoltura e di pesce.

La corretta attuazione del metodo policoltura rotiferi per l&#39;alimentazione precoce zebrafish larvale richiede protocolli efficaci per due compiti: la creazione e il mantenimento di un sistema di coltura di rotiferi continuo a nutrire i pesci, e la coltura di prima alimentazione larve zebrafish con rotiferi nella stessa vasca. La messa a punto di un sistema di produzione di acqua salata rotifero continua per i laboratori di zebrafish prima descritti da Lawrence e co-autori di 14</sup...

Il pesce zebra (Danio rerio) è un preminente animale da laboratorio utilizzato in un numero crescente di discipline scientifiche, compreso ma non limitato alla genetica dello sviluppo, la tossicologia, il comportamento, l&#39;acquacoltura, la biologia rigenerativa, e la modellazione di molte malattie umane 1 - 5. Anche se la specie è relativamente facile da mantenere in laboratorio, ci sono una serie di problemi di gestione associati con la loro cultura 6. Il più importante di questi è allevamento larvale, soprattutto quando il pesce prima comincia ad alimentare a seguito di inflazione della vescica gas 7. In normali, condizioni controllate, questo evento si verifica dello sviluppo a ~ 5 giorni dopo la fecondazione (DPF), con i seguenti 3 - 5 giorni di crescita particolarmente critici 7. La difficoltà tecnica centrale durante questa fase è quello di soddisfare adeguatamente le esigenze nutrizionali della prima larve alimentazione - articoli mangimi devono essere di dimensioni appropriate, Digestible, attraente, e disponibile su una base quasi continuo, senza creare eccessivi sprechi in vasche di coltura. Storicamente questo è stato realizzato tipicamente fornendo numerose piccole quantità di mangime per pesci in vasche, insieme con 8,9 scambio dell&#39;acqua routine. Mentre questi metodi sono in una certa misura di successo, sono inefficienti, richiedono ingressi del lavoro elevati, e restituiscono solo variabili e tassi limitati di crescita e la sopravvivenza 10. In natura, le larve si nutrono di pesce zebra presumibilmente abbondante piccolo zooplancton presente nella colonna d&#39;acqua 11. Per questo motivo, i protocolli larviculture che incorporano i feed live come Paramecium, rotiferi, Artemia e sono in genere più efficiente 7. Nel 2010, le migliori e co-autori hanno dimostrato che era possibile coltivare zebrafish larvale in acqua salmastra statica con rotiferi acqua salata per i primi 5 giorni di alimentazione esogena 12. Questo approccio, che sfruttarees l&#39;elevata produttività naturale delle culture di rotiferi a fornire ampio, preda altamente nutrienti senza inquinare l&#39;acqua, rendimenti molto elevati tassi di crescita delle larve e la sopravvivenza con il contributo di lavoro basso 12,13. Negli ultimi anni, un numero crescente di laboratori di tutto il mondo hanno adottato varianti di questo protocollo, e molti sono ora coltura rotiferi in modo continuo per supportare i sistemi vivaio 14. Nel corso degli ultimi anni, sia per i metodi di rotiferi / policoltura zebrafish e la produzione rotiferi sono stati raffinati e migliorato per diventare più standardizzati e facilmente scalabile. Questo articolo fornisce istruzioni passo-passo per 1) la produzione rotiferi continuo e robusto e 2) l&#39;istituzione del / sistema di policoltura zebrafish rotifero utilizzato per sostenere una crescita robusta dei pesci per i primi 5 giorni di alimentazione esogena.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Rotifer Culture Infrastructure&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 L Culture Vessel</td><td>Aquaneering</td><td>Custom</td><td>Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve</td></tr><tr><td>5 Gallon Culture Bucket Kit</td><td>Reed Mariculture</td><td>CCS Starter Kit</td><td>Small volume culture vessel for small facilities</td></tr><tr><td>Rigid Clear Tubing 1/2&quot; O.D., 36&amp;rdquo;</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>16025</td><td>Rigid clear tubing for air delivery</td></tr><tr><td>Mesh tube</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>RT444X</td><td>Mesh tube support for floss filter</td></tr><tr><td>Rotifer Floss</td><td>Reed Mariculture</td><td>Rotifer floss 12&amp;rdquo; x 42&amp;rdquo;</td><td>Particulate waste trap</td></tr><tr><td>Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD</td><td>Grainger</td><td>38M003&amp;nbsp;</td><td>Metering pump with timer for dosing feed to rotifers</td></tr><tr><td>Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture)</td><td>Coral Vue</td><td>SKU: IC-LQD-DSR</td><td>Metering pump with timer for dosing feed to rotifers</td></tr><tr><td>Silicone Tubing&amp;nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td></td><td>Tubing for algae delivery to rotifer vessel</td></tr><tr><td>Rigid Clear Tubing &quot; O.D.,36&amp;rdquo;</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>16025</td><td>Rigid clear tubing for air delivery to algae paste</td></tr><tr><td>Rigid Clear Tubing O.D., 36&amp;rdquo;</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>16025</td><td>Rigid clear tubing for algae delivery</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Rotifers&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L</td><td>Reed Mariculture</td><td>Type L 5 million</td><td>Rotifer stock culture for system startup</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Rotifer Feed&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxymethylsulfonate</td><td>Reed Mariculture</td><td>ClorAm-X&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt; 1lb tub</td><td>Ammonia reducer for algae feed mix</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25533B</td><td>pH buffer for algae feed mix</td></tr><tr><td>Microalgae concentrate</td><td>Reed Mariculture</td><td>Rotigrow Plus&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt; 1 liter bag</td><td>Nutritionally optimized rotifer feed</td></tr><tr><td>RG Complete</td><td>Reed Mariculture</td><td>RG Complete 6 oz bottle</td><td>All in one microalgae based feed for small scale cultures</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Water Preparation&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Reef Crystals Reef Salt</td><td>That Fish Place</td><td>198210</td><td>Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Refractometer</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>SR6</td><td>measuring salinity</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Rotifer Culture Equipment&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plankton Collectors 12&quot; Dia, 53 microns</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>BBPC20</td><td>Mesh screen for collecting rotifers</td></tr><tr><td>Scrub Pads</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>SCR-58</td><td>Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels</td></tr><tr><td>Scrub Brush</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bucket</td><td>Grainger Supply&amp;nbsp;</td><td>43Y530</td><td>Graduated bucket for mixing culture water</td></tr><tr><td>Hatching Jar</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>J30</td><td>Storage of algae feed mix</td></tr><tr><td>Lugol&amp;rsquo;s Solution, Dilute</td><td>Fisher Scientific</td><td>S99481</td><td>Agent used to immobilize live rotifers for counting</td></tr><tr><td>Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid&amp;nbsp;</td><td>Pentair Aquatic Eco-Systems</td><td>M415</td><td>Counting rotifers</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Miscelleneous&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tea Strainer</td><td>Kitchenworks</td><td>971972</td><td>Used for collecting zebrafish embryos after spawning</td></tr></tbody></table>

the complete and updated "rotifer polyculture method" for rearing first feeding zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

Il sistema di coltura di rotiferi continua qui descritta è dinamico, ed è normale per i numeri di rotiferi a fluttuare in misura limitata nel tempo se ci sono variazioni nei tassi di alimentazione e di raccolta giornaliera. La popolazione dei rotiferi in una delle culture attive nei servizi di acquacoltura Hospital Boston bambini, mantenuto nel modo sopra descritto, è stata monitorata per 30 giorni (Figura 3). La densità di cultura media durante questo periodo è sta...

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The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

Il completo ed aggiornato &quot;Rotifero Metodo Polyculture&quot; per l&#39;allevamento Prima Zebrafish Feeding

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science.  One of the most demanding technical aspects of ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

15.4K Views.  Boston Children's Hospital. Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

Video: The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Ricerca

Genetica

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Sviluppo di un modello di fegato Fibrotic etanolo-indotta in zebrafish per studiare progenitrici cellulo-mediata epatociti Rigenerazione

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Biologia dello sviluppo

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Cultura e transfezione di cellule primarie di Zebrafish

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at 2 days post fertilization. Consisting of only two nephrons, the pronephros serves as the sole kidney during larval life until more renal function is required due to the increasing body mass. To cope with this higher demand, the mesonephros (adult kidney) begins to form during metamorphosis. The new primary nephrons fuse to the pronephros and form connected lumens. Then, secondary nephrons fuse to primary ones (and so on) to create a branching network in the mesonephros. The vast majority of research is focused on the pronephros due to the ease of using embryos. Thus, there is a need to develop techniques to study older and larger larvae and juvenile fish to better understand mesonephros development. Here, an in situ hybridization protocol for gene expression analysis is optimized for probe penetration, washing of probes and antibodies, and bleaching of pigments to better visualize the mesonephros. The Tg(lhx1a-EGFP) transgenic line is used to label progenitor cells and the distal tubules of nascent nephrons. This protocol fills a gap in mesonephros research. It is a crucial model for understanding how new kidney tissues form and integrate with existing nephrons and provide insights into regenerative therapies.

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish is an important model for understanding kidney development. Here, an in situ hybridization protocol is optimized to detect gene expression in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development.

Sul posto Ibridazione in larve di zebrafish e giovani durante lo sviluppo di Mesonephros

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to prenatal ethanol exposure. Due to the complex pathology of FASD, animal models have proven critical to our current understanding of ethanol-induced developmental defects. Zebrafish have proven to be a powerful model to examine ethanol-induced developmental defects due to the high degree of conservation of both genetics and development between zebrafish and humans. As a model system, zebrafish possess many attributes that make them ideal for developmental studies, including large numbers of externally fertilized embryos that are genetically tractable and translucent. This allows researchers to precisely control the timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts. One important genetic tool available in zebrafish is transgenesis. However, generating transgenic constructs and establishing transgenic lines can be complex and difficult. To address this issue, zebrafish researchers have established the transposon-based Tol2 transgenesis system. This modular system uses a multisite Gateway cloning approach for the quick assembly of complete Tol2 transposon-based transgenic constructs. Here, we describe the flexible Tol2 system toolbox and a protocol for generating transgenic constructs ready for zebrafish transgenesis and their use in ethanol studies.

This work describes a protocol for the modular Tol2 transgenesis system, a gateway-based cloning method to create and inject transgenic constructs into zebrafish embryos.

Il sistema Zebrafish Tol2: un approccio di transgenesi modulare e flessibile basato su gateway

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Ottimizzazione dei modelli GF Zebrafish: generazione, manutenzione e studi microbici

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

Autore in primo piano: Definizione di pesce zebra privo di germi per studi sulla relazione microbiota-ospite

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and behavioural research. As a vertebrate, zebrafish share considerable genetic sequence similarity with humans and are being used as an animal model for various human disease conditions. The advantages of zebrafish in comparison to other common vertebrate models include high fecundity, low maintenance cost, transparent embryos, and rapid development. Due to the spur of interest in zebrafish research, the need to establish and maintain a productive zebrafish housing facility is also increasing. Although literature is available for the maintenance of a zebrafish laboratory, a concise video protocol is lacking. This video illustrates the protocol for regular housing, feeding, breeding and raising of zebrafish larvae. This process will help researchers to understand the natural behaviour and optimal conditions of zebrafish husbandry and hence troubleshoot experimental issues that originate from the fish husbandry conditions. This protocol will be of immense help to researchers planning to establish a zebrafish laboratory, and also to graduate students who are intending to use zebrafish as an animal model.

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

This protocol outlines regular maintenance and care to maintain optimal conditions for zebrafish husbandry. The video illustrates the protocol for system maintenance, regular housing, feeding, breeding, and raising of zebrafish larvae.

Cura e manutenzione periodiche di Zebrafish (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Laboratorio: Introduzione

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

Biologia

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and pharmacological similarities to that of the mammals. GI intolerance during clinical testing of drug candidates is common and may pose a serious threat to human health. Testing for GI toxicity in preclinical mammalian models can be expensive in terms of time, test compound, and labor. The high-throughput method presented here may be used to predict GI safety issues. Compared to mammalian models, this method allows for more expedient assessment of test compound effects on GI transit while using low quantities of compound. In this method, larval zebrafish (7 days post fertilization) are fed food containing a fluorescent label. After feeding, each larval fish is placed into a well of a 96-conical-bottom-well plate and dosed with test compound (dissolved in water) or the vehicle. As gut transit occurs, fecal matter accumulates on the bottom of the wells, and the rate at which this happens is monitored by measuring fluorescence from the bottom of the well repeatedly over time using a plate spectrophotometer. The fluorescence from larvae in a given treatment group are averaged and these values are graphed along with standard error, for each measurement time, yielding a curve representing average transit of food over time. Effects on gut transit time are identified by comparing the area under the curve for each treatment group to that of the vehicle-treated group. This method detected changes in zebrafish GI transit time induced by drugs with known clinical GI effects; it can be employed to interrogate dozens of treatments for GI effects per day. As such, safer compounds can be quickly prioritized for mammalian testing, which expedites discovery and proffers 3Rs advancement.

The goal of this protocol is to measure the transit time of fluorescently labeled food through the gut of larval zebrafish in a high throughput fashion.

Il completo ed aggiornato "Rotifero Metodo Polyculture" per l'allevamento Prima Zebrafish Feeding

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

Sviluppo di un modello di fegato Fibrotic etanolo-indotta in zebrafish per studiare progenitrici cellulo-mediata epatociti Rigenerazione

Cultura e transfezione di cellule primarie di Zebrafish

Sul posto Ibridazione in larve di zebrafish e giovani durante lo sviluppo di Mesonephros

Il sistema Zebrafish Tol2: un approccio di transgenesi modulare e flessibile basato su gateway

Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Cura e manutenzione periodiche di Zebrafish (

High-throughput misurazione del tempo di transito dell'intestino utilizzando Zebrafish larvale