La cura e l&#39;uso di pesce generato per risultati rappresentativi descritti in questo protocollo è stata eseguita in piena conformità con le linee guida stabilite dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale presso Hospital di Boston dei bambini, protocollo # 14-05-2673R.

1. Rotifer Cultura <ol><li> I componenti di base di un sistema di coltura utilizzando un Vessel 100 L Cultura <ol><li> Raccogliere tutti i componenti per l&#39;installazione coltura di rotiferi. La configurazione coltura di rotiferi è costituito da un recipiente di coltura (CV) a crescere i rotiferi; una nave simile a mantenere rotiferi feedout (feedout vaso cultura, FCV); un vaso a fondo tondo cova (feed Reservoir, FR) per la conservazione della miscela di alimentazione alghe (AFM); una riserva d&#39;aria (AS) per aerare il CV, FCV e la FR; una pompa peristaltica con un temporizzatore di dosaggio (PMT) per controllare la consegna dei mangimi alghe nel CV e FCV; e un filtro antiparticolato filo (FPF) che si trova all&#39;interno del curriculum. NOTA: L&#39;elenco completo delle forniture e dei componenti è previsto nella lista dei materiali. </li></ol></li><li> Configurazione <ol><li> Elevare il CV e FCV su un supporto o un tavolo in modo che le culture possono essere facilmente raccolte tramite uno scarico montaggio in un cont collezioneAiner (Figura 1). Utilizzare tubi flessibili di alimentazione dell&#39;aria per collegare i AS ad una lunghezza di tubo rigido in ciascun recipiente di coltura. Assicurarsi che il tubo è abbastanza lungo per fornire aria al fondo del CV o FCV. </li><li> Utilizzare una linea di aria piccola capacità per collegare gli AS ad una lunghezza di tubo rigido che si estende fino al fondo della FR che contiene l&#39;AFM. Installare una valvola in ciascuna linea d&#39;aria per regolare il flusso d&#39;aria. Collegare il FR alla PMT con tubo di erogazione mangime, ed eseguire il tubo dalla PMT in un foro nel lato del CV / FCV, vicino alla parte superiore. Figura 1. </li></ol></li><li> Avviare <ol><li> Riempire il recipiente di coltura al 90% del volume disponibile con osmosi inversa (RO). Se RO non è disponibile, utilizzare acqua pulita e comunale senza cloro; tuttavia, una valutazione del rischio biosicurezza deve essere eseguita per garantire che nessun microrganismi potenzialmente patogeni sono presenti in acqua di fonte. NOTA: Tale analisi può essere effettuatada qualsiasi laboratorio di prova d&#39;acqua qualificato. </li><li> Dosare l&#39;acqua recipiente di coltura con sale acquario per raggiungere una salinità di 15 g / L. Impostare il flusso d&#39;aria nel recipiente in modo che mantenga una &quot;bollire rolling&quot;, e quindi aggiungere lentamente la quantità misurata di sale al recipiente di coltura fino a completa dissoluzione della aerazione. Continuare aerare l&#39;acqua per&gt; 1 ora per assicurarsi che sia completamente ossigenato. </li><li> Rendere la miscela di alimentazione alghe. Per 3 L di pulito, dechlorinated fresco (0 ppm) acqua aggiungere 100 g di NaHCO3 e 100 g di ammoniaca neutralizzatore (hydroxymethylsulfonate sodio). Questo ultimo reagente offre l&#39;ulteriore vantaggio di neutralizzare qualsiasi cloro residuo da acqua di rubinetto o candeggina residui di sanificazione delle apparecchiature cultura. E &#39;fondamentale per garantire che questi composti sono completamente sciolti. Poi aggiungere 1 L di alghe concentrato (biomassa peso secco ~ 15%). Aggiungere la miscela di alimentazione per la FR e conservare a 4 ° C. </li><li> Aggiungere una cultura antipasto di 5-10.000.000 <em&gt; rotiferi Brachionus plicatilis al CV contenente 15 g di acqua di salinità / L aerato. Se i rotiferi sono stati refrigerati durante il trasporto o la conservazione, dovrebbero essere gradualmente (durante 30 min o più) acclimatati alla temperatura dell&#39;acqua nel recipiente di coltura (25 - 27 ° C). </li><li> Accendere il PMT e iniziare a pompare il feed alghe nel vaso coltura di rotiferi. Utilizzando la funzione timer del PMT, impostare la portata di miscela di alimentazione alghe in modo che ~ 1,6 ml di miscela di alimentazione alghe viene consegnato per milione di rotiferi nella cultura, al giorno. Distribuire le alimentazioni in piccole porzioni a intervalli regolari nel corso di un periodo di 24 ore; la più frequente delle alimentazioni, meglio è. </li><li> Calibrare la portata della pompa agendo manualmente sulla PMT per un determinato periodo (ad esempio, 1 min) e raccogliere le alghe che esso pompa durante questo intervallo in un cilindro o cilindro graduato. Ad esempio, se le dosi PMT 5 ml di alghe in 1 min, quindi la dose sarebbe5 ml alghe / min. </li><li> Calcolare il tasso di alimentazione giornaliera richiesta moltiplicando il numero di rotiferi presenti, in milioni, di 1,6 ml. Ad esempio, una cultura rotifero con una dimensione della popolazione di 100 milioni di rotiferi richiederebbe ~ 160 ml di mangime al giorno (100 x 1,6 ml). </li><li> Impostare la PMT per dosare il fabbisogno alimentare giornaliero totale a intervalli regolari durante un periodo di 24 ore. Ad esempio, la consegna di una quantità di trasporto giornaliera totale di 160 ml potrebbe essere consegnato in porzioni volta ogni 3 ore in un periodo di 24 ore utilizzando una serie PMT con un tasso pompa dosatrice di 5 ml / min per 4 min, 8 volte al giorno (5 ml / min x 4 = numero minimo di 20 ml x 8 poppate = 160 ml). </li><li> Lasciare che la cultura a crescere fino a che non genera la popolazione richiesta, di solito per 48-72 ore, prima della raccolta. A 24 ore dopo l&#39;avvio, aggiungere i filtri antiparticolato filo interdentale al recipiente di coltura ed iniziare la normale manutenzione. </li></ol></li><li> Manutenzione NOTA: La cultura funziona su base continua e richiede routine manutenzione che idealmente dovrebbe essere eseguita alla stessa ora ogni giorno, nella seguente sequenza. <ol><li> Riempire la FCV al 90% del volume disponibile con pulito, senza cloro acqua dolce, dosata con 10 g / L di sali acquario. Assicurarsi che l&#39;acqua è ben miscelati, e che tutto il sale è completamente dissolto. Impostare il flusso d&#39;aria nel recipiente in modo che mantenga una &quot;bollore&quot;. Misurare la salinità con un rifrattometro e garantire che la salinità è di 10 g / L. E &#39;fondamentale per raggiungere questo obiettivo e di non superarla. </li><li> Assaggiate i rotiferi del CV: Assicurarsi che la cultura è ben miscelato, quindi raccogliere 3 campioni di 2-3 ml con una pipetta di trasferimento o autopipettor, provenienti da diverse parti della cultura. Combinare questi campioni in un tubo o fiala di dimensione conveniente (ad esempio, 10 ml). </li><li> Transfer 1 - 2 ml del campione combinato su una capsula di Petri in modo che possa essere visualizzato sotto un microscopio da dissezione. Controllare la qualità della cultura (nuoto comportamentorotiferi, presenza di uova staccati, contaminando protozoi). </li><li> Immobilizzare il rotiferi del campione combinato restante aggiungendo 100 ml di 50% soluzione di iodio Lugol al campione. In pochi secondi dopo l&#39;aggiunta dei Lugol, osservare i rotiferi per fermare il nuoto. Ora, facilmente contare i rotiferi. NOTA: L&#39;etanolo, candeggina diluita, o aceto possono essere utilizzati al posto di Lugol. Aceto (2 gocce / 10 ml) ha il vantaggio di essere non pericolosi, senza perdere forza nella memoria come soluzioni di lavaggio e di iodio può, e non fare il contratto rotiferi, così la corona delle ciglia e il &quot;piede&quot; rimanere estesa e la animali aspetto più naturale. </li><li> Assicurarsi che il campione è ben miscelato (rotiferi immobilizzate si depositano rapidamente), poi prendere rapidamente un ml sottocampione ~ 2 in una pipetta di plastica e dispensare 1 ml in una diapositiva che conta Sedgewick-Rafter (20 x 50 1 mm quadrati) (Figura 2 ). Utilizzando un microscopio da dissezione o composto, contare i rotiferi intatti e il tNumero otale di uova attaccate a queste rotiferi (Figura 2). Conte come gran parte della zona diapositiva come necessario contare ~ 100 rotiferi. Calcolare il numero di rotiferi per ml, e registrare questo in un foglio di calcolo o giornale di bordo. </li><li> Harvest ~ 30% del volume dei rotiferi nel CV: Rimuovere l&#39;alimentazione dell&#39;aria e filtro filo, aprire lentamente la valvola sul fondo del CV e permettere all&#39;acqua di fluire in un collettore di plancton con uno schermo di maglia 53 micron. Raccogliere l&#39;acqua che scorre fuori dal fondo del collettore dopo il filtraggio in un secchio o scarico. Utilizzare un dolce a moderato flusso per evitare di danneggiare i rotiferi. Non permettere che i rotiferi asciugare sullo schermo. </li><li> Per motivi di coerenza, è opportuno stabilire il FCV con un numero standard di rotiferi ogni giorno. Pertanto, sulla base del noto volume di CV densità rotifero e il raccolto, regolare il volume totale FCV per ottenere una densità finale coerente (ad es., 1.500 rotiferi / ml). Aggiungere il roti raccoltofers al FCV: trasferire delicatamente i rotiferi dallo schermo raccolta utilizzando una bottiglia di lavaggio riempita con acqua salata pulita (10-15 g / l). Capovolgere lo schermo sopra la FCV e lavare i rotiferi in FCV con una leggera corrente di acqua salata. Avviare la PMT per fornire alimentazione (~ 1,57 ml per milione di rotiferi al giorno) per il FCV. </li><li> Scrub l&#39;intero all&#39;interno del CV con una spazzola di nylon morbido e pulito o pad macchia. </li><li> Preparare una nuova miscela di 15 g di acqua / L aggiungendo la quantità appropriata di sale ad una quantità misurata di acqua pulita RO in un secchio da 5 galloni per sostituire il volume di acqua persa per raccogliere. Aggiungere il sale all&#39;acqua nel secchio e mescolare vigorosamente fino a completa dissoluzione, e quindi aggiungere al CV. </li><li> Usando uno spray ad alta pressione in un lavandino, lavare il filtro filo fino a quando è libero di detriti, e poi tornare al CV. </li><li> Regolare velocità di avanzamento di alghe consegnato al CV cambiando la durata di ogni evento di dosaggio, in base al conteggio giornaliero di rotiferi / ml.Utilizzare i calcoli forniti al punto 1.3.8, al di sopra di determinare la giusta quantità di mangime da consegnare. </li><li> Circa 24 ore dopo, ripetere il processo. Avviare raccogliendo i rotiferi rimanenti nel FCV (che non erano necessari per il giorno precedente) nello stesso modo precedentemente descritto (punti 1.4.2 - 1.4.10). Concentrarli in 2 litri di acqua fresca e pulita senza cloro (5 g / l di sale). Questi possono essere conservati a 4 ° C come alimentazione di riserva, o utilizzati per alimentare le fasi successive di pesce, al di là di quanto descritto in questo protocollo. NOTA: Questo protocollo permette fino a 2 - 3 giorni di ridotta manutenzione cultura (con alimentazione automatica normale), perché i rotiferi nel curriculum può tollerare l&#39;omissione dei raccolti senza gravi conseguenze. </li></ol></li></ol> 2. Policoltura <ol><li> Impostare <ol><li> Raccogliere embrioni di zebrafish da un evento di deposizione delle uova versando embrioni generati attraverso un colino da tè e poi risciacquare delicatamente con fis sterilih di acqua (o di qualsiasi altra fonte non contaminata della soluzione opportunamente condizionata, ad esempio, di media embrione, E3, etc.) da un flacone di lavaggio in capsule di Petri. </li><li> Incubare gli embrioni a 25 - 28 ° C in piastre Petri ad una densità di 40 - 50 embrioni per piastra per 5 giorni. </li><li> Iniziare la fase polyculture il giorno 5 dopo la fecondazione, o quando più del 90% delle larve schiuse attivamente nuotando nella colonna d&#39;acqua. </li></ol></li><li> Inoculazione <ol><li> Aggiungere 500 ml di coltura di rotiferi direttamente dal FCV ad un serbatoio vivaio 3,5 L; inclusione di acqua coltura di rotiferi prevede algale che mantiene il contenuto nutrizionale dei rotiferi durante policoltura. </li><li> Delicatamente versare le larve da una capsula di Petri nel serbatoio vivaio. Assicurarsi che nessun larve rimangono nel piatto. </li><li> Aggiungere 500 ml di acqua pulita e pesci condizionata da un sistema di ricircolo o fonte d&#39;acqua dedicata al serbatoio per raggiungere un volume finale di 1 litro e il s finalealinity di 5 g / L. NOTA: Questo salinità è fondamentale perché la sopravvivenza delle larve zebrafish sarà influenzato negativamente se la salinità è&gt; 7 g / L e di sopravvivenza rotiferi sarà influenzato negativamente se la salinità &lt;2 g / l. </li></ol></li><li> Fase policoltura NOTA: La fase di policoltura dovrebbe durare per un massimo di 4 giorni post-inoculazione (per un totale di 5 giorni, corrispondenti a 5-9 giorni dopo la fecondazione). <ol><li> Osservare il serbatoio policoltura almeno una volta al giorno durante questo periodo per assicurare che rotiferi e pesce sono presenti e in crescita. Assicurarsi che i rotiferi sono visibili in tutta la colonna d&#39;acqua. Assicurarsi che i le fishs sono visibili anche all&#39;interno della colonna d&#39;acqua, nuotando tra i rotiferi. </li><li> Inizia flusso d&#39;acqua normale attraverso il serbatoio. Posizionare uno schermo o deflettore attraverso la porta di scarico per garantire che le larve non vengono trasferite dal serbatoio. NOTA: Al termine di questa fase, i pesci saranno abbastanza grande da consumare prede più grandi come Artemiaelementi del feed naupli o trasformati nella gamma di dimensioni di 75-125 micron. NOTA: Le dinamiche demografiche rotifero all&#39;interno di un serbatoio di polyculture rappresentante sono stati misurati mediante campionamento / conteggio rotiferi dal serbatoio allo stesso modo come descritto ai punti 1.4.2 - 1.4.5. Ciò è stato fatto una volta al giorno a partire dall&#39;inizio della fase polyculture finché fu completata. </li></ol></li></ol>

<ol>
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CE Henry è impiegato da Reed Maricoltura, Inc., una società che fornisce rotiferi, concentrati di alghe, e altre forniture ai mercati hobbysti di acquacoltura e di pesce.

La corretta attuazione del metodo policoltura rotiferi per l&#39;alimentazione precoce zebrafish larvale richiede protocolli efficaci per due compiti: la creazione e il mantenimento di un sistema di coltura di rotiferi continuo a nutrire i pesci, e la coltura di prima alimentazione larve zebrafish con rotiferi nella stessa vasca. La messa a punto di un sistema di produzione di acqua salata rotifero continua per i laboratori di zebrafish prima descritti da Lawrence e co-autori di 14</sup...

Il pesce zebra (Danio rerio) è un preminente animale da laboratorio utilizzato in un numero crescente di discipline scientifiche, compreso ma non limitato alla genetica dello sviluppo, la tossicologia, il comportamento, l&#39;acquacoltura, la biologia rigenerativa, e la modellazione di molte malattie umane 1 - 5. Anche se la specie è relativamente facile da mantenere in laboratorio, ci sono una serie di problemi di gestione associati con la loro cultura 6. Il più importante di questi è allevamento larvale, soprattutto quando il pesce prima comincia ad alimentare a seguito di inflazione della vescica gas 7. In normali, condizioni controllate, questo evento si verifica dello sviluppo a ~ 5 giorni dopo la fecondazione (DPF), con i seguenti 3 - 5 giorni di crescita particolarmente critici 7. La difficoltà tecnica centrale durante questa fase è quello di soddisfare adeguatamente le esigenze nutrizionali della prima larve alimentazione - articoli mangimi devono essere di dimensioni appropriate, Digestible, attraente, e disponibile su una base quasi continuo, senza creare eccessivi sprechi in vasche di coltura. Storicamente questo è stato realizzato tipicamente fornendo numerose piccole quantità di mangime per pesci in vasche, insieme con 8,9 scambio dell&#39;acqua routine. Mentre questi metodi sono in una certa misura di successo, sono inefficienti, richiedono ingressi del lavoro elevati, e restituiscono solo variabili e tassi limitati di crescita e la sopravvivenza 10. In natura, le larve si nutrono di pesce zebra presumibilmente abbondante piccolo zooplancton presente nella colonna d&#39;acqua 11. Per questo motivo, i protocolli larviculture che incorporano i feed live come Paramecium, rotiferi, Artemia e sono in genere più efficiente 7. Nel 2010, le migliori e co-autori hanno dimostrato che era possibile coltivare zebrafish larvale in acqua salmastra statica con rotiferi acqua salata per i primi 5 giorni di alimentazione esogena 12. Questo approccio, che sfruttarees l&#39;elevata produttività naturale delle culture di rotiferi a fornire ampio, preda altamente nutrienti senza inquinare l&#39;acqua, rendimenti molto elevati tassi di crescita delle larve e la sopravvivenza con il contributo di lavoro basso 12,13. Negli ultimi anni, un numero crescente di laboratori di tutto il mondo hanno adottato varianti di questo protocollo, e molti sono ora coltura rotiferi in modo continuo per supportare i sistemi vivaio 14. Nel corso degli ultimi anni, sia per i metodi di rotiferi / policoltura zebrafish e la produzione rotiferi sono stati raffinati e migliorato per diventare più standardizzati e facilmente scalabile. Questo articolo fornisce istruzioni passo-passo per 1) la produzione rotiferi continuo e robusto e 2) l&#39;istituzione del / sistema di policoltura zebrafish rotifero utilizzato per sostenere una crescita robusta dei pesci per i primi 5 giorni di alimentazione esogena.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifer Culture Infrastructure</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">100 Liter Culture Vessel</td>
			<td style="width:135px;">Aquaneering</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td style="width:264px;">Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">5 Gallon Culture Bucket Kit</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">CCS Starter Kit</td>
			<td style="width:264px;">Small volume culture vessel for small facilities</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rigid Clear Tubing 1/2&#34; O.D., 36&#8221;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">16025</td>
			<td style="width:264px;">Rigid clear tubing for air delivery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Mesh tube</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">RT444X</td>
			<td style="width:264px;">Mesh tube support for floss filter</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rotifer Floss</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">Rotifer floss 12&#8221; x 42&#8221;</td>
			<td style="width:264px;">Particulate waste trap</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD</td>
			<td style="width:135px;">Grainger</td>
			<td style="width:119px;">38M003&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Metering pump with timer for dosing feed to rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/h (for smaller-scale culture)</td>
			<td style="width:135px;">Coral Vue</td>
			<td style="width:119px;">SKU: IC-LQD-DSR</td>
			<td style="width:264px;">Metering pump with timer for dosing feed to rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Silicone Tubing&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;">Tubing for algae delivery to rotifer vessel</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rigid Clear Tubing &#34; O.D.,36&#8221;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">16025</td>
			<td style="width:264px;">Rigid clear tubing for air delivery to algae paste</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rigid Clear Tubing O.D., 36&#8221;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">16025</td>
			<td style="width:264px;">Rigid clear tubing for algae delivery</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifers</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">Type L 5 million</td>
			<td style="width:264px;">Rotifer stock culture for system startup</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifer Feed</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:305px;">Sodium hydroxymethylsulfonate</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">ClorAm-X&#174; 1lb tub</td>
			<td style="width:264px;">Ammonia reducer for algae feed mix</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S25533B</td>
			<td style="width:264px;">pH buffer for algae feed mix</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:305px;">Microalgae concentrate</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">Rotigrow Plus&#174; 1 liter bag</td>
			<td style="width:264px;">Nutritionally optimized rotifer feed</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Water Preparation</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:305px;">&#160;Reef Crystals Reef Salt</td>
			<td style="width:135px;">That Fish Place</td>
			<td style="width:119px;">198210</td>
			<td style="width:264px;">Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Refractometer</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">SR6</td>
			<td style="width:264px;">measuring salinity</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifer Culture Equipment</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Plankton Collectors 12&#34; Dia, 53 microns</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">BBPC20</td>
			<td style="width:264px;">Mesh screen for collecting rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Scrub Pads</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">SCR-58</td>
			<td style="width:264px;">Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Scrub Brush</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Bucket</td>
			<td style="width:135px;">Grainger Supply&#160;</td>
			<td style="width:119px;">43Y530</td>
			<td style="width:264px;">Graduated bucket for mixing culture water</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Hatching Jar</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">J30</td>
			<td style="width:264px;">Storage of algae feed mix</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Lugol&#8217;s Solution, Dilute</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S99481</td>
			<td style="width:264px;">Agent used to immobilize live rotifers for counting</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Eco-Systems</td>
			<td style="width:119px;">M415</td>
			<td style="width:264px;">Counting rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Miscelleneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Tea Strainer</td>
			<td style="width:135px;">Kitchenworks</td>
			<td style="width:119px;">971972</td>
			<td style="width:264px;">Used for collecting zebrafish embryos after spawning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the complete and updated "rotifer polyculture method" for rearing first feeding zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

Il sistema di coltura di rotiferi continua qui descritta è dinamico, ed è normale per i numeri di rotiferi a fluttuare in misura limitata nel tempo se ci sono variazioni nei tassi di alimentazione e di raccolta giornaliera. La popolazione dei rotiferi in una delle culture attive nei servizi di acquacoltura Hospital Boston bambini, mantenuto nel modo sopra descritto, è stata monitorata per 30 giorni (Figura 3). La densità di cultura media durante questo periodo è sta...

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The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

Il completo ed aggiornato &quot;Rotifero Metodo Polyculture&quot; per l&#39;allevamento Prima Zebrafish Feeding

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science.  One of the most demanding technical aspects of ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

15.3K Views.  Boston Children's Hospital. Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

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Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Immagini dal vivo di Innata immunitario e preneoplastiche interazioni cella utilizzando un / UAS Expression System inducibile GAL4 in Zebrafish larvale pelle

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

L&#39;utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Allevamento la mosca della frutta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sotto axeniche e Gnotobiotic Condizioni

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Indurre completa Polyp Rigenerazione dal aboral Physa della Starlet Anemone di mare<em&gt; Vectensis Nematostella</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

In Vitro Crescita dei follicoli preantrali Mouse sotto condizioni di microgravità simulata

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM e Microrheology nella cella tuorlo embrione di pesce zebra

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualizzazione dell'attività elettrica cellulare in Zebrafish embrioni in anticipo e tumori

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Un metodo In Vivo per studiare l'integrità della barriera ematotesticolare di Mouse

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...