This work was funded by a Wellcome Trust Sir Henry Dale Fellowship to Y. F. 100104/Z/12/Z.
We would like to thank Dr. Carl Tucker and the team of the fish facility at the Queen&#8217;s Medical Research Institute, University of Edinburgh. We like to thank Michael Millar of the immunohistology and imaging facility of the MRC Centre for Reproductive Medicine, University of Edinburgh for support.
We thank Prof. Dr. Matthias Hammerschmidt and Dr. Heiko Loehr of the Institute of Developmental Biology, University of Cologne for providing the p5E-krt4 entry vector. We also would like to thank Dr. Dirk Sieger of the Centre of Neuroregeneration, Univerity of Edinburgh for providing the pDestTol2CG destination vector.

Le seguenti procedure sperimentali sono state condotte in stretta conformità con gli animali (Procedure Scientifiche) Act 1986. 1. Preparazione di DNA plasmidico per microiniezione <ol><li> Purificare il plasmide pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP con un plasmide DNA kit di purificazione commerciale secondo le istruzioni del produttore e diluire il DNA plasmide di una finale concentrazione della soluzione di 100 ng / ml. </li><li> Linearizzare la trasposasi contenente pT3TS plasmide / Tol2 14 da BamHI restrizione digestione, seguendo il protocollo del produttore. Questo passaggio può essere esteso durante la notte. Precipitare il DNA linearizzato da una estrazione con fenolo / cloroformio, seguendo il protocollo standard. </li><li> In vitro trascrivere il mRNA trasposasi dal plasmide linearizzato con un kit di trascrizione commerciale per grandi quantità di RNA ricoperto secondo le istruzioni del produttore, diluire e un&#39;aliquota diuna finale concentrazione della soluzione di 100 ng / ml in acqua priva di nucleasi. Garantire la qualità del RNA purificato con un nativo 1-2% TAE (Tris 40 mM, 20 mm di acido acetico, 1 mM EDTA) gel elettroforesi (80-120 V). Conservare l&#39;RNA a -80 ° C. </li></ol> 2. microiniezione di DNA plasmidi per Transient espressione genica <ol><li> Preparare una piastra di iniezione agarosio tenere le uova fecondate durante l&#39;iniezione. Versare liquido 3% agarosio in una capsula di Petri 90 mm. Lasciare raffreddare agarosio a 40-50 ° C e aggiungere lo stampo microiniezione forma incuneato TU-1 sopra l&#39;agarosio liquido. Dopo l&#39;indurimento a temperatura ambiente, lasciare riposare agarosio a 4 ° C per 30 minuti prima di rimuovere lo stampo. Stampi Conservare microiniezione a 4 ° C e il riutilizzo. </li><li> Preparare una aliquota della soluzione per l&#39;iniezione. Effettuare le seguenti operazioni sul ghiaccio. Dispensare 1 ml di plasmide DNA (concentrazione finale di 10 ng / ml), 2 ml di trasposasi mRNA (concentrazione finale 20 ng / ml), 2ml di 10 mg / ml Rodamina B isotiocianato-Destrano, 2 ml di soluzione di 5x Danieau (290 mM NaCl, KCl 3,5 mM, 2 mM MgSO 4, 3 mM Ca (NO 3) 2, 25 mM HEPES, pH 7,6) ad una volume finale di 10 ml in acqua priva di nucleasi. </li><li> Preparare aghi da capillari di vetro borosilicato di 1 mm di diametro contenenti un filamento conduttore interno tirando il capillare in direzioni opposte con una micropipetta estrattore. Utilizzare il seguente programma: riscaldare 530, tirare 200, la velocità e il tempo di 80 150. </li><li> Riempire un ago con 2 ml di soluzione iniettabile (tenuti in ghiaccio). Evitare bolle ritirando attentamente la punta microloader rilasciando la soluzione nel capillare. Rompere con attenzione la punta dell&#39;ago con una pinza. </li><li> Regolare la dimensione della goccia con una pompa pneumatica pico. Misurare il diametro goccia / volume (V = 4/3 πr 3) e regolare la dimensione della goccia con un micrometro oculare sotto uno stereoscopio in dimetilpolisilossano. Consigliamo100 micron, corrispondente a 0,5 nl. Questo assicura concentrazioni uniformi e riproducibili per ogni embrione iniettato. Titolare la concentrazione iniettato e regolare per ogni costrutto e plasmide preparazione. </li><li> Posizionare gli zigoti (Figura 1A) ottenuti da un incrocio di Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 15 con Tg (lysC: DsRed2) nz50Tg 16 negli stampi della piastra iniezione mediante l&#39;uso di un pastette 3 ml. Nel frattempo, mantenere la punta dell&#39;ago pre preparato iniettabile in dimetilpolisilossano per evitare la soluzione da essiccazione e coagulazione. </li><li> Iniettare il calo predosata (100 micron corrispondente a 0,5 nl) sotto uno stereoscopio attraverso il corion nel blastodisco 17, prima della prima fenditura (Figura 1A). L&#39;iniezione in fase unicellulare aumenta il potenziale di una distribuzione uniforme del DNA plasmide e RNA nella massa cellulare sviluppo e la possibilità di trasmissione germinale. Èda notare che l&#39;espressione di costrutti più spesso tende ad essere mosaico. </li></ol> 3. condizionale Trasformazione della pelle delle cellule del 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) <ol><li> Trasferire gli embrioni iniettati nella soluzione 0.3x Danieau e tenerli a 28,5 ° C in un incubatore. Rimuovere uova non fecondate dal piatto in fase sfera 17. Il co-iniettato Rodamina B isotiocianato-Destrano può essere utilizzato come controllo iniezione sotto uno stereoscopio fluorescente. </li><li> Embrioni schermo a 24 HPF (ore dopo la fecondazione) per l&#39;espressione cardiaca di eGFP. Continuare a sollevare CMLC: eGFP embrioni di zebrafish positivi fino 72 HPF. Monitorare attentamente la qualità dell&#39;acqua (0.3x Danieau). </li><li> Rimuovere il corion di quegli embrioni che non sono nati con una pinza a 72 HPF. Attizzare cautela il corion con 1 pinza e tirare a parte utilizzando l&#39;altro. Selezionare embrioni per lysC: espressione DsRed2 utilizzando uno stereoscopio fluorescente. </li><li> Aggiungere 10 ml di 10 mMmagazzino di (Z) -4-Hydroxytamoxifen a 20 ml di soluzione 0.3x Danieau (concentrazione finale di 5 mM). Utilizzare l&#39;induzione soluzione di 4-OHT per un piatto standard di Petri (90 mm) su un lotto di 40-60 embrioni. </li><li> Trasferire gli embrioni in una nuova capsula Petri contenente 20 ml di fresco induzione soluzione. 4-OHT deve essere immagazzinato e manipolato al buio. I primi segni di espressione possono essere rilevati 2 ore di inizio induzione posta. L&#39;induzione-passo può essere esteso durante la notte, tenendo presente che cellula ospite iniziale: interazioni delle cellule preneoplastiche può già avvenire poche ore dopo il trattamento. </li></ol> 4. Montaggio e Immagini dal vivo di Zebrafish larve <ol><li> Preparare una capsula di Petri 60 millimetri introducendo un foro con un diametro di 18-20 mm. Utilizzare grasso al silicone per alto vuoto per coprire e sigillare il foro sul fondo esterno della piastra di Petri con un vetro di copertura 25 mm (Figura 1B). </li><li> Preparare 1% a basso punto di fusione (LMP) agarosio. Mantenere una provetta da 1,5 mlLMP di agarosio a 37 ° C su una piastra riscaldante. </li><li> Preselezione Tg (krt4: KalTA4-ER T2; UAS: eGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) larve di cellule della pelle verde fluorescente e di espressione delle cellule DsRed2 positivo innata immune, sotto uno stereoscopio fluorescente. Anestetizzare larve mediante aggiunta di 1 ml di 0,4% tricaine 18 alla soluzione di induzione 20 ml. </li><li> Trasferire le larve prescelto con un pastette nel agarosio LMP liquido. Lasciate che le larve affondare nel LMP agarosio e trasferirli sul vetro di copertura (Figura 1B). Orientare gli embrioni sotto uno stereoscopio. Le larve deve essere collocato direttamente sul vetro per ridurre la distanza di lavoro (fino a 6 larve). </li><li> Coprire il agarosio LMP con la soluzione contenente tricaine induzione dopo l&#39;indurimento (Figura 1B freccia). </li><li> Immagine le larve incorporato utilizzando un fluorescente invertita, laser-scanning o disco rotante microscopio confocale. Utilizzare un 40X o 63Xobiettiva di obiettivi con distanze di lavoro abilitazione fuoco attraverso l&#39;intero larve. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Durante l&#39;embriogenesi e sviluppo larvale, la pelle zebrafish embrione è composto da due strati epiteliali, lo strato superficiale chiamato periderm e uno strato di cheratinociti basali che sono attaccati alla membrana basale sottostante 19 (Figura 1C, a). Il protocollo presentato qui descrive un metodo semplice per indurre condizionale trasformazione preneoplastiche cellule nello strato superficiale della pelle di larve di zebrafish, e permette per la successiva analisi interazione con le cellule immunitarie innate di immagini dal vivo. Le metodologie di base nel nostro protocollo seguono tecniche di zebrafish consolidate 9-13, e il nostro protocollo possono essere facilmente adattati e modificati. Il promotore krt4 5 qui utilizzato spinge espressione T2 KalTA4-ER specificamente nello strato più esterno della pelle (Figura 1C, b). Tuttavia, l&#39;modulare MultiSite Gatewayclonazione strategia utilizzata per generare la krt4: KalTA4-ER T2 costrutto (Figura 1D, a), prevede la possibilità di clonare qualsiasi promotore di interesse davanti KalTA4-ER T2 in un unico passaggio clonazione. Un adattamento del metodo presentato qui è quindi possibile per la maggior parte dei tessuti durante l&#39;embriogenesi e stadi larvali. La disponibilità di sequenze promotore è presente il fattore limitante. Inoltre, quasi ogni gene di interesse clonato dietro un UAS può essere condizionale sovraespresso a diversi stadi di sviluppo mediante la espressione KalTA4-ER T2 spaziale e controllata temporalmente. Pertanto, il nostro protocollo può essere adattato per eseguire l&#39;espressione genica condizionale in qualsiasi tessuto di interesse nelle larve zebrafish, in maniera mosaico. Si può anche ottimizzare l&#39;impostazione per vivere immagine tessuti più profondi, come il fegato o del pancreas microscopio. Abbiamo descritto una sola applicazione che utilizza il protocollo cheRé, allo stesso modo, si può iperespressione altri modulatori infiammazione utilizzare questo protocollo per studiare la regolazione delle risposte infiammatorie, come si può facilmente neutrofili immagine dal vivo e cambiamenti comportamentali macrofagi seguenti l&#39;induzione e l&#39;arresto nella espressione di un modulatore infiammatorio candidato. Inoltre, il protocollo adatto sarebbe anche utile per coloro che vogliono seguire il movimento delle cellule e il cambiamento del comportamento durante le diverse fasi della morfogenesi dei tessuti e la formazione di organi e, infine, l&#39;immagine dal vivo l&#39;interazione delle interazioni cellule immunitarie innate con altre linee cellulari specifici che può essere mirata dal sistema di espressione T2 / UAS KalTA4-ER inducibile. Abbiamo usato il vettore pDestTol2CG dal Tol2kit zebrafish 20 - 23 che contiene un cmlc2: eGFP-pA cassetta (figura 1D, a) che consente la successiva selezione degli embrioni da verdi fluorescenti cuori positivi come selection marcatore 20 che semplifica il processo di screening F0. Un inserimento stabile del trasposone affiancato gene di interesse nel genoma è facilitato dalla co-iniezione del DNA plasmidico insieme trasposasi mRNA. La preparazione di DNA plasmidico e l&#39;mRNA trasposasi per microiniezione segue protocolli standard. Tuttavia, una riuscita integrazione del costrutto nel genoma dipende dalla trasposizione-based Tol2 14. Ciò evidenzia la particolare attenzione da pagare per lavorare sul ghiaccio in condizioni sterili per evitare contaminazioni e degradazioni da RNasi e DNasi. Microiniezione in una delle cellule di embrioni stadio è una tecnica robusta e consolidata per il guadagno e la perdita di studi di funzionalità in 9,10 zebrafish. Anche se una persona ben addestrato può facilmente iniettare nel tuorlo di oltre 1.000 embrioni in 1 ora, l&#39;iniezione nel blastodisco (Figura 1A, asterisco) richiede più esperienza e formazione. Critical durante questa procedura is la manipolazione dell&#39;ago. L&#39;ago deve essere molto sottile per penetrare la cella senza danni e deve pertanto essere rotto solo sulla sua punta estrema. È importante controllare periodicamente e misurare la dimensione della goccia durante l&#39;iniezione di garantire un&#39;iniezione uniforme in ogni embrione. Ben curate, l&#39;ago può essere usato per ruotare l&#39;embrione. Questo è spesso necessario per trovare il blastodisco e l&#39;angolo di penetrazione ottimale. La concentrazione di DNA e mRNA trasposasi utilizzato per l&#39;iniezione quasi certamente influenza l&#39;efficienza di espressione. Dosi più elevate possono portare ad un aumento della percentuale di cellule che esprimono il transgene ma con maggiori concentrazioni di DNA (&gt; 50 ng / ml) e trasposasi mRNA (&gt; 100 ng / ml), anche la possibilità di effetti tossici tra embrioni iniettati si pone. Noi preferiamo l&#39;uso di 10 ng / ml DNA e 20 ng / ml trasposasi mRNA iniettabile, che corrisponde a 50 pg di DNA plasmidico e 100 pg di RNA per emb iniettatoryo. 100% degli embrioni iniettati con queste concentrazioni si sviluppano normalmente, e tra il 40-70% mostra eGFP-HRAS espressione G12V, dopo induzione 4-OHT, a seconda dell&#39;efficienza iniezione nella singola cella. Tra embrioni positivi vengono normalmente troviamo circa il 30% che ha 1-10 cloni, 40% che ha 10-50 cloni e 30% con più di 50 cloni. Grazie ai nostri obiettivi di ricerca, privilegiamo l&#39;uso di embrioni con un minor numero di cloni che esprimono eGFP-HRAS G12V. Selezioniamo embrioni con 10-50 cloni per i nostri esperimenti transitori. Per la generazione di pesci transgenici fondatore, si consiglia di selezionare solo gli embrioni sia con il marcatore cardiaco positivo eGFP e un gran numero di eGFP-HRAS G12V cloni positivi nelle loro epidermide. (Z) -4-Hydroxytamoxifen subisce un cis-trans (EZ) interconversione quando esposto alla luce 24. Si è constatato che l&#39;isomero cis (E) è 100x meno anti-estrogenica rispetto al suo omologo trans 25,26. Exposure alla luce deve quindi essere evitato. La soluzione madre 4-OHT disciolto in etanolo può essere conservato a -20 ° C al buio per un periodo di tempo lungo. Si consiglia l&#39;uso di una scatola per proteggere le capsule di Petri dalla luce durante l&#39;induzione del gene bersaglio all&#39;interno dell&#39;incubatrice e trasporti. Anche se l&#39;area di imaging è molto piccolo e l&#39;esposizione di 4-OHT alla luce UV è ridotta al minimo, un continuo scambio di soluzione induzione ogni 2 ore, mentre l&#39;imaging in periodi di tempo più lunghi si raccomanda di mantenere i livelli massimi di espressione. 4-OHT permeabilizes efficace attraverso il corion e gli strati più esterni della pelle durante l&#39;embriogenesi zebrafish, quindi può indurre l&#39;espressione genica molto rapidamente. Possiamo facilmente osservare emissione eGFP dopo 2 ore di induzione ed è stato riferito che i primi segni di espressione target-gene possono essere osservati dopo 1 ora e plateau dopo 3 ore di trattamento 8. Le differenze possono essere dovute al diverso promotore utilizzato nel nostro studio. Come è stato previously ha riferito che il 4-OHT trattamento dipende dalla dose 8,27, abbiamo scelto di utilizzare la più alta concentrazione segnalato 5 micron di raggiungere livelli di espressione robusti e riproducibili nel nostro approccio transitoria. Questo dovrebbe garantire che tutte le cellule che trasportano il transgene saranno indurre l&#39;espressione del gene bersaglio. Si deve tenere conto che l&#39;approccio transitorio qui presentato potrebbe portare a diversi livelli di espressione per la possibilità di eventi multipli e casuali inserimento genoma. Inoltre, l&#39;uso del mRNA trasposasi in background transgenico Tol2 di Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 può portare a possibili trasposizioni del transgene UAS che potrebbe provocare silenziamento genico o interruzione. Tuttavia, poiché il metodo qui presentato rappresenta un approccio transitorio, la pre-selezione di embrioni successive a iniezione è obbligatoria. Molti laboratori hanno scoperto che le sequenze SUP tendono ad essere messa a tacere nella prole transgenica, quindi inproietta il pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP costruire in Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 embrioni potrebbe non essere efficiente come l&#39;iniezione di un UAS costrutto in Tg (krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: GFP ) embrioni. L&#39;uso della scuderia linea transgenica Tg (krt4: KalTA4-ER T2) attraversato con Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 consentirà un monitoraggio preciso dei / off sulla cinetica del tempo-dose dipendente l&#39;attivazione del gene 4-OHT . Un punto critico durante il montaggio delle larve è il trasferimento nella agarosio LMP e sul vetro di copertura (Figura 1B). C&#39;è solo un breve lasso di tempo per il liquido temperatura agarosio LMP che consente un trasferimento sicuro e l&#39;orientamento delle larve preselezionato senza danneggiare il pesce da uno shock termico o indurimento del gel. Le larve deve essere orientato direttamente sul vetro di copertura per ridurre la distanza di lavoro per la successiva analy microscopicasis. Poiché questo può essere un fattore limitante durante microscopia scelta degli obiettivi appropriati è obbligatoria. Una volta montato, la larva può essere mantenuta da ore a giorni. La condizionalità del sistema modello presentato qui permette per la trasformazione ripetuto da 4-OHT attivazione del transgene. Il sistema di espressione dipende dalla presenza di 4-OHT e quindi espressione KalTA4 controllata di un gene di interesse è reversibile (Figura 1D, b). In contrasto con il sistema Cre-ER T2 / Lox, che facilita un evento irreversibile ricombinazione genomica 28, KalTA4-ER T2 / UAS può essere attivato e disattivato dopo l&#39;aggiunta o la rimozione di 4-OHT e questo potenziale di induzione ripetuta è un vantaggio la tecnica sul sistema T2 / Lox Cre-ER. Tuttavia, la necessità di livelli costanti di 4-OHT è una limitazione se l&#39;esperimento deve essere prolungata da giorni a settimane.

La crescita eccessiva di una progenie di cellule preneoplastiche all&#39;interno di un foglio epiteliale altrimenti normale dipende fortemente l&#39;interazione con il suo microambiente. L&#39;interazione con il tessuto ospite è probabile che sia il principale determinante se una cellula preneoplastiche è in grado di stabilire una nicchia clonale di sviluppare ulteriormente in un cancro soffiato completa. Nonostante la sua importanza nello sviluppo, questa fase iniziale di progressione del cancro è inaccessibile in sistemi modello più comunemente utilizzati, in vivo. Il pesce zebra, Danio rerio, è un organismo modello consolidato per studi di imaging dal vivo a causa della sua trasparenza durante lo sviluppo, la possibilità di manipolazione genetica, e l&#39;accessibilità per i farmaci solubili in acqua. Recenti studi utilizzando un modello zebrafish larvale, overexpressing l&#39;oncogene umano HRAS G12V per trasformare cellule epiteliali, hanno mostrato che cellula ospite segnali derivati, in particolare H 2 O 2 determinanoil reclutamento di cellule immunitarie innate. È interessante notare che i reclutati cellule immunitarie, neutrofili e macrofagi, hanno mostrato di avere un ruolo trofico nel sostenere la proliferazione delle cellule preneoplastiche 2,3. Per comprendere primi eventi di innesco e la progressione tumorale nonché il contributo di una risposta infiammatoria, bisogna poter un&#39;immagine questi eventi dal punto di tempo prima poi. Pertanto è necessario controllare trasformazioni cellulari in modo specifico temporale e tissutale. Utilizziamo il sistema / UAS Gal4 che è stato adattato con successo da Drosophila 4 esprimere condizionale oncogene umano HRAS G12V sotto il controllo del promotore specifico pelle cheratina 4 (krt4) 5. La versione modificata del trascrizionale attivatore GAL4, cioè KalTA4 6, consente l&#39;espressione di HRAS G12V sotto il controllo del Upstream Attivazione Sequence (UAS). Per indurre l&#39;espressione condizionale attivatore trascrizionale, KalTA4 è stata fusa al-ligando dominio mutante del recettore degli estrogeni α umani (ER T2) 7, che si lega specificamente a 4 Hydroxytamoxifen (4-OHT) 1. In assenza di 4-OHT ER T2 è vincolato nel citoplasma da proteine ​​da shock termico. Dopo 4-OHT impegnare la heat-shock proteine ​​dissociano, permettendo una traslocazione nucleare del KalTA4-ER T2 e successiva attivazione dei UAS controllate gene di interesse 8 (Figura 1C, b). Poiché questo sistema di espressione dipende dalla presenza di 4-OHT, l&#39;espressione KalTA4 controllata di un gene di interesse è reversibile. In contrasto con il sistema Cre-ER T2 / Lox, che porta ad un evento di ricombinazione irreversibile, l&#39;induzione di attivazione trascrizionale da KalTA4-ER T2 è reversibile mediante aggiunta o la rimozione di 4-OHT. Il seguente protocollo allo<html> ws una trasformazione condizionale delle cellule della pelle in larve di zebrafish e un successivo monitoraggio delle interazioni con le cellule immunitarie innate di espressione della proteina fluorescente. Le metodologie di base utilizzate in questo protocollo sono simili ad alcune tecniche comunemente utilizzate all&#39;interno della comunità zebrafish 9-13. La generazione e l&#39;uso combinatoria delle linee transgeniche con la microiniezione di costrutti transgenici permette un approccio transitorio per trasformare solo singole cellule in modo mosaico. La permeabilità all&#39;ossigeno della pelle zebrafish embrionale e larvale aumenta la possibilità di time-lapse studi di imaging dal vivo di microscopia ad alta risoluzione da ore a giorni. Inoltre, la sua accessibilità ai farmaci idrosolubili consentirà futuri studi meccanicistici e il monitoraggio delle cellule eventi biologici in vivo che potrebbero portare a una migliore comprensione delle prime fasi di sviluppo del cancro. _content &quot;&gt; Questo protocollo può essere adattato per eseguire l&#39;espressione genica condizionale in qualsiasi tessuto di interesse nelle larve zebrafish, in maniera mosaico. Si può anche ottimizzare l&#39;impostazione per vivere immagine profondi tessuti diversi skin microscopio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1104">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:197px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:467px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(Z)-4-Hydroxytamoxifen&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H7904</td>
			<td>dilute in ethanol and store in the dark at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>20x/0,5 Ph2 &#8734;/0,17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>40x/1,2W Korr &#8734;/0,14-0,18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">63x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>63x/1.4 Oil Ph3 &#8734;/0,17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 510 META</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0171</td>
			<td>Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethylpolysiloxane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DMPSV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dow Corning high-vacuum silicone grease&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MKBL4135V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Program: heat 530, pull 200, velocity 80 and time 150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent stereoscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>M205 FA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjection mold TU-1</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microloader tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axiovert 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE mMACHINE Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pneumatic pico pump</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>PV820&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pneumatic pico pump</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-90A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B isothiocyanate-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8881</td>
			<td>10mg/&#956;l in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>M80</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BMC developmental biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PloS one 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine/MS-222</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Low Melting Point Agarose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td>25:24:1, v/v</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of innate immune and preneoplastic cell interactions using an inducible gal4/uas expression system in larval zebrafish skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Zigoti di un incrocio tra Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 e Tg (lysC: DsRed2) nz50Tg stati raccolti 10-15 minuti dopo la fecondazione (Figura 1A) per ottenere 1 embrioni cellule stadio. Dopo l&#39;iniezione gli embrioni sono state sollevate fino a 3 dpf, prima di induzione con 4 OHT e montaggio per l&#39;imaging dal vivo (Figura 1B). 2-6 hr alberino induzione montati gli embrioni sono stati collocati sia sotto un microscopio a fluorescenza invertito (Figura 2A) o un microscopio invertito confocale (Figura 2B-C) e ripreso per 2-3 ore con intervalli di 1,5 min. Cellule superficiali preneoplastiche possono essere identificati dai loro morfologia più arrotondata rispetto ai cheratinociti normali, nonché l&#39;emissione fluorescente verde della membrana localizzata eGFP-HRAS G12V. Aree di immagini sono stati selezionati per la co-localizzazione delle cellule cutanee preneoplastiche e cellule immunitarie innate (figura 2A punta di freccia). A causa della mig veloceprocesso razione dei neutrofili sono stati scelti gli intervalli time-lapse di essere tra 1-1,5 min con dimensioni di fase Z dello stack di 0,7-1,7 micron per ottenere proiezioni intensità massima (Figura 2, Video 1). Vi è una vasta gamma di comportamenti che possono essere osservati mentre l&#39;imaging dal vivo: neutrofili migrano accanto e sotto le cellule preneoplastiche (Figura 2C, video 1), formano contatti diretti alle cellule (Figura 2B e C), rimuovere i resti di cellule preneoplastiche che subiscono apoptosi (Video 1), o attivamente fagocitare parti di cellule preneoplastiche (non mostrati). Per catturare l&#39;intero spettro di interazioni, si consiglia di seguire i loro comportamenti per time-lapse immagini dal vivo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52107/52107fig1highres.jpg" width="700px" /> Figura 1: Schema per la trasformazione delle cellule della pelle condizionale in larve di zebrafish. (A) L&#39;immagine di uno zigote di Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; LysC: DsRed2) zebrafish a 10 minuti dopo la fecondazione (MPF). L&#39;uovo fecondato è circondato dal corion (freccia). Il sito per l&#39;iniezione è la blastodisco (asterisco), formata da torrenti citoplasmatici del tuorlo (freccia) che definisce il polo animale dell&#39;embrione. (B) Montaggio di larve di zebrafish. 60 millimetri piastra di Petri con un 18-20 mm foro (freccia) che è sigillato da un vetro di copertura 25 millimetri. Le larve zebrafish sono immobilizzato e montato sul vetro di copertura da 1% agarosio LMP. Soluzione 0.3x Danieau (freccia) contenente 5 mM 4-OHT viene utilizzato per coprire l&#39;agarosio LMP. (C) 4-OHT trasformazioni di cellule cutanee superficiali. (A) trasversale profilo sezione schematica della pelle larvale indotto. La pelle embrionale e larvale è composto da due strati di cellule epiteliali, uno strato di cellule superficiali ed uno strato di cellule basali cheratinociti che sono collegati alla membrana basale sottostante (BM). (B) espressione transiente sistema to indurre un clone di cellule preneoplastiche tra le cellule superficiali della cute. KalTA4-ER T2 è espresso esclusivamente nello strato più esterno della pelle guidato dal promotore krt4 (giallo). Espressione Mosaico di KalTA4-ER T2 attiva UAS (blu) eGFP-HRAS espressione G12V controllata in cellule superficiali, portando ad un clone di cellule preneoplastiche (verde). (D) Schema del sistema di espressione transiente. (A) cassette Tol2 del pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP vettore di espressione usata transitoriamente (b) induzione condizionale dell&#39;espressione attivatore trascrizionale.. KalTA4 è fuso al-ligando dominio mutante del recettore estrogeno umano α (ER T2), che si lega specificamente a 4 Hydroxytamoxifen (4-OHT). In assenza di 4-OHT ER T2 è vincolato nel citoplasma da proteine ​​da shock termico (Hsp90). Al 4-OHT vincolante Hsp90 dissocia, permettendo una traslocazione nucleare di KalTA4-ERT2 e successiva attivazione degli UAS controllati espressione eGFP-HRAS G12V. Scala bar A = 500 micron. <a href="/files/ftp_upload/52107/52107fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande della figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52107/52107fig2highres.jpg" width="700px" /> Figura 2: Immagini dal vivo di interazione delle cellule immunitarie preneoplastiche e innata. (AC) Le immagini di un 4 DPF Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) embrione, che è stato iniettato con pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP e trasposasi mRNA in uno stadio di cellule. Le immagini sono state scattate dopo 6 ore di induzione a 4-OHT (A) Vista laterale della regione tailfin a 6 ore dopo il trattamento, mostrando macchie di eGFP-HRAS G12V esprimono cellule della pelle (freccia), e lysC:. DsRed2 + neutrofili (freccia). (BC) Immagini rappresentative taken da un filmato confocale time-lapse, mostrando neutrofili (rosso) interazioni con le cellule della pelle eGFP-HRAS G12V esprimono (verde). (B) Una cellula preneoplastiche forma una breve proroga filopodial con il contatto con neutrofili (freccia). (C) neutrofili (rosso) è in stretto contatto con un clone di cellule della pelle preneoplastiche (verde). Bar Scala in A = 100 micron; B / C = 50 micron. <a href="/files/ftp_upload/52107/52107fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande della figura.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52107/Video_1.mov" target="_blank">Video 1</a> : Time-lapse immagini dal vivo di interazione delle cellule immunitarie preneoplastiche e innata. Time-lapse di un 4 DPF Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) embrione, iniettato con pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP e trasposasi mRNA in uno stadio di cellule. Confocale filmato time-lapse 6-9 hoUrs dopo 4-OHT induzione mostrando lysC: DsRed2 + neutrofili (rosso) interazioni con le cellule della pelle eGFP-HRAS G12V esprimono (verde). I neutrofili migrano accanto e sotto le cellule preneoplastiche e rimuovere i resti di una cellula preneoplastiche che subisce l&#39;apoptosi. Intervalli Time-lapse da 1,5 min oltre 3 ore con dimensioni di passo Z dello stack di 1.3 micron.

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Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin | Developmental Biology | Video

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Studiando i primi eventi di progressione delle cellule preneoplastiche e interazione innata cellule immunitarie è fondamentale per comprendere e curare il cancro. Qui si descrive un metodo per indurre condizionale trasformazioni cellule epiteliali e la successiva di immagini dal vivo di interazione innata cellule immunitarie con HRAS G12V esprimono le cellule della pelle in larve di zebrafish.

Immagini dal vivo di Innata immunitario e preneoplastiche interazioni cella utilizzando un / UAS Expression System inducibile GAL4 in Zebrafish larvale pelle

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

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Video: Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D organotipica Co-cultura Modello Sostenere midollare timica epiteliale proliferazione, differenziazione e promiscua genica

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Monitoraggio celle in Zebrafish GFP-transgenico Utilizzo del sistema fotoconvertibile PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Coltivazione dell'ovulo per Live cell Imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Stabilimento di larvale Zebrafish come modello animale per indagare Trypanosoma cruzi motilità In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

Quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra Larval utilizzando la microscopia Brightfield

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Preparazione dei test di Drosophila Larval e Pupal per l'analisi della divisione cellulare in live, tessuto intatto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control over gene expression timing, location, and amplitude using light as the inducing agent. In this protocol, an optogenetic expression system is used to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos. This system relies on an engineered transcription factor called TAEL based on a naturally occurring light-activated transcription factor from the bacterium E. litoralis. When illuminated with blue light, TAEL dimerizes, binds to its cognate regulatory element called C120, and activates transcription. This protocol uses transgenic zebrafish embryos that express the TAEL transcription factor under the control of the ubiquitous ubb promoter. At the same time, the C120 regulatory element drives the expression of a fluorescent reporter gene (GFP). Using a simple LED panel to deliver activating blue light, induction of GFP expression can first be detected after 30 min of illumination and reaches a peak of more than 130-fold induction after 3 h of light treatment. Expression induction can be assessed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and by fluorescence microscopy. This method is a versatile and easy-to-use approach for optogenetic gene expression.

Optogenetics is a powerful tool with wide-ranging applications. This protocol demonstrates how to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos using the blue light-responsive TAEL/C120 system.

Espressione GFP indotta dalla luce in embrioni di zebrafish utilizzando il sistema optogenetico TAEL/C120

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...