Name: a rapid and chemical-free hemoglobin assay with photothermal angular light scattering
Uploaded: 2016-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
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This research was supported by the research programs of the National Research Foundation of Korea (NRF) (NRF-2015R1A1A1A05001548 and NRF-2015R1A5A1037668).

Esperimenti con campioni di sangue sono stati eseguiti in conformità con le leggi e le linee guida istituzionali. I campioni sono stati i campioni di sangue residui che erano stati acquisiti ed elaborati in test clinici presso l&#39;istituto. 1. PT-AS Setup ottico NOTA: Si può utilizzare un tubo vuoto micro-capillare per una configurazione iniziale PT-AS. <ol><li> Montare un tubo micro-capillare vuota con diametri interno ed esterno rispettivamente di 200 e 330 micron, e una lunghezza superiore a ~ 5 cm un dispositivo capillare. infissi fibre disponibili in commercio possono essere usati come proiettori tubo. </li><li> Trovare ancorare un puntatore laser 650 nm, cioè, sondare sorgente luminosa, per illuminare il tubo capillare. Il fascio sonda deve essere maggiore del tubo capillare. Posizionare uno schermo (ad esempio, carta bianca) dietro il tubo capillare per osservare un reticolo periodico angolare. </li><li> Per la parte di rilevamento, rimuovere le lenti in una webcam per catturare direttamente il Scattrendo modello. Posizionare la webcam dietro il tubo capillare con un angolo di 25-35 ° rispetto alla direzione del fascio sonda. Assicurarsi che il modello periodica angolare prodotta dal tubo capillare può essere misurata con il rivelatore (Figura 1). Osservare il modello periodica angolare nel mezzo del sensore di immagine quando il sensore è posizionato correttamente. </li><li> Posizionare una sorgente di luce di eccitazione PT 532 nm per illuminare il tubo capillare. Posizionare la sorgente luminosa PT con qualsiasi angolazione, finché la luce di eccitazione PT sovrappone con fascio sonda sul tubo capillare e non raggiunge direttamente il rivelatore. PT eccitazione dei campioni di sangue utilizzando alta potenza ottica tipicamente migliora la PT-AS sensibilità, in quanto porta ad un cambiamento maggiore nella RI. <ol><li> Utilizzare la massima potenza ottica della sorgente di luce di eccitazione PT impiegato. Inoltre, assicurarsi che la luce di eccitazione PT si sovrappone alla luce sonda sul tubo capillare. Utilizzare una dimensione del fascio di luce di eccitazione PTalmeno doppia di quella della luce sonda per riscaldare l&#39;intero volume della sonda. </li></ol></li><li> Collocare un filtro passa lungo davanti al rivelatore per bloccare la luce 532 nm e misurare solo la luce della sonda 650 nm. </li><li> Installare un chopper nel cammino ottico della luce di eccitazione PT prima illuminare il tubo capillare. Il chopper ottico è utilizzato per modulare l&#39;intensità PT eccitazione luminosa. </li></ol> 2. Preparazione del campione di sangue <ol><li> Disegnare 6 ml di sangue intero fresco in condizione anemica in tubi di campionamento del sangue acido etilendiamminotetraacetico, e mescolare bene i campioni. Non è richiesta alcuna altra elaborazione. </li><li> Misurare i campioni di sangue utilizzando il sensore PT-AS entro 24 ore di estrazione per prevenire la coagulazione. </li></ol> 3. PT-AS Protocolli di misura <ol><li> Caricare un tubo micro-capillare con un campione di sangue per misurare. Riempire il capillare del sangue attraverso l&#39;azione capillare inserendo il tubo nel sangue sampio. Il volume di campione minimo richiesto per la misurazione è determinata dal diametro interno del tubo capillare e la dimensione fascio sonda. <ol><li> Impiegare un tubo con un diametro interno di 200 micron. La dimensione fascio sonda era di 2 mm nei risultati rappresentativi, suggerendo che la misurazione può essere eseguita con un volume di campione di&gt; 63 nl. </li></ol></li><li> Montare il tubo capillare nella posizione indicata nel dispositivo. </li><li> Accendere il laser della sonda 650 nm per illuminare il tubo micro-capillare del sangue-caricato. Il modello periodico angolare deve essere osservato con la webcam. </li><li> Accendere il 532-nm laser PT di eccitazione per illuminare il tubo. </li><li> Eseguire il chopper ottico per modulare l&#39;intensità della luce di eccitazione PT a 2 Hz. NOTA: Il razionale per la selezione di questa condizione di funzionamento è descritto in discussione e Kim et al. 12. <ol><li> Montare una ruota chopper nel montaggio testa del motore del chopper otticasistema. </li><li> Selezionare la casella di controllo del chopper, e utilizzare la manopola di comando nella console per impostare la frequenza di modulazione. </li><li> Eseguire l&#39;elicottero con la manopola di controllo. </li></ol></li><li> Registrare il modello di diffusione fluttuante tramite la webcam per 5 secondi in formato MPEG-4 (mp4). </li></ol> 4. Signal Processing NOTA: l&#39;elaborazione del segnale PT-AS è stata effettuata utilizzando un codice MATLAB laboratorio sviluppato. <ol><li> Caricare il file video per estrarre le immagini. Per ogni immagine [vedere figura 2 (a) per una immagine rappresentativa], ottenere il pattern dispersione media calcolando la media dei valori dei pixel lungo la direzione verticale [Figura 2 (b, c)]. </li><li> Valutare la trasformata di Fourier del modello dispersione media, e calcolare la fase alla frequenza spaziale picco. Eseguite le operazioni per tutti i fotogrammi di tutte le immagini registrate. </li><li> Utilizzando i valori di fase ottenuti da tutte le immagini, tracciare la fase temporalefluttuazione [Figura 2 (d)]. Si noti che la fase oscilla alla frequenza di modulazione PT. Prendere la trasformata di Fourier della fluttuazione di fase nel dominio del tempo, e di ottenere l&#39;ampiezza alla frequenza di modulazione. Questo segnale è indicato come PT-AS segnale [figura 2 (e)]. </li><li> Misurare la [Hb] di un campione di sangue convertendo il suo segnale PT-AS nella corrispondente [Hb] alla curva di taratura che si ottiene nel protocollo 5. </li></ol> 5. PT-AS Calibrazione <ol><li> Preparare campioni di sangue, con [Hb] valori che sono uniformemente distribuiti nel campo di rilevamento del sensore PT-AS (ad esempio 0 - 18 g / dl). </li><li> Prima di calibrazione, quantificare i valori [Hb] dei campioni utilizzando un analizzatore ematologico di riferimento. Misurare i segnali PT-AS dei campioni. </li><li> Ricavare una curva di calibrazione relativa [Hb] al segnale PT-AS eseguendo un lineare minimi quadrati, [Hb] = A [PT-AS segnale] + B, delle experimental risultati. Per le condizioni di esercizio di cui alla tabella 1, il rapporto tra [Hb] e il segnale di PT-AS è risultato essere [Hb] = 5.13 [segnale PT-AS] - 0.09. Usa il codice MATLAB per eseguire la misura lineare. </li></ol>

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	<li>Mokken, F. C., Kedaria, M., Henny, C. P., Hardeman, M., Gelb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+importance+of+erythrocyte+deformability,+a+hemorrheological+parameter.">The clinical importance of erythrocyte deformability, a hemorrheological parameter.</a> Ann. Hematol. 64 (3), 113-122 (1992).</li><li>Rosenblit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+three+methods+for+hemoglobin+measurement+in+a+blood+donor+setting.">Evaluation of three methods for hemoglobin measurement in a blood donor setting.</a> Sao Paulo Medical Journal. 117 (3), 108-112 (1999).</li><li>Van Kampen, E., Zijlstra, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+hemoglobinometry+II.+The+hemiglobincyanide+method.">Standardization of hemoglobinometry II. The hemiglobincyanide method.</a> Clin. Chim. Acta. 6 (4), 538-544 (1961).</li><li>Billett, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemoglobin+and+hematocrit.">Hemoglobin and hematocrit.</a> Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations. 3, (1990).</li><li>Kuenstner, J. T., Norris, K. H., McCarthy, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+hemoglobin+in+unlysed+blood+by+near-infrared+spectroscopy.">Measurement of hemoglobin in unlysed blood by near-infrared spectroscopy.</a> Appl. Spectrosc. 48 (4), 484-488 (1994).</li><li>Zwart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-wavelength+spectrophotometric+method+for+the+simultaneous+determination+of+five+haemoglobin+derivatives.">A multi-wavelength spectrophotometric method for the simultaneous determination of five haemoglobin derivatives.</a> Clin. Chem. Lab. Med. 19 (7), 457-464 (1981).</li><li>Kwak, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+the+in+vitro+hemoglobin+content+of+erythrocytes+using+the+photo-thermal+effect+of+the+heme+group.">Direct measurement of the in vitro hemoglobin content of erythrocytes using the photo-thermal effect of the heme group.</a> Analyst. 135 (9), 2365-2371 (2010).</li><li>Lapotko, D., Lukianova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-induced+micro-bubbles+in+cells.">Laser-induced micro-bubbles in cells.</a> International Journal of Heat Mass Transfer. 48 (1), 227-234 (2005).</li><li>Lapotko, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-induced+bubbles+in+living+cells.">Laser-induced bubbles in living cells.</a> Lasers in surgery and medicine. 38 (3), 240-248 (2006).</li><li>Lapotko, D. O., Romanovskaya, T. y. R., Shnip, A., Zharov, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+time-resolved+imaging+of+living+cells.">Photothermal time-resolved imaging of living cells.</a> Lasers in surgery and medicine. 31 (1), 53-63 (2002).</li><li>Yim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+spectral-domain+optical+coherence+reflectometry+for+direct+measurement+of+hemoglobin+concentration+of+erythrocytes.">Photothermal spectral-domain optical coherence reflectometry for direct measurement of hemoglobin concentration of erythrocytes.</a> Biosens. Bioelectron. 57, 59-64 (2014).</li><li>Kim, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary-scale+direct+measurement+of+hemoglobin+concentration+of+erythrocytes+using+photothermal+angular+light+scattering.">Capillary-scale direct measurement of hemoglobin concentration of erythrocytes using photothermal angular light scattering.</a> Biosens. Bioelectron. 74, 469-475 (2015).</li><li>S&#0248;rensen, H. S., Larsen, N. B., Latham, J. C., Bornhop, D. J., Andersen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+biosensing+based+on+interference+from+light+scattering+in+capillary+tubes.">Highly sensitive biosensing based on interference from light scattering in capillary tubes.</a> Appl. Phys. Lett. 89 (15), 151108 (2006).</li><li>Swinney, K., Markov, D., Bornhop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasmall+volume+refractive+index+detection+using+microinterferometry.">Ultrasmall volume refractive index detection using microinterferometry.</a> Rev. Sci. Instrum. 71 (7), 2684-2692 (2000).</li><li>Tarigan, H. J., Neill, P., Kenmore, C. K., Bornhop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary-scale+refractive+index+detection+by+interferometric+backscatter.">Capillary-scale refractive index detection by interferometric backscatter.</a> Anal. Chem. 68 (10), 1762-1770 (1996).</li><li>Bornhop, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-solution,+label-free+molecular+interactions+studied+by+back-scattering+interferometry.">Free-solution, label-free molecular interactions studied by back-scattering interferometry.</a> science. 317 (5845), 1732-1736 (2007).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+paper-based+test+for+measuring+blood+hemoglobin+concentration+in+resource-limited+settings.">Simple paper-based test for measuring blood hemoglobin concentration in resource-limited settings.</a> Clin. Chem. 59 (10), 1506-1513 (2013).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+and+rapid+blood+analysis+on+a+cell-phone.">Cost-effective and rapid blood analysis on a cell-phone.</a> Lab Chip. 13 (7), 1282-1288 (2013).</li><li>Poga&#269;nik, L., Franko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+organophosphate+and+carbamate+pesticides+in+vegetable+samples+by+a+photothermal+biosensor.">Detection of organophosphate and carbamate pesticides in vegetable samples by a photothermal biosensor.</a> Biosens. Bioelectron. 18 (1), 1-9 (2003).</li></ol>

No conflict of interest is declared.

Il sensore PT-AS rappresenta un metodo completamente ottica in grado di misurare direttamente [Hb] di campioni di sangue non trasformati. Il metodo quantifica [Hb] nel sangue utilizzando la risposta PT intrinseca di molecole di emoglobina negli eritrociti. Sotto illuminazione da luce 532 nm, le molecole di Hb assorbono l&#39;energia luminosa e producono calore. L&#39;aumento di temperatura risultante cambia il RI del campione di sangue. L&#39;elevata sensibilità del RI di BSI è stata sfruttata per misurare questo camb...

Un esame del sangue è comunemente eseguita per valutare la salute umana in generale e per rilevare i biomarcatori legati a determinate malattie. Ad esempio, la concentrazione di colesterolo nel sangue serve come criterio per iperlipidemia, che è strettamente correlato a malattie cardiovascolari e pancreatite. Il contenuto di glucosio nel sangue devono essere misurati di frequente, come il livello di glucosio è associata a complicazioni come la chetoacidosi diabetica e la sindrome iperosmolare iperglicemici. gravi malattie come la malaria, il virus dell&#39;immunodeficienza umana e la sindrome da immunodeficienza acquisita sono diagnosticati da esami del sangue, e la quantificazione dei componenti del sangue, tra cui eritrociti, trombociti, leucociti e consente lo screening del pancreas e malattie renali. L&#39;emoglobina (Hb), una componente fondamentale del sangue, rappresenta circa il 96% degli eritrociti, e trasporta l&#39;ossigeno a organi umani. alterazione significativa della sua concentrazione di massa ([Hb]) può indicare memodifiche tabolic, malattie epatobiliari e neurologiche, cardiovascolari e disturbi endocrinologici 1. [Hb] è quindi regolarmente misurato in esami del sangue. In particolare, i pazienti anemici, pazienti in dialisi, e le donne in gravidanza sono fortemente raccomandati per il monitoraggio [Hb] come un compito di vitale importanza 2. Sono stati così sviluppati diversi [Hb] metodi di rilevamento. Il metodo emoglobina cianuro, una delle tecniche più comuni per [Hb] quantificazione, impiega cianuro di potassio (KCN) per distruggere il doppio strato lipidico di eritrociti 3. L&#39;emoglobina cianuro prodotto dalla esposizioni chimiche ad alto assorbimento intorno a 540 nm; quindi, [Hb] misurazioni possono essere effettuate tramite analisi colorimetrica. Questo metodo è ampiamente utilizzato per la sua semplicità, ma i prodotti chimici utilizzati (ad esempio, KCN e ossido dimethyllaurylamine) sono tossici per l&#39;uomo e per l&#39;ambiente. Il regime ematocrito misura il rapporto del volume dei globuli rossi rispetto al totale vol sangueume attraverso separazione centrifuga; tuttavia richiede un volume relativamente grande di sangue (50-100 ml) 4. Spettrofotometria metodi di misura [Hb] appunto senza alcun prodotto chimico, ma misure a lunghezze d&#39;onda multiple e un grande volume di sangue sono necessari 5,6. Analogamente, sono stati proposti diversi metodi ottici di misura [Hb] compresi metodi di rilevamento basato su luce-dispersione, ma i loro precisione delle misure dipende fortemente dalla precisione del modello sangue teorico. Per superare queste limitazioni, sono stati recentemente proposti [Hb] metodi di rilevamento basati sull&#39;effetto fototermico (PT) di Hb 7. Hb, che è composto principalmente da ossidi di ferro, assorbe la luce a 532 nm e converte l&#39;energia luminosa in calore 8-10. Questo aumento di temperatura PT può essere rilevato otticamente misurando una variazione dell&#39;indice di rifrazione (RI) dei campioni di sangue. Yim et al. impiegato spettrale-dominio di coerenza ottica reflectometry per misurare la variazione ottica percorso di lunghezza PT in una camera di sangue contenente 11. Sebbene il metodo consente chemical free e misurazione diretta [Hb], l&#39;uso di uno spettrometro e una disposizione interferometrica possono ostacolare la sua miniaturizzazione. Recentemente abbiamo presentato un metodo di rivelazione [Hb], chiamato sensore foto-termico angolare light scattering (PT-AS), che è più adatto per il dispositivo di miniaturizzazione 12. Il sensore PT-AS sfrutta l&#39;elevata sensibilità RI dell&#39;interferometria retrodiffusione (BSI) per misurare le variazioni nel PT RI di un campione di sangue all&#39;interno di un tubo capillare. BSI sono stati utilizzati per misurare RI di varie soluzioni 13-15 e per monitorare le interazioni biochimiche in soluzione free 16. Il sensore PT-AS impiega disposizione ottica simile come in BSI, ma combina l&#39;installazione di eccitazione fototermico per misurare aumento PT di RI in campioni di sangue. principi di funzionamento del BSI e sensori PT-AS sono descritti in dettaglio altrove <sup&gt; 12,15. PT-AS sensore dimostrato alta sensibilità di misura [Hb] in un ampio campo di rilevamento (0,35-17,9 g / dl) ed è in grado di funzionare con volumi di campione di &lt;100 nl. Non è richiesto alcun condizionamento del campione di sangue, e il tempo di misurazione è solo ~ 5 sec. Qui, l&#39;apparato sperimentale e una dettagliata protocollo di misurazione sono descritti. Risultati rappresentativa PT-AS sono forniti utilizzando campioni di sangue di pazienti anemici, ed i risultati vengono confrontati con quelli di un analizzatore ematologico per valutare la precisione del sensore PT-AS.

<table><tbody><tr><td>650 nm laser pointer</td><td>LASMAC</td><td>LED-1</td><td>Probe light</td></tr><tr><td>Hollow round glass capillaries</td><td>VitroCom</td><td>CV2033</td><td>Blood sample container</td></tr><tr><td>Webcam</td><td>Logitech</td><td>C525</td><td>CMOS optical sensor</td></tr><tr><td>Optical chopper system</td><td>Thorlabs</td><td>MC2000-EC</td><td>Optical chopper</td></tr><tr><td>Plastic long-pass filter</td><td>Edmund Optics</td><td>#43-942</td><td>To reject 532-nm PT excitation light</td></tr><tr><td>Fiber clamp</td><td>Thorlabs</td><td>SM1F1-250</td><td>Capillary tube fixture</td></tr><tr><td>EDTA coated blood sampling tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>VACUETTE 454217</td><td>Blood sampling &amp;amp; anticoagulating</td></tr><tr><td>Hematology analyzer</td><td>Siemens AG</td><td>ADVIA 2120i</td><td>Reference hematology analyzer</td></tr></tbody></table>

a rapid and chemical-free hemoglobin assay with photothermal angular light scattering

Photo-termica angolare light scattering (PT-AS) è un metodo ottico innovativo per la misurazione della concentrazione di emoglobina ([Hb]) dei campioni di sangue. Sulla base della risposta fototermico intrinseca delle molecole di emoglobina, il sensore permette ad alta sensibilità, misura privo di sostanze chimiche di [Hb]. [Hb] capacità di rilevazione con un limite di 0,12 g / dl nel range di 0,35 - 17.9 g / dl è stata dimostrata in precedenza. Il metodo può essere facilmente implementato utilizzando dispositivi elettronici economico consumo come un puntatore laser e una webcam. L&#39;uso di un tubo micro-capillare come un contenitore di sangue permette anche il dosaggio dell&#39;emoglobina con un volume di sangue nanolitro scala ed un basso costo di esercizio. Qui, istruzioni dettagliate per le procedure di elaborazione di impostazione PT-AS ottica e di segnale sono presentati. protocolli sperimentali e risultati rappresentativi per i campioni di sangue in condizioni anemici ([Hb] = 5,3, 7,5, e 9,9 g / dl) sono anche previste, e le misurazioni vengono confrontati con quelli froma analizzatore ematologico. La sua semplicità di implementazione e gestione dovrebbe consentire la sua ampia adozione nei laboratori clinici e di risorse limitate.

Un test dell&#39;emoglobina è stata eseguita utilizzando il sensore PT-AS, e le sue misure sono stati confrontati con quelli di un analizzatore ematologico. L&#39;esperimento è stato condotto con una intensità luminosa PT di eccitazione di 1,4 W / cm 2, PT frequenza di modulazione di 2 Hz, e misura del tempo di 5 sec. La tabella 1 riassume le condizioni sperimentali. Le dimensioni del fascio di luce di eccitazione sonda e PT erano 5,5 e 2 mm, rispettivament...

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A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

A photo-thermal angular light scattering (PT-AS) sensor enables the rapid and chemical-free hemoglobin assay of nanoliter-scale blood samples. Here, details of the PT-AS setup and a measurement protocol for the hemoglobin concentration in blood are provided. Representative results for anemic blood samples are also presented.

Una rapida e chimico-libera emoglobina Assay con Photothermal angolare Light Scattering

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.6K Views.  Yonsei University. A photo-thermal angular light scattering (PT-AS) sensor enables the rapid and chemical-free hemoglobin assay of nanoliter-scale blood samples. Here, details of the PT-AS setup and a measurement protocol for the hemoglobin concentration in blood are provided. Representative results for anemic blood samples are also presented.

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Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

Staphylococcus aureus crescita con emoglobina umana come fonte di ferro

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

Gli antigeni Protetto funzionali globuli rossi dalla membrana innesto di Compact Poligliceroli Hyperbranched

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient's cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

Levitazione magnetica Accoppiato con Imaging portatile e analisi per la malattia di diagnostica

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Bioingegneria

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system. This system is constructed from a broadband white light source, a motorized filter wheel with a set of narrowband interference filters, a light guide, a collecting lens, a video zoom lens, and a monochromatic charged-coupled device (CCD) camera. An ellipsoidal cranial window is made in the skull bone of a rat under isoflurane anesthesia to capture in vivo multispectral diffuse reflectance images of the cortical surface. Regulation of the fraction of inspired oxygen using a gas mixture device enables the induction of different respiratory states such as normoxia, hyperoxia, and anoxia. A Monte Carlo simulation-based multiple regression analysis for the measured multispectral diffuse reflectance images at nine wavelengths (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, and 760 nm) is then performed to visualize the two-dimensional maps of hemodynamics and the light scattering properties of the in vivo rat brain.

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system.

La valutazione simultanea di Emodinamica cerebrale e Light Scattering proprietà del<em&gt; In Vivo</em&gt; Cervello del cervello usando l&#39;imaging di riflessione diffusa multispettrale

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

Neuroscienze

A Precision Medicine Tool for Measurement and Monitoring of Hemoglobin S in Sickle Cell Disease Patients Receiving Transfusion Therapy

Sickle cell disease (SCD) causes many severe health complications, including anemia, stroke, and acute chest syndrome. Red blood cell transfusion is the most commonly used therapy to treat or prevent these devastating complications. Other therapies include hydroxyurea therapy as well as bone marrow transplantation. Chronic intermittent transfusion is especially indicated to prevent recurrent strokes. However, transfusion therapy is associated with significant adverse effects (e.g., alloimmunization and iron overload). The point-of-care (POC) lateral flow immunoassay used here quantifies the %HbS in 15 min using a small patient blood sample. Utilizing this information, the healthcare provider is able to adjust blood transfusion volume for SCD patients to achieve the desired target HbS (most often &#60;30%), while reducing the risk of transfusion-related complications. When compared to laboratory hemoglobin electrophoresis data for 38 whole blood samples, the POC test performed with very high correlation and linear fit (slope = 0.9949, R2 = 0.9751). The strong agreement between the two hemoglobin S percentage (%HbS) quantifying methods shows that 89.5% of samples fall within &#177;5.2% HbS bias. The calibration for quantifying %HbS is built into the device to allow for an automated quantification of %HbS. This time- and cost-effective POC test thus allows the healthcare provider to make timely informed decisions when treating SCD patients, using accurate and updated data.

We have developed a point-of-care immunoassay to rapidly quantify hemoglobin S (HbS) levels during transfusion therapy for sickle cell disease (SCD) patients. By applying a small amount of treated blood to the device, the healthcare provider can determine the %HbS in a SCD patient to immediately inform clinical decisions.

Sickle cell disease (SCD) causes many severe health complications, including anemia, stroke, and acute chest syndrome. Red blood cell transfusion is the ...

Medicina

<meta charset="utf8"></head><body>Ottimizzazione della spettroscopia VIS-SWIR per le molecole biologiche

Characterization of Biological Absorption Spectra Spanning the Visible to the Short-Wave Infrared

For noninvasive light-based physiological monitoring, optimal wavelengths of individual tissue components can be identified using absorption spectroscopy. However, because of the lack of sensitivity of hardware at longer wavelengths, absorption spectroscopy has typically been applied for wavelengths in the visible (VIS) and near-infrared (NIR) range from 400 to 1,000 nm. Hardware advancements in the short-wave infrared (SWIR) range have enabled investigators to explore wavelengths in the ~1,000 nm to 3,000 nm range in which fall characteristic absorption peaks for lipid, protein, and water. These molecules are difficult to visualize in the VIS-NIR and can provide label-free sources of biological contrast. Furthermore, lower SWIR absorption has been observed for melanin, the primary chromophore responsible for skin pigmentation. In vivo&#160;optical devices like clinically standard pulse oximeters have been found to have reduced accuracy in people with darkly pigmented skin, possibly because of the stronger melanin absorption in the VIS range. Thus, error associated with skin pigmentation could be reduced by using devices operating in the SWIR. Optical instrument design is facilitated by the understanding of the absorption properties of core tissue components from the VIS to the SWIR range. This article describes protocols and instrumentation for obtaining VIS-SWIR absorption spectra of common tissue absorbers: oxygenated hemoglobin, deoxygenated hemoglobin, melanin, water, and lipid.

<meta charset="utf8"></head><body>Caratterizzazione degli spettri di assorbimento biologico che vanno dal visibile all'infrarosso a onde corte

Biological samples have distinct optical characteristics in the short-wave infrared (SWIR) compared to the visible (VIS) and near-infrared (NIR) wavelength ranges. However, recording pure SWIR absorption spectra is challenging and rarely conducted for biological molecules. This article presents a method to characterize the VIS-SWIR absorption spectra of biological absorbers.

Caratterizzazione degli spettri di assorbimento biologico che vanno dal visibile all'infrarosso a onde corte

For noninvasive light-based physiological monitoring, optimal wavelengths of individual tissue components can be identified using absorption spectroscopy. ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive conjugates was compared to uncoated PVC tubes, latex tubes, and a stent for intravascular application that was placed inside the PVC tubes. Evaluation of hemocompatibility was done using an in vitro hemodynamic loop model that is recommended by the ISO standard 10993-4. The tubes were cut into segments of identical length and closed to form loops avoiding any gap at the splice, then filled with human blood and rotated in a water bath at 37 &#176;C for 3 hours. Thereafter, the blood inside the tubes was collected for the analysis of whole blood cell count, hemolysis (free plasma hemoglobin), complement system (sC5b-9), coagulation system (fibrinopeptide A), and leukocyte activation (polymorphonuclear elastase, tumor necrosis factor and interleukin-6). Host cell activation was determined for platelet activation, leukocyte integrin status and monocyte platelet aggregates using flow cytometry. The effect of inaccurate loop closure was examined with x-ray microtomography and scanning electron microscopy, that showed thrombus formation at the splice. Latex tubes showed the strongest activation of both plasma and cellular components of the blood, indicating a poor hemocompatibility, followed by the stent group and uncoated PVC tubes. The coated PVC tubes did not show a significant decrease in platelet activation status, but showed an increased in complement and coagulation cascade compared to uncoated PVC tubes. The loop model itself did not lead to the activation of cells or soluble factors, and the hemolysis level was low. Therefore, the presented in vitro hemodynamic loop model avoids excessive activation of blood components by mechanical forces and serves as a method to investigate in vitro interactions between donor blood and vascular medical devices.

Presented here is a protocol for a standardized in vitro hemodynamic loop model. This model allows to test the hemocompatibility of perfusion tubes or vascular stents to be in accordance with ISO (International Organization for Standardization) standard 10993-4.

Un modello di loop emodinamico in vitro per indagare l'emocitocompatibilità e l'attivazione delle cellule ospiti dei dispositivi medici vascolari

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The use of experimental animal models of iron overload or deficiency has been instrumental to advance knowledge of the mechanisms involved in the systemic and cellular regulation of iron homeostasis. The measurement of total iron levels in animal tissues is commonly performed with atomic absorption spectroscopy or with a colorimetric assay based on the reaction of non-heme iron with a bathophenanthroline reagent. For many years, the colorimetric assay has been used for the measurement of the non-heme iron content in a wide range of animal tissues. Unlike atomic absorption spectroscopy, it excludes the contribution of heme iron derived from hemoglobin contained in red blood cells. Moreover, it does not require sophisticated analytical skills or highly expensive equipment, and can thus be easily implemented in most laboratories. Finally, the colorimetric assay can be either cuvette-based or adapted to a microplate format, allowing higher sample throughput. The present work provides a well-established protocol that is suited for the detection of alterations in tissue iron levels in a variety of experimental animal models of iron overload or iron deficiency.

Here, a protocol for the measurement of the non-heme iron content in animal tissues is provided, using a simple, well-established colorimetric assay that can be easily implemented in most laboratories.

Misurazione del contenuto di ferro non eme tissutale utilizzando un saggio colorimetrico basato su bathofenantrolina

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

Una rapida e chimico-libera emoglobina Assay con Photothermal angolare Light Scattering

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Staphylococcus aureus crescita con emoglobina umana come fonte di ferro

Gli antigeni Protetto funzionali globuli rossi dalla membrana innesto di Compact Poligliceroli Hyperbranched

Levitazione magnetica Accoppiato con Imaging portatile e analisi per la malattia di diagnostica

La valutazione simultanea di Emodinamica cerebrale e Light Scattering proprietà del

A Precision Medicine Tool for Measurement and Monitoring of Hemoglobin S in Sickle Cell Disease Patients Receiving Transfusion Therapy

Caratterizzazione degli spettri di assorbimento biologico che vanno dal visibile all'infrarosso a onde corte

Caratterizzazione degli spettri di assorbimento biologico che vanno dal visibile all'infrarosso a onde corte

Caratterizzazione degli spettri di assorbimento biologico che vanno dal visibile all'infrarosso a onde corte

Un modello di loop emodinamico in vitro per indagare l'emocitocompatibilità e l'attivazione delle cellule ospiti dei dispositivi medici vascolari

Misurazione del contenuto di ferro non eme tissutale utilizzando un saggio colorimetrico basato su bathofenantrolina