Questo progetto è stato finanziato da sovvenzioni dal Ministero della Pubblica Istruzione di Singapore (MOE, codice di autorizzazione 2013-T2-2-126) e l&#39;Istituto Nazionale della Salute, Stati Uniti d&#39;America (NIH, concedere numero 1R21AT008452-01A1). TY ha ricevuto una borsa di studio di laurea del Dipartimento di Scienze Biologiche NUS. Ringraziamo l&#39;unità confocale del Centro NUS per Bioimmagini Sciences (CBIS) per il loro costante supporto.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con i protocolli Istituzionali Animal Care e del Comitato Usa (IACUC) approvato per l&#39;Università Nazionale di Singapore (R14-293). 1. I pesci allevamento e alla raccolta di embrioni <ol><li> Sollevare WT, ctsk: nlGFP 24, RANKL: HSE: CFP 24, e OSX: mCherry 21 mono o pesce Medaka compound-transgenici a 26 ° C sotto un ciclo di luce controllata (14 h, 10 h scuro) per indurre la deposizione delle uova. </li><li> la deposizione delle uova quotidiana si svolge durante i primi 30 minuti dopo che la luce è accesa. Le uova si attaccano insieme attraverso filamenti e attribuiscono al ventre della femmina per diverse ore. Utilizzare una rete a maglia fine per la cattura di un adulto di sesso femminile che trasporta un cluster di uovo. Lasciate che il pesce riposare per breve tempo in rete e poi massaggiare delicatamente l&#39;addome del pesce per mettere a nudo con attenzione il cluster ovulo fecondato dall&#39;addome della femmina. NOTA: Una sana Medaka femminilepuò produrre 10 - 20 uova al giorno per circa 5 mesi. </li><li> Mettere le uova in una plastica Petri 60 millimetri. Utilizzare una pipetta di plastica per lavare gli embrioni con 5 - 10 ml di 0.3x Danieau del medium soluzione (pesce; 19,3 mM NaCl, 0,23 mm KCl, 0,13 mm MgSO 4, 0,2 mM Ca (NO 3) 2 e 1,7 mm HEPES, pH 7.0). Aggiungere 1 ml di 0,25% (w / v) di metilene blu stock di 2,5 L di medio pesce per prevenire la crescita fungina. </li><li> rotolare delicatamente grappolo di uova in modo da formare un nodo di filamenti di attacco. Usare pinze per rimuovere con attenzione i filamenti allegato dal cluster ovulo fecondato per ottenere singoli embrioni (Figura 1A). </li><li> Fase gli embrioni in base al Iwamatsu 2004 13. </li><li> Cultura 20 - 30 embrioni per 60 millimetri di plastica Petri in un incubatore a 28 °. Cambiare la media giornaliera di garantire il normale sviluppo degli embrioni. NOTA: il tempo attorno al palco schiusa (8-9 d postfertilization,DPF) è particolarmente critica per la sopravvivenza. Rimuovere chorions libero di fluttuare per mantenere la media pulito e per garantire buoni tassi di sopravvivenza delle larve. </li></ol> 2. Screening embrioni transgenici <ol><li> Utilizzare uno stereomicroscopio dotato di una lampada al mercurio per l&#39;imaging di fluorescenza e GFP, RFP, e filtri CFP per lo screening degli embrioni transgenici per l&#39;espressione reporter fluorescente utilizzando 40X di ingrandimento. </li><li> Visivamente identificare osx: mCherry embrioni di espressione giornalista mCherry nei primi anni di formazione ossa craniche, come il cleithrum, su entrambi i lati della testa posteriore (Figura 1B, freccia), e il parasphenoid, in una posizione centrale nel cranio ventrale ( Figura 1B, punta di freccia). NOTA: l&#39;espressione Reporter inizia dal 5 in poi DPF 21. </li><li> Identificare ctsk: nlGFP embrioni di forte espressione nlGFP nella testa (Figura 1C, freccia) e la coda (Figura 1C, punta di freccia), a partire da6 DPF. NOTA: osteoclasti endogeni formano solo dopo 21 DPF. nlGFP-cellule che esprimono in questa fase iniziale (6 DPF) non sono osteoclasti, ma altri, finora non caratterizzato, ctsk cellule -positive 24. </li><li> Identificare RANKL: HSE: PCP embrioni transgenici di espressione ubiquitaria PCP dopo un breve trattamento termico d&#39;urto per 20 minuti a 39 ° C, condotto presso 2 DPF o poi ai fini dello screening. NOTA: Il RANKL e CFP transgeni sono sotto il controllo dello stesso bidirezionale Heat Shock Element (HSE). Espressione PCP indica successo RANKL induzione 24. </li><li> Eseguire un 1,5-2 h termico trattamento d&#39;urto a 9 DPF o poi per indurre un gran numero di osteoclasti ectopiche nella regione del tronco, che si traduce di conseguenza in un fenotipo osteoporosi simile 24. NOTA: espressione RANKL transgenico indotta a 9 risultati DPF in una attivazione ectopica di cellule progenitrici degli osteoclasti dormienti, che endogeno non viene attivatoprima del 21 DPF. Usare un bagno d&#39;acqua per ottenere stabili 39 ° C condizioni. Lasciate che i Petri contenenti embrioni Medaka galleggiano sulla superficie dell&#39;acqua. Assicurarsi che il coperchio della scatola di Petri è asciutto per evitare l&#39;affondamento del piatto. </li><li> Schermo embrioni da linee di composti, come RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP doppio transgenico e OSX: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP triplo transgenico, secondo il pattern di espressione di ogni individuo transgene. NOTA: gli embrioni transgenici omozigoti emizigote e sono stati contraddistinti da diversi livelli di fluorescenza del transgene giornalista. embrioni omozigoti avevano una intensità di fluorescenza che è risultata approssimativamente raddoppiata rispetto a quella dei transgenici hemizygous. Linee di composti che erano omozigoti per entrambi RANKL: HSE: PCP e ctsk: nlGFP sono stati ottenuti incrossing ripetuto per diverse generazioni. Per triplo transgenico OSX: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP pesce,<html> RANKL omozigote: HSE: CFP / ctsk: pesce nlGFP sono stati incrociati con OSX omozigote: vettori mCherry. La progenie triple-transgenici eterozigoti risultante sono state sollevate e incrossed di ottenere embrioni omozigoti per RANKL: HSE: CFP. Il RANKL: HSE: PCP transgene deve essere omozigote per ottenere l&#39;induzione efficiente degli osteoclasti ectopiche. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55025/55025fig1.jpg" /> Figura 1: WT e transgenici Medaka embrioni a 7 D Postfertilization (DPF). A. embrioni WT osservati con illuminazione campo chiaro. B. Embrioni transgenici che mostrano OSX: espressione mCherry intorno al cleithrum (freccia) e parasphenoid (punta di freccia). C. Embrioni transgenici che mostrano ctsk: espressione nlGFP nella testa (freccia) e la coda (punta di freccia). Barre di scala: 500 micron.025 / 55025fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 3. trattamento con i bifosfonati di Medaka larve <ol><li> Preparare soluzioni contenenti diverse concentrazioni dei bifosfonati (BPS) per gli studi dose-risposta. NOTA: La BP esemplare utilizzato in questo protocollo è l&#39;alendronato. <ol><li> Sciogliere alendronato in mezzo pesce ad una concentrazione di 100 ug / ml per preparare una soluzione madre. </li><li> Utilizzare un vortex per garantire la completa dissoluzione. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C. </li><li> Preparare diverse soluzioni di lavoro diluendo la soluzione madre con il mezzo pesce per una serie di concentrazioni (cioè, 25, 37,5, 50, 62,5 e 75 mg / mL). NOTA: Diversi farmaci possono avere diverse assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione (ADME parametri), che devono essere considerati durante i test con questo sistema larve Medaka. Inoltre, la solubilità della droga e stabilità possono variare quandoapplicata come soluzione acquosa. Meno composti idrosolubili potrebbero dover prima essere sciolto in solventi organici, come DMSO. In questo caso, una soluzione madre viene preparata in DMSO, che viene poi ulteriormente diluito in terreno pesci. Si noti che le soluzioni di lavoro in acqua (media) pesci possono essere conservati in frigorifero per diversi sett. Tuttavia, le soluzioni contenenti DMSO devono essere conservati a temperatura ambiente per evitare la cristallizzazione. </li></ol></li><li> Trasferimento Medaka larve in piastre a sei pozzetti (sei larve / e) per il successivo trattamento BP (alendronato). </li><li> Rimuovere il mezzo di pesce con cura utilizzando una pipetta di plastica pulito e aggiungere un piccolo volume (circa. 0,5 mL) di soluzione alendronato in ogni pozzetto. </li><li> Evitare medio pesce rimasto, come la soluzione di BP aggiunto potrebbe essere diluito, il che è particolarmente importante per le soluzioni alendronato meno concentrate. </li><li> Rimuovere un piccolo volume di soluzione di alendronato (fino a 0,5 mL) da ogni pozzetto con una pipetta di plastica pulito e sostituirlo con un volu grandeme (4 mL) di soluzione alendronato. </li><li> Cambiare media quotidianamente per garantire il normale sviluppo degli embrioni. </li></ol> 4. La colorazione dal vivo di matrice mineralizzata con l&#39;osso <ol><li> Sciogliere 0.5 g di alizarina complessone (ALC, acido alizarina-3-methyliminodiacetic) o 0,05 g di calceina in 50 ml di terreno di pesce per preparare soluzioni madre 1% e 0,1% rispettivamente. Utilizzare un vortex per garantire la completa dissoluzione. NOTA: media Pesce senza l&#39;aggiunta di blu di metilene è utilizzato in questa e nelle fasi successive per ridurre autofluorescenza nelle larve. </li><li> Utilizzare un filtro siringa e monouso (0,2 micron) per filtrare la soluzione colorante. Conservare la soluzione filtrata al buio a temperatura ambiente. NOTA: Il colore della, chiara soluzione colorante ALC filtrato è di colore giallo scuro all&#39;arancio. Il colore della soluzione calceina chiaro filtrato è di colore giallo brillante. Le soluzioni possono essere utilizzati per diversi mesi. </li><li> Diluire la soluzione filtrata ALC o calceina magazzino 1:10 in media pescee incubare le larve Medaka per 1,5 - 2 ore (0,1% soluzione ALC) o 2 - 2,5 h (0,01% soluzione calceina) in un incubatore a 28 ° se si utilizzano le larve tra il 9 e il 17 DPF. Conservare i campioni al buio. </li><li> Trasferire le larve medio pesce fresco con una pipetta di plastica pulito. </li><li> Rimuovere il supporto di pesce con una pipetta di plastica pulito e aggiungere mezzo di pesce fresco. Ripetere questo passaggio per 3 - 4 volte fino a quando nessuna soluzione rossi o giallo-macchiato (ALC o calceina, rispettivamente) è rimasto sopra. Lasciare le larve in mezzo pesce per 30 - 60 min prima di montaggio per l&#39;imaging di evitare epifluorescenza dal mezzo. NOTA: 0,1% soluzione ALC colorazione è dannoso per Medaka larve per tempi di esposizione prolungati. I tempi di incubazione di più di 2 h influenzano la sopravvivenza delle larve. Concentrazione e tempo di colorazione devono pertanto essere ottimizzato per diverse fasi, al fine di ottenere risultati ottimali di sopravvivenza degli embrioni e di colorazione. </li></ol> 5. vivo imaging di fluorescenza </<html> p&gt; <ol><li> Anestetizzare le larve Medaka con 0,01% Tricaine (etil metanosolfonato 3-aminobenzoate) in media del pesce. NOTA: anestetizzati larve diventano immobilizzato dopo 5 - 10 minuti in soluzione Tricaine e di solito sono distesi o su un fianco o le spalle. </li><li> Utilizzare un microloader plastica per orientare le larve in base alla regione di interesse. L&#39;orientamento delle larve utilizzato in questo protocollo è laterale. </li><li> Utilizzare uno stereomicroscopio con illuminazione a fluorescenza per l&#39;imaging. Utilizzare alto ingrandimento quando si scattano immagini, concentrandosi su diverse parti della larve (testa, tronco anteriore, il tronco posteriore, e la coda). Stitch singole immagini insieme alla sovrapposizione delle regioni utilizzando un apposito software di elaborazione delle immagini (inserti in Figura 3G). NOTA: Ciò contribuisce a migliorare la qualità di immagine di tutte le parti del corpo interessate nel piano focale corretto. </li><li> Rientro le larve al mezzo di pesce per il recupero dopo l&#39;imaging. </li></ol>tle &quot;&gt; 6. Vivere confocale Imaging <ol><li> Anestetizzare le larve con 0,01% Tricaine in media pesce per 5 - 10 minuti fino a quando diventano immobilizzato. </li><li> Sciogliere bassofondente agarosio all&#39;1,5% in media pesci riscaldandolo in un forno a microonde. Raffreddare la soluzione a circa 30 ° C. </li><li> Aggiungere 0,5-1 ml di liquido 1,5% basso punto di fusione agarosio in media pesce per una capsula di Petri con fondo trasparente. Trasferire le larve anestetizzato nella soluzione con una pipetta di plastica pulito. NOTA: prendere precauzioni speciali che la temperatura del liquido agarosio bassofondente è abbastanza basso da non danneggiare le larve. </li><li> Prima solidifica agarosio, utilizzare un microloader plastica per spingere le larve al fondo del piatto Petri e orientare le larve in base alla regione di interesse. L&#39;orientamento delle larve utilizzato in questo protocollo è laterale. NOTA: I campioni sono pronti per confocale l&#39;imaging dal vivo dopo l&#39;agarosio solidifica completamente. </li><li> Utilizzare un microscopio confocale a ACQimmagini uire. </li><li> Utilizzare una linea laser 543 nm per le analisi mCherry e ALC colorazione. Utilizzare una linea laser 488 nm per nlGFP e analizza calceina colorazione. </li><li> Dopo l&#39;imaging, aggiungi medio pesce alla piastra di Petri e utilizzare un paio di aghi sottili siringa (27 G x 1 ½ &quot;) per rimuovere con attenzione le larve dal agarosio. Trasferire le larve con residuale attaccato agarosio ad una capsula di Petri con il mezzo di pesce per il recupero . </li><li> Elaborare le immagini utilizzando una immagine software di analisi 27. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione o finanziari.

I passaggi critici all&#39;interno del protocollo È essenziale che le condizioni per il trattamento shock termico sono coerenti e stabili quando si confrontano i diversi campioni. Condizioni di temperatura stabili garantiscono livelli simili di RANKL induzione nelle larve transgeniche e, di conseguenza, la formazione di osteoclasti comparabili, che può essere confermata da screening per ctsk: espressione nlGFP. In definitiva, questo porta ad un grado simile di riassorbimento osseo in...

Lo scheletro vertebrato fornisce supporto strutturale e protezione per organi, permette la mobilità, e serve come fonte di calcio. Per tutta la vita, la matrice ossea extracellulare viene continuamente girato per mantenere la stabilità ossea e rigidità. Questo processo richiede l&#39;attività strettamente coordinato e interazione degli osteoblasti che formano l&#39;osso e osteoclasti osso-riassorbono. Gli osteoblasti derivano da progenitori mesenchimali multipotenti e producono collagene per formare il osteoide, la parte proteica della matrice ossea 10. Osteoblasti interagiscono con gli osteoclasti per realizzare un&#39;attività equilibrata di entrambi i tipi di cellule, che è richiesto per controllare l&#39;omeostasi ossea 7. A causa di queste interazioni normative complesse, risposte al trattamento farmacologico e l&#39;omeostasi ossea non possono essere completamente esaminati utilizzando studi in vitro. Quindi, vi è una forte richiesta di modelli animali. Rispetto alle impostazioni di coltura cellulare, in modelli in vivo può fornireinformazioni preziose nelle reti pluricellulari all&#39;interno dell&#39;ambiente osso. Esistono numerosi modelli di mouse per una varietà di malattie delle ossa umane, tra cui l&#39;osteoporosi 16. Tuttavia, la dimensione e l&#39;accessibilità di embrioni di topo rappresentano significative limitazioni per l&#39;imaging dal vivo di processi scheletrici. Piccoli pesci teleostei, invece, servire come un&#39;alternativa interessante per l&#39;imaging in vivo. Zebrafish (Danio rerio) e Medaka (Oryzias latipes) sono diventati popolari modelli animali per la ricerca scheletrico nel corso degli ultimi due decenni, 17, 19, 22, 24. Bone nei pesci teleostei e nei mammiferi è molto simile, sia strutturale che a livello fisiologico, e molti dei geni regolatori chiave e vie di segnalazione sono conservati 3. Come nei mammiferi, pesci teleosteo regolare accuratamente l&#39;attività degli osteoblasti e osteoclasti per bilanciare la formazione dell&#39;osso ed il riassorbimento 26. Ancora più importante, la chiarezza ottica di fish larve permette l&#39;utilizzo di reporter fluorescenti per marcare le cellule ossee e calcificate matrice scheletrico 8, 9, 12, 21, 23, che facilita l&#39;osservazione dei processi cellulari in animale vivente. Inoltre, una serie di strumenti genetici è stato generato per facilitare la ricerca biomedico rilevante nel pesce. Per Medaka in particolare, i metodi per mirata mutazione genetica da CRISPR / Cas9 2, cellule-lineage tracing 6, e transgenesi 14 sono state di recente costituzione e sono ora ampiamente in uso 15 site-specific. Piccole larve teleosteo sono stati utilizzati con successo per gli schermi chimici, che hanno portato alla scoperta di diversi farmaci farmacologicamente rilevanti 1, 18. Pesce larve sono tolleranti a basse concentrazioni di DMSO e sono in grado di assorbire composti dal loro ambiente acquatico, sia attraverso la pelle o attraverso il tratto gastrointestinale 1, 5. Il nostro laboratorio in precedenza rappresentanteorted linee Medaka transgenici che esprimono i reporter fluorescenti in cellule ossee sotto il controllo di vari osteoblasti e promotori specifici osteoclasti. Questi includono osteoblasti prematuri (collagene 10A1, col10a1; Osterix, OSX) 20, 21, osteoblasti maturi (osteocalcina, OSC) 27, e osteoclasti (catepsina K, ctsk) 24. Abbiamo anche generato una linea transgenica che esprime il fattore di osteoclasti che induce Receptor Activator of Nuclear factor-kB Ligand (RANKL) sotto il controllo di un shock termico-inducibile promotore 24. Induzione di RANKL in questo sistema porta alla formazione ectopica di osteoclasti attivi. Questo porta ad un aumento riassorbimento osseo e una grave fenotipo osteoporosi simile, con drasticamente ridotta mineralizzazione nei corpi vertebrali. Abbiamo recentemente dimostrato che l&#39;attività degli osteoclasti in questo modello può essere bloccato dalla bifosfonati etidronato e alendronato, TWO farmaci comunemente utilizzati nella terapia dell&#39;osteoporosi umana, convalidando così Medaka come sistema modello adatto per l&#39;osteoporosi 27. Grazie alla loro grande prole, rapido sviluppo, e piccole dimensioni di embrioni, transgenici Medaka larve sono particolarmente adatta per lo screening su larga scala di farmaci osteoporosi e per l&#39;analisi in vivo del comportamento delle cellule ossee. Gli studi in Medaka quindi possono integrare in modo efficiente esperimenti in colture cellulari e nei topi che hanno lo scopo di scoprire nuovi bersagli terapeutici e nuove terapie per i disturbi delle ossa umane. Nel presente studio, si descrive un protocollo per il trattamento di Medaka larve osso-giornalista con il farmaco osteoporosi comuni, l&#39;alendronato. Descriviamo anche in dettaglio come trattate le larve sono montati e preparati per l&#39;imaging dal vivo di matrice ossea e cellule ossee. Questi protocolli possono essere facilmente adattate ad altri composti chimici di piccole dimensioni che sia il lavoro come anabolizzanti osso o droghe riassorbimento osseo. &lt;/ P&gt;

<table><tbody><tr><td>Alendronate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A4978</td><td></td></tr><tr><td>alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone</td><td>Sigma</td><td>A3882</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (1.4.3.67)</td><td>National Institute of Health (NIH)</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>LSM 510 Meta confocal&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Image Browser (4.2.0.121)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html</td></tr><tr><td>Micro-loader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Eppendorf ep T.I.P.S 20 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>NIS-Elements BR 3.0 software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6 (13.0.0.0)</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ1000 stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

drug treatment and in vivo imaging of osteoblast-osteoclast interactions in a medaka fish osteoporosis model

Che formano l&#39;osso osteoblasti interagiscono con osteoclasti osso-riassorbono per coordinare il fatturato di matrice ossea e per controllare l&#39;omeostasi scheletrica. Medaka e larve di pesce zebra sono ampiamente utilizzati per analizzare il comportamento delle cellule ossee durante la formazione ossea, degenerazione, e la riparazione. La loro chiarezza ottica permette la visualizzazione di cellule ossee fluorescenza etichettati e coloranti fluorescenti legati alla matrice mineralizzata scheletrico. Il nostro laboratorio ha generato pesci transgenici Medaka che esprimono il fattore di osteoclasti che induce Receptor Activator of Nuclear factor-kB Ligand (RANKL) sotto il controllo di un promotore di calore shock inducibile. Espressione ectopica di risultati RANKL in eccesso formazione degli osteoclasti attivati, che possono essere visualizzati in linee giornalista con espressione nlGFP sotto il controllo del K (ctsk) promotore catepsina. induzione RANKL e la formazione degli osteoclasti ectopica porta a gravi fenotipi osteoporosi-like. Composto transgenico Medaka Lines che esprimono ctsk: nlGFP in osteoclasti, nonché mCherry sotto il controllo del Osterix (osx) promotore in osteoblasti prematuri, possono essere utilizzati per studiare l&#39;interazione di entrambi i tipi di cellule. Questo facilita l&#39;osservazione in vivo del comportamento cellulare in condizioni di degenerazione e riparazione ossea. Qui, descriviamo l&#39;uso di questo sistema per testare un farmaco comunemente utilizzato nella terapia dell&#39;osteoporosi umana e descrivere un protocollo per l&#39;imaging in tempo reale. Il modello Medaka integra studi in colture cellulari e topi, e offre un nuovo sistema per l&#39;analisi in vivo di azione farmaco nel sistema scheletrico.

numeri uovo abbondanti, così come le piccole dimensioni delle larve, fanno Medaka un modello eccellente per lo screening farmacologico. Una singola piastra di sei pozzetti è stato usato per coltura fino a 36 larve, sufficiente a fornire dati statisticamente significativi. Un altro grande vantaggio di utilizzare pesce per analisi scheletrica è la possibilità di fare imaging dal vivo. La trasparenza delle larve consente l&#39;uso di proteine ​​fluorescenti per marcare le cellule ossee, nonché l&#39;uso di coloran...

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Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Il trattamento di droga e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di osteoblasti-osteoclasti interazioni in un modello di Medaka pesce osteoporosi

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

drug-treatment-vivo-imaging-osteoblast-osteoclast-interactions-medaka

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

9.2K Views.  National University of Singapore. Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

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Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

Intra-iliaca iniezione per un efficiente e selettivo Modellazione di microscopico metastasi ossee

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Modelli di lesione di Zebrafish adulto per studiare gli effetti del Prednisolone nella rigenerazione di tessuto osseo

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Biologia dello sviluppo

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequenziale<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di osteogeniche cellule staminali / progenitrici durante la frattura di riparazione

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Medicina

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

Tomografia Computerizzata e Optical Imaging di osteogenesi-angiogenesi Accoppiamento per valutare l&#39;integrazione di craniche Bone Autoinnesti e Alloinnesti

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Bioingegneria

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Tecnica Gene Transfer e<em&gt; In vitro</em&gt; test cellulari per lo studio della perdita ossea nei disturbi muscoloscheletrici

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ages. Animal OVCF models are essential to the preclinical development of translational tissue engineering strategies. While a number of models currently exist, this protocol describes an optimized method for inducing multiple highly reproducible vertebral defects in a single nude rat. A novel longitudinal semiautomated microcomputed tomography (&#181;CT)-based quantitative structural analysis of the vertebral defects is also detailed. Briefly, rats were imaged at multiple time points post-op. The day 1 scan was reoriented to a standard position, and a standard volume of interest was defined. Subsequent &#181;CT scans of each rat were automatically registered to the day 1 scan so the same volume of interest was then analyzed to assess for new bone formation. This versatile approach can be adapted to a variety of other models where longitudinal imaging-based analysis could benefit from precise 3D semiautomated alignment. Taken together, this protocol describes a readily quantifiable and easily reproducible system for osteoporosis and bone research. The suggested protocol takes 4 months to induce osteoporosis in nude ovariectomized rats and between 2.7 and 4 h to generate, image, and analyze two vertebral defects, depending on tissue size and equipment.

The goal of this protocol is to generate a nude rat osteoporosis-related vertebral compression fracture model that can be longitudinally evaluated in vivo using a semiautomated microcomputed tomography-based quantitative structural analysis.

Semiautomatica longitudinale basati su Microcomputed tomografia quantitativa analisi strutturale di un modello di relazione con l'osteoporosi fratture vertebrali del ratto nudo

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the specific effects and mechanisms in zebrafish remain unclear. Alizarin red has a high affinity for calcium ions and can help visualize the bone and illustrate skeletal mineral mass. In this study, we aimed to detect lead acetate (PbAc)-induced bone loss in zebrafish larvae by using alizarin red staining. Zebrafish embryos were treated with a series of PbAc concentrations (0, 5, 10, 20 mg/L) between 2 and 120 h post fertilization. Whole-mount skeletal staining was conducted on larvae at 9 days post fertilization, and the total stained area was quantified using ImageJ software. The results indicated that the mineralized tissues were stained in red, and the stained area decreased significantly in the PbAc-exposure group, with a dose-dependent change in bone mineralization. This paper presents a staining protocol for investigating skeletal changes in PbAc-induced bone defects. The method can also be used in zebrafish larvae for the detection of bone loss induced by other chemicals.

Here, we have used alizarin red staining to show that lead acetate exposure causes a bone mass change in zebrafish larvae. This staining method can be adapted to the investigation of bone loss in zebrafish larvae loss induced by other hazardous toxicants.

Utilizzo della colorazione rosso alizarina per rilevare la perdita ossea indotta chimicamente nelle larve di zebrafish

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Metodo di ablazione laser per studiare la rigenerazione ossea nelle larve di zebrafish

Two-Photon Laser-Mediated Ablation of Osteoblasts in Developing Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using different methods such as fin amputation, scale plucking, skull trepanation, and microscopic approaches. Using a confocal laser scanning setup equipped with a two-photon laser, a laser ablation method was developed as a lesion paradigm to ablate bone-forming cells (osteoblasts) in the developing opercle of zebrafish larvae. The method described here allows the ablation of cells in a precise manner, as the area, shape, and depth can be finely adjusted. In addition, this method allows imaging of the area before and just after the ablation, so that short-term effects of the injury can be analyzed. In this experimental setup, the immune response after ablation of osteoblasts in the injured area was studied. An increase in the recruitment of macrophages was observed after ablation, indicating the relevance of their presence during bone regeneration.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Rigenerazione ossea immuno-mediata: il ruolo critico dei macrofagi e l'immunomodulazione controllata nei processi riparativi

This protocol describes a two-photon laser ablation approach carried out in zebrafish larvae, which serves as a model to study bone regeneration and the effects of the immune response to ablation.

Ablazione mediata da laser a due fotoni di osteoblasti nello sviluppo di larve di zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using ...

Il trattamento di droga e

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Intra-iliaca iniezione per un efficiente e selettivo Modellazione di microscopico metastasi ossee

Modelli di lesione di Zebrafish adulto per studiare gli effetti del Prednisolone nella rigenerazione di tessuto osseo

Sequenziale

Tomografia Computerizzata e Optical Imaging di osteogenesi-angiogenesi Accoppiamento per valutare l'integrazione di craniche Bone Autoinnesti e Alloinnesti

A Novel

Semiautomatica longitudinale basati su Microcomputed tomografia quantitativa analisi strutturale di un modello di relazione con l'osteoporosi fratture vertebrali del ratto nudo

Utilizzo della colorazione rosso alizarina per rilevare la perdita ossea indotta chimicamente nelle larve di zebrafish

Ablazione mediata da laser a due fotoni di osteoblasti nello sviluppo di larve di zebrafish

Ablazione mediata da laser a due fotoni di osteoblasti nello sviluppo di larve di zebrafish

Ablazione mediata da laser a due fotoni di osteoblasti nello sviluppo di larve di zebrafish