Questo progetto è stato finanziato da sovvenzioni dal Ministero della Pubblica Istruzione di Singapore (MOE, codice di autorizzazione 2013-T2-2-126) e l&#39;Istituto Nazionale della Salute, Stati Uniti d&#39;America (NIH, concedere numero 1R21AT008452-01A1). TY ha ricevuto una borsa di studio di laurea del Dipartimento di Scienze Biologiche NUS. Ringraziamo l&#39;unità confocale del Centro NUS per Bioimmagini Sciences (CBIS) per il loro costante supporto.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con i protocolli Istituzionali Animal Care e del Comitato Usa (IACUC) approvato per l&#39;Università Nazionale di Singapore (R14-293). 1. I pesci allevamento e alla raccolta di embrioni <ol><li> Sollevare WT, ctsk: nlGFP 24, RANKL: HSE: CFP 24, e OSX: mCherry 21 mono o pesce Medaka compound-transgenici a 26 ° C sotto un ciclo di luce controllata (14 h, 10 h scuro) per indurre la deposizione delle uova. </li><li> la deposizione delle uova quotidiana si svolge durante i primi 30 minuti dopo che la luce è accesa. Le uova si attaccano insieme attraverso filamenti e attribuiscono al ventre della femmina per diverse ore. Utilizzare una rete a maglia fine per la cattura di un adulto di sesso femminile che trasporta un cluster di uovo. Lasciate che il pesce riposare per breve tempo in rete e poi massaggiare delicatamente l&#39;addome del pesce per mettere a nudo con attenzione il cluster ovulo fecondato dall&#39;addome della femmina. NOTA: Una sana Medaka femminilepuò produrre 10 - 20 uova al giorno per circa 5 mesi. </li><li> Mettere le uova in una plastica Petri 60 millimetri. Utilizzare una pipetta di plastica per lavare gli embrioni con 5 - 10 ml di 0.3x Danieau del medium soluzione (pesce; 19,3 mM NaCl, 0,23 mm KCl, 0,13 mm MgSO 4, 0,2 mM Ca (NO 3) 2 e 1,7 mm HEPES, pH 7.0). Aggiungere 1 ml di 0,25% (w / v) di metilene blu stock di 2,5 L di medio pesce per prevenire la crescita fungina. </li><li> rotolare delicatamente grappolo di uova in modo da formare un nodo di filamenti di attacco. Usare pinze per rimuovere con attenzione i filamenti allegato dal cluster ovulo fecondato per ottenere singoli embrioni (Figura 1A). </li><li> Fase gli embrioni in base al Iwamatsu 2004 13. </li><li> Cultura 20 - 30 embrioni per 60 millimetri di plastica Petri in un incubatore a 28 °. Cambiare la media giornaliera di garantire il normale sviluppo degli embrioni. NOTA: il tempo attorno al palco schiusa (8-9 d postfertilization,DPF) è particolarmente critica per la sopravvivenza. Rimuovere chorions libero di fluttuare per mantenere la media pulito e per garantire buoni tassi di sopravvivenza delle larve. </li></ol> 2. Screening embrioni transgenici <ol><li> Utilizzare uno stereomicroscopio dotato di una lampada al mercurio per l&#39;imaging di fluorescenza e GFP, RFP, e filtri CFP per lo screening degli embrioni transgenici per l&#39;espressione reporter fluorescente utilizzando 40X di ingrandimento. </li><li> Visivamente identificare osx: mCherry embrioni di espressione giornalista mCherry nei primi anni di formazione ossa craniche, come il cleithrum, su entrambi i lati della testa posteriore (Figura 1B, freccia), e il parasphenoid, in una posizione centrale nel cranio ventrale ( Figura 1B, punta di freccia). NOTA: l&#39;espressione Reporter inizia dal 5 in poi DPF 21. </li><li> Identificare ctsk: nlGFP embrioni di forte espressione nlGFP nella testa (Figura 1C, freccia) e la coda (Figura 1C, punta di freccia), a partire da6 DPF. NOTA: osteoclasti endogeni formano solo dopo 21 DPF. nlGFP-cellule che esprimono in questa fase iniziale (6 DPF) non sono osteoclasti, ma altri, finora non caratterizzato, ctsk cellule -positive 24. </li><li> Identificare RANKL: HSE: PCP embrioni transgenici di espressione ubiquitaria PCP dopo un breve trattamento termico d&#39;urto per 20 minuti a 39 ° C, condotto presso 2 DPF o poi ai fini dello screening. NOTA: Il RANKL e CFP transgeni sono sotto il controllo dello stesso bidirezionale Heat Shock Element (HSE). Espressione PCP indica successo RANKL induzione 24. </li><li> Eseguire un 1,5-2 h termico trattamento d&#39;urto a 9 DPF o poi per indurre un gran numero di osteoclasti ectopiche nella regione del tronco, che si traduce di conseguenza in un fenotipo osteoporosi simile 24. NOTA: espressione RANKL transgenico indotta a 9 risultati DPF in una attivazione ectopica di cellule progenitrici degli osteoclasti dormienti, che endogeno non viene attivatoprima del 21 DPF. Usare un bagno d&#39;acqua per ottenere stabili 39 ° C condizioni. Lasciate che i Petri contenenti embrioni Medaka galleggiano sulla superficie dell&#39;acqua. Assicurarsi che il coperchio della scatola di Petri è asciutto per evitare l&#39;affondamento del piatto. </li><li> Schermo embrioni da linee di composti, come RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP doppio transgenico e OSX: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP triplo transgenico, secondo il pattern di espressione di ogni individuo transgene. NOTA: gli embrioni transgenici omozigoti emizigote e sono stati contraddistinti da diversi livelli di fluorescenza del transgene giornalista. embrioni omozigoti avevano una intensità di fluorescenza che è risultata approssimativamente raddoppiata rispetto a quella dei transgenici hemizygous. Linee di composti che erano omozigoti per entrambi RANKL: HSE: PCP e ctsk: nlGFP sono stati ottenuti incrossing ripetuto per diverse generazioni. Per triplo transgenico OSX: mCherry / RANKL: HSE: CFP / ctsk: nlGFP pesce,<html> RANKL omozigote: HSE: CFP / ctsk: pesce nlGFP sono stati incrociati con OSX omozigote: vettori mCherry. La progenie triple-transgenici eterozigoti risultante sono state sollevate e incrossed di ottenere embrioni omozigoti per RANKL: HSE: CFP. Il RANKL: HSE: PCP transgene deve essere omozigote per ottenere l&#39;induzione efficiente degli osteoclasti ectopiche. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55025/55025fig1.jpg" /> Figura 1: WT e transgenici Medaka embrioni a 7 D Postfertilization (DPF). A. embrioni WT osservati con illuminazione campo chiaro. B. Embrioni transgenici che mostrano OSX: espressione mCherry intorno al cleithrum (freccia) e parasphenoid (punta di freccia). C. Embrioni transgenici che mostrano ctsk: espressione nlGFP nella testa (freccia) e la coda (punta di freccia). Barre di scala: 500 micron.025 / 55025fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 3. trattamento con i bifosfonati di Medaka larve <ol><li> Preparare soluzioni contenenti diverse concentrazioni dei bifosfonati (BPS) per gli studi dose-risposta. NOTA: La BP esemplare utilizzato in questo protocollo è l&#39;alendronato. <ol><li> Sciogliere alendronato in mezzo pesce ad una concentrazione di 100 ug / ml per preparare una soluzione madre. </li><li> Utilizzare un vortex per garantire la completa dissoluzione. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C. </li><li> Preparare diverse soluzioni di lavoro diluendo la soluzione madre con il mezzo pesce per una serie di concentrazioni (cioè, 25, 37,5, 50, 62,5 e 75 mg / mL). NOTA: Diversi farmaci possono avere diverse assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione (ADME parametri), che devono essere considerati durante i test con questo sistema larve Medaka. Inoltre, la solubilità della droga e stabilità possono variare quandoapplicata come soluzione acquosa. Meno composti idrosolubili potrebbero dover prima essere sciolto in solventi organici, come DMSO. In questo caso, una soluzione madre viene preparata in DMSO, che viene poi ulteriormente diluito in terreno pesci. Si noti che le soluzioni di lavoro in acqua (media) pesci possono essere conservati in frigorifero per diversi sett. Tuttavia, le soluzioni contenenti DMSO devono essere conservati a temperatura ambiente per evitare la cristallizzazione. </li></ol></li><li> Trasferimento Medaka larve in piastre a sei pozzetti (sei larve / e) per il successivo trattamento BP (alendronato). </li><li> Rimuovere il mezzo di pesce con cura utilizzando una pipetta di plastica pulito e aggiungere un piccolo volume (circa. 0,5 mL) di soluzione alendronato in ogni pozzetto. </li><li> Evitare medio pesce rimasto, come la soluzione di BP aggiunto potrebbe essere diluito, il che è particolarmente importante per le soluzioni alendronato meno concentrate. </li><li> Rimuovere un piccolo volume di soluzione di alendronato (fino a 0,5 mL) da ogni pozzetto con una pipetta di plastica pulito e sostituirlo con un volu grandeme (4 mL) di soluzione alendronato. </li><li> Cambiare media quotidianamente per garantire il normale sviluppo degli embrioni. </li></ol> 4. La colorazione dal vivo di matrice mineralizzata con l&#39;osso <ol><li> Sciogliere 0.5 g di alizarina complessone (ALC, acido alizarina-3-methyliminodiacetic) o 0,05 g di calceina in 50 ml di terreno di pesce per preparare soluzioni madre 1% e 0,1% rispettivamente. Utilizzare un vortex per garantire la completa dissoluzione. NOTA: media Pesce senza l&#39;aggiunta di blu di metilene è utilizzato in questa e nelle fasi successive per ridurre autofluorescenza nelle larve. </li><li> Utilizzare un filtro siringa e monouso (0,2 micron) per filtrare la soluzione colorante. Conservare la soluzione filtrata al buio a temperatura ambiente. NOTA: Il colore della, chiara soluzione colorante ALC filtrato è di colore giallo scuro all&#39;arancio. Il colore della soluzione calceina chiaro filtrato è di colore giallo brillante. Le soluzioni possono essere utilizzati per diversi mesi. </li><li> Diluire la soluzione filtrata ALC o calceina magazzino 1:10 in media pescee incubare le larve Medaka per 1,5 - 2 ore (0,1% soluzione ALC) o 2 - 2,5 h (0,01% soluzione calceina) in un incubatore a 28 ° se si utilizzano le larve tra il 9 e il 17 DPF. Conservare i campioni al buio. </li><li> Trasferire le larve medio pesce fresco con una pipetta di plastica pulito. </li><li> Rimuovere il supporto di pesce con una pipetta di plastica pulito e aggiungere mezzo di pesce fresco. Ripetere questo passaggio per 3 - 4 volte fino a quando nessuna soluzione rossi o giallo-macchiato (ALC o calceina, rispettivamente) è rimasto sopra. Lasciare le larve in mezzo pesce per 30 - 60 min prima di montaggio per l&#39;imaging di evitare epifluorescenza dal mezzo. NOTA: 0,1% soluzione ALC colorazione è dannoso per Medaka larve per tempi di esposizione prolungati. I tempi di incubazione di più di 2 h influenzano la sopravvivenza delle larve. Concentrazione e tempo di colorazione devono pertanto essere ottimizzato per diverse fasi, al fine di ottenere risultati ottimali di sopravvivenza degli embrioni e di colorazione. </li></ol> 5. vivo imaging di fluorescenza </<html> p&gt; <ol><li> Anestetizzare le larve Medaka con 0,01% Tricaine (etil metanosolfonato 3-aminobenzoate) in media del pesce. NOTA: anestetizzati larve diventano immobilizzato dopo 5 - 10 minuti in soluzione Tricaine e di solito sono distesi o su un fianco o le spalle. </li><li> Utilizzare un microloader plastica per orientare le larve in base alla regione di interesse. L&#39;orientamento delle larve utilizzato in questo protocollo è laterale. </li><li> Utilizzare uno stereomicroscopio con illuminazione a fluorescenza per l&#39;imaging. Utilizzare alto ingrandimento quando si scattano immagini, concentrandosi su diverse parti della larve (testa, tronco anteriore, il tronco posteriore, e la coda). Stitch singole immagini insieme alla sovrapposizione delle regioni utilizzando un apposito software di elaborazione delle immagini (inserti in Figura 3G). NOTA: Ciò contribuisce a migliorare la qualità di immagine di tutte le parti del corpo interessate nel piano focale corretto. </li><li> Rientro le larve al mezzo di pesce per il recupero dopo l&#39;imaging. </li></ol>tle &quot;&gt; 6. Vivere confocale Imaging <ol><li> Anestetizzare le larve con 0,01% Tricaine in media pesce per 5 - 10 minuti fino a quando diventano immobilizzato. </li><li> Sciogliere bassofondente agarosio all&#39;1,5% in media pesci riscaldandolo in un forno a microonde. Raffreddare la soluzione a circa 30 ° C. </li><li> Aggiungere 0,5-1 ml di liquido 1,5% basso punto di fusione agarosio in media pesce per una capsula di Petri con fondo trasparente. Trasferire le larve anestetizzato nella soluzione con una pipetta di plastica pulito. NOTA: prendere precauzioni speciali che la temperatura del liquido agarosio bassofondente è abbastanza basso da non danneggiare le larve. </li><li> Prima solidifica agarosio, utilizzare un microloader plastica per spingere le larve al fondo del piatto Petri e orientare le larve in base alla regione di interesse. L&#39;orientamento delle larve utilizzato in questo protocollo è laterale. NOTA: I campioni sono pronti per confocale l&#39;imaging dal vivo dopo l&#39;agarosio solidifica completamente. </li><li> Utilizzare un microscopio confocale a ACQimmagini uire. </li><li> Utilizzare una linea laser 543 nm per le analisi mCherry e ALC colorazione. Utilizzare una linea laser 488 nm per nlGFP e analizza calceina colorazione. </li><li> Dopo l&#39;imaging, aggiungi medio pesce alla piastra di Petri e utilizzare un paio di aghi sottili siringa (27 G x 1 ½ &quot;) per rimuovere con attenzione le larve dal agarosio. Trasferire le larve con residuale attaccato agarosio ad una capsula di Petri con il mezzo di pesce per il recupero . </li><li> Elaborare le immagini utilizzando una immagine software di analisi 27. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione o finanziari.

I passaggi critici all&#39;interno del protocollo È essenziale che le condizioni per il trattamento shock termico sono coerenti e stabili quando si confrontano i diversi campioni. Condizioni di temperatura stabili garantiscono livelli simili di RANKL induzione nelle larve transgeniche e, di conseguenza, la formazione di osteoclasti comparabili, che può essere confermata da screening per ctsk: espressione nlGFP. In definitiva, questo porta ad un grado simile di riassorbimento osseo in...

Lo scheletro vertebrato fornisce supporto strutturale e protezione per organi, permette la mobilità, e serve come fonte di calcio. Per tutta la vita, la matrice ossea extracellulare viene continuamente girato per mantenere la stabilità ossea e rigidità. Questo processo richiede l&#39;attività strettamente coordinato e interazione degli osteoblasti che formano l&#39;osso e osteoclasti osso-riassorbono. Gli osteoblasti derivano da progenitori mesenchimali multipotenti e producono collagene per formare il osteoide, la parte proteica della matrice ossea 10. Osteoblasti interagiscono con gli osteoclasti per realizzare un&#39;attività equilibrata di entrambi i tipi di cellule, che è richiesto per controllare l&#39;omeostasi ossea 7. A causa di queste interazioni normative complesse, risposte al trattamento farmacologico e l&#39;omeostasi ossea non possono essere completamente esaminati utilizzando studi in vitro. Quindi, vi è una forte richiesta di modelli animali. Rispetto alle impostazioni di coltura cellulare, in modelli in vivo può fornireinformazioni preziose nelle reti pluricellulari all&#39;interno dell&#39;ambiente osso. Esistono numerosi modelli di mouse per una varietà di malattie delle ossa umane, tra cui l&#39;osteoporosi 16. Tuttavia, la dimensione e l&#39;accessibilità di embrioni di topo rappresentano significative limitazioni per l&#39;imaging dal vivo di processi scheletrici. Piccoli pesci teleostei, invece, servire come un&#39;alternativa interessante per l&#39;imaging in vivo. Zebrafish (Danio rerio) e Medaka (Oryzias latipes) sono diventati popolari modelli animali per la ricerca scheletrico nel corso degli ultimi due decenni, 17, 19, 22, 24. Bone nei pesci teleostei e nei mammiferi è molto simile, sia strutturale che a livello fisiologico, e molti dei geni regolatori chiave e vie di segnalazione sono conservati 3. Come nei mammiferi, pesci teleosteo regolare accuratamente l&#39;attività degli osteoblasti e osteoclasti per bilanciare la formazione dell&#39;osso ed il riassorbimento 26. Ancora più importante, la chiarezza ottica di fish larve permette l&#39;utilizzo di reporter fluorescenti per marcare le cellule ossee e calcificate matrice scheletrico 8, 9, 12, 21, 23, che facilita l&#39;osservazione dei processi cellulari in animale vivente. Inoltre, una serie di strumenti genetici è stato generato per facilitare la ricerca biomedico rilevante nel pesce. Per Medaka in particolare, i metodi per mirata mutazione genetica da CRISPR / Cas9 2, cellule-lineage tracing 6, e transgenesi 14 sono state di recente costituzione e sono ora ampiamente in uso 15 site-specific. Piccole larve teleosteo sono stati utilizzati con successo per gli schermi chimici, che hanno portato alla scoperta di diversi farmaci farmacologicamente rilevanti 1, 18. Pesce larve sono tolleranti a basse concentrazioni di DMSO e sono in grado di assorbire composti dal loro ambiente acquatico, sia attraverso la pelle o attraverso il tratto gastrointestinale 1, 5. Il nostro laboratorio in precedenza rappresentanteorted linee Medaka transgenici che esprimono i reporter fluorescenti in cellule ossee sotto il controllo di vari osteoblasti e promotori specifici osteoclasti. Questi includono osteoblasti prematuri (collagene 10A1, col10a1; Osterix, OSX) 20, 21, osteoblasti maturi (osteocalcina, OSC) 27, e osteoclasti (catepsina K, ctsk) 24. Abbiamo anche generato una linea transgenica che esprime il fattore di osteoclasti che induce Receptor Activator of Nuclear factor-kB Ligand (RANKL) sotto il controllo di un shock termico-inducibile promotore 24. Induzione di RANKL in questo sistema porta alla formazione ectopica di osteoclasti attivi. Questo porta ad un aumento riassorbimento osseo e una grave fenotipo osteoporosi simile, con drasticamente ridotta mineralizzazione nei corpi vertebrali. Abbiamo recentemente dimostrato che l&#39;attività degli osteoclasti in questo modello può essere bloccato dalla bifosfonati etidronato e alendronato, TWO farmaci comunemente utilizzati nella terapia dell&#39;osteoporosi umana, convalidando così Medaka come sistema modello adatto per l&#39;osteoporosi 27. Grazie alla loro grande prole, rapido sviluppo, e piccole dimensioni di embrioni, transgenici Medaka larve sono particolarmente adatta per lo screening su larga scala di farmaci osteoporosi e per l&#39;analisi in vivo del comportamento delle cellule ossee. Gli studi in Medaka quindi possono integrare in modo efficiente esperimenti in colture cellulari e nei topi che hanno lo scopo di scoprire nuovi bersagli terapeutici e nuove terapie per i disturbi delle ossa umane. Nel presente studio, si descrive un protocollo per il trattamento di Medaka larve osso-giornalista con il farmaco osteoporosi comuni, l&#39;alendronato. Descriviamo anche in dettaglio come trattate le larve sono montati e preparati per l&#39;imaging dal vivo di matrice ossea e cellule ossee. Questi protocolli possono essere facilmente adattate ad altri composti chimici di piccole dimensioni che sia il lavoro come anabolizzanti osso o droghe riassorbimento osseo. &lt;/ P&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1101">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">Alendronate&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">A4978</td>
			<td style="width:535px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:249px;">alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:249px;">ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImageJ (1.4.3.67)</td>
			<td style="width:177px;">National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">LSM 510 Meta confocal&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">LSM Image Browser (4.2.0.121)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-loader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Eppendorf ep T.I.P.S 20 &#956;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">NIS-Elements BR 3.0 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">Photoshop CS6 (13.0.0.0)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">SMZ1000 stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug treatment and in vivo imaging of osteoblast-osteoclast interactions in a medaka fish osteoporosis model

Che formano l&#39;osso osteoblasti interagiscono con osteoclasti osso-riassorbono per coordinare il fatturato di matrice ossea e per controllare l&#39;omeostasi scheletrica. Medaka e larve di pesce zebra sono ampiamente utilizzati per analizzare il comportamento delle cellule ossee durante la formazione ossea, degenerazione, e la riparazione. La loro chiarezza ottica permette la visualizzazione di cellule ossee fluorescenza etichettati e coloranti fluorescenti legati alla matrice mineralizzata scheletrico. Il nostro laboratorio ha generato pesci transgenici Medaka che esprimono il fattore di osteoclasti che induce Receptor Activator of Nuclear factor-kB Ligand (RANKL) sotto il controllo di un promotore di calore shock inducibile. Espressione ectopica di risultati RANKL in eccesso formazione degli osteoclasti attivati, che possono essere visualizzati in linee giornalista con espressione nlGFP sotto il controllo del K (ctsk) promotore catepsina. induzione RANKL e la formazione degli osteoclasti ectopica porta a gravi fenotipi osteoporosi-like. Composto transgenico Medaka Lines che esprimono ctsk: nlGFP in osteoclasti, nonché mCherry sotto il controllo del Osterix (osx) promotore in osteoblasti prematuri, possono essere utilizzati per studiare l&#39;interazione di entrambi i tipi di cellule. Questo facilita l&#39;osservazione in vivo del comportamento cellulare in condizioni di degenerazione e riparazione ossea. Qui, descriviamo l&#39;uso di questo sistema per testare un farmaco comunemente utilizzato nella terapia dell&#39;osteoporosi umana e descrivere un protocollo per l&#39;imaging in tempo reale. Il modello Medaka integra studi in colture cellulari e topi, e offre un nuovo sistema per l&#39;analisi in vivo di azione farmaco nel sistema scheletrico.

numeri uovo abbondanti, così come le piccole dimensioni delle larve, fanno Medaka un modello eccellente per lo screening farmacologico. Una singola piastra di sei pozzetti è stato usato per coltura fino a 36 larve, sufficiente a fornire dati statisticamente significativi. Un altro grande vantaggio di utilizzare pesce per analisi scheletrica è la possibilità di fare imaging dal vivo. La trasparenza delle larve consente l&#39;uso di proteine ​​fluorescenti per marcare le cellule ossee, nonché l&#39;uso di coloran...

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Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Il trattamento di droga e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di osteoblasti-osteoclasti interazioni in un modello di Medaka pesce osteoporosi

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

drug-treatment-vivo-imaging-osteoblast-osteoclast-interactions-medaka

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

9.1K Views.  National University of Singapore. Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

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Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Automated quantificazione di cellule ematopoietiche - Interazioni cellule stromali in istologici Immagini di Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells differentiate into primary trophoblast giant cells (TGCs) while the polar trophectoderm overlying the inner cell mass continues to proliferate later differentiating into secondary TGCs. TGCs play a key role in developing placenta and are essential for a successful pregnancy. Investigation of transcriptional regulation of specific genes during post-implantation development can give insights into TGCs development. Cells of the ectoplacental cone (EPC) from embryos at 7-7.5 days of gestation (E7-7.5), derived from the polar trophectoderm, differentiate into secondary TGCs1. TGCs can be studied in situ, on cryostat sections of embryos at E7 although the number of TGCs is very low at this stage. An alternative means of analyzing secondary TGCs is to use short-term cultures of individual EPCs from E7 embryos. We propose a technique to investigate the transcriptional status of genes of interest both in vivo and in vitro at the single-cell level using fluorescent in situ hybridization (RNA FISH) to visualize nascent transcripts. This technique provides a direct readout of gene expression and enables assessment of the chromosomal status of TGCs, which are large endoreplicating cells. Indeed, a key feature of terminal differentiation of TGCs is that they exit the cell cycle and undergo multiple rounds of endoreplication.This approach can be applied to detect expression of any gene expressed from autosomes and/or sex chromosomes and can provide important information into developmental mechanisms as well as placental diseases.

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

Analisi trascrizionale dal nascente RNA FISH di<em&gt; In Vivo</em&gt; Cellule del trofoblasto giganti o<em&gt; In Vitro</em&gt; Culture a breve termine di Ectoplacental Cono espianti

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended intracellular endotubes that build and stabilize the lumen with a membrane and submembraneous cytoskeleton of apical character. The excretory cell expands its length approximately 2,000 times to generate these canals, making this model unique for the in vivo assessment of de novo polarized membrane biogenesis, intracellular lumen morphogenesis and unicellular tubulogenesis. The protocol presented here shows how to combine standard labeling, gain- and loss-of-function genetic or RNA interference (RNAi)-, and microscopic approaches to use this model to visually dissect and functionally analyze these processes on a molecular level. As an example of a labeling approach, the protocol outlines the generation of transgenic animals with fluorescent fusion proteins for live analysis of tubulogenesis. As an example of a genetic approach, it highlights key points of a visual RNAi-based interaction screen designed to modify a gain-of-function cystic canal phenotype. The specific methods described are how to: label and visualize the canals by expressing fluorescent proteins; construct a targeted RNAi library and strategize RNAi screening for the molecular analysis of canal morphogenesis; visually assess modifications of canal phenotypes; score them by dissecting fluorescence microscopy; characterize subcellular canal components at higher resolution by confocal microscopy; and quantify visual parameters. The approach is useful for the investigator who is interested in taking advantage of the C. elegans excretory canal for identifying and characterizing genes involved in the phylogenetically conserved processes of intracellular lumen and unicellular tube morphogenesis.

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans excretory canal is a unique single-cell model for the visual in vivo analysis of de novo polarized membrane biogenesis. This protocol describes a combination of standard genetic/RNAi and imaging approaches, adaptable for the identification and characterization of molecules directing unicellular tubulogenesis, and apical membrane and lumen biogenesis.

Il canale di Excretory c. elegans come un modello per intracellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo in una singola cella: etichettatura di GFP-fusioni, schermata di interazione di RNAi e Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Stabilimento di larvale Zebrafish come modello animale per indagare Trypanosoma cruzi motilità In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

In Vivo Formazione immagine del muscolo-tendine morfogenesi in Drosophila pupe

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Live Cell Imaging della segregazione cromosomica durante la mitosi

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Il trattamento di droga e

Riepilogo

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