Part of this work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research (C) from the Japanese Society for the Promotion of Science (25350520, 22500401, 15K06105) and the US-ARMY ITC-PAC Research and Development Project (FA5209-15-P-0175).

La cura degli animali, la preparazione e i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato di Ricerca sugli Animali dell&#39;Ateneo di Tecnologia e Tecnologia di Tokyo. Per questa metodologia, il ratto è alloggiato in un ambiente controllato (24 ° C, 12 h ciclo luce / scuro), con alimenti e acqua disponibile ad libitum. 1. Costruzione di un sistema di immagini riflessione diffusa multispettrale convenzionale <ol><li> Montare nove filtri di interferenza ottica a banda stretta con lunghezze d&#39;onda centrali di 500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 e 760 nm ai fori filtranti della ruota filtro motorizzata. </li><li> Costruire un sistema di imaging multispectral utilizzando una sorgente luminosa a banda larga a banda larga, una ruota filtrante motorizzata con l&#39;insieme di filtri a interferenza a banda stretta, una guida leggera, una lente di raccolta, un obiettivo di zoom video e una fotocamera CCD monocromatica. La disposizione dei componenti ottici, mostrata in Figura 2 , può essere indicata per la thè procedura costruzione. NOTA: L&#39;angolo di illuminazione è di circa 45 ° rispetto alla superficie del campione. </li><li> Attivare la sorgente luminosa lampada alogena per illuminare la superficie del campione attraverso un filtro di interferenza, la guida di luce, e la lente di collezione. </li><li> Aprire il software operativo della camera CCD. </li></ol> 2. Preparazione animale NOTA: In questo protocollo, il ratto non è stato utilizzato per i futuri esperimenti ed è stato sacrificato subito dopo le misurazioni di immagini multispettrali. <ol><li> Collegare la porta di ingresso di una camera di induzione per la luce di uscita di una macchina di anestesia con un tubo. Collegare la porta di uscita della camera di induzione alla porta di ingresso della macchina per anestesia con un secondo tubo. </li><li> Posizionare il topo nella camera di induzione e indurre l&#39;anestesia con isoflurano 5,0%. Mantenere l&#39;anestesia ad una profondità tale per cui il ratto non risponde al pizzichi punta. Lower al 2,0% isoflurano mediante una manopola sulla macchina per anestesia. </li><li> Fissare la testa ratto in un telaio stereotassico. Allegare un boccaglio per l&#39;anestesia al telaio stereotassico. </li><li> Collegare la luce di ingresso del boccaglio alla luce di uscita della macchina di anestesia con un tubo. Collegare la porta di uscita del boccaglio alla porta di ingresso della macchina per anestesia con un tubo. </li><li> Radere la regione testa al di là del sito di incisione prospettico utilizzando tosatrici fino a quando appare la superficie della pelle. </li><li> Eseguire un&#39;incisione longitudinale di circa 20 mm, lungo la linea mediana della testa con un bisturi chirurgico (Figura 1 (a)) ed esporre il tessuto connettivo sottocutaneo (Figura 1 (b)). </li><li> Rimuovere il tessuto connettivo sottocutaneo utilizzando una curette tagliente o una pinza e tirarlo su entrambi i lati della testa per esporre l&#39;osso del cranio (Figura 1 (c)). </li><li> Scavare un fosso ellissoidale con l&#39;osso del cranio all&#39;interno della Sutur cranicaes (sutura coronale, sutura sagittale, e sutura lambdoidea) utilizzando un trapano ad alta velocità (Figura 1 (d)). </li><li> Lentamente e omogeneamente scavare l&#39;osso del cranio all&#39;interno del fosso di usare il trapano ad alta velocità. </li><li> Premere leggermente sulla superficie del cranio assottigliato con la punta della pinza per stimare lo spessore e forza ossea dopo appare un vaso sanguigno cerebrale. Se la regione cranio assottigliata deprime facilmente, interrompere la riduzione delle ossa del cranio con il trapano ad alta velocità. </li><li> Tagliare la linea di confine ellissoidale del cranio assottigliata frammentario usando la punta della pinza o piccole forbici chirurgiche. </li><li> Rimuovere il cranio assottigliato dalla superficie del cervello lentamente e delicatamente con la pinza. </li><li> bagnare delicatamente la finestra del cranio con soluzione salina fisiologica e coprire con una lastra di vetro trasparente spessore di circa 0,1 mm. </li></ol> 3. Regolando la frazione di ossigeno inspirato NOTA: Il Condi respiratoriazione può essere modificato regolando la frazione di ossigeno inspirato (FiO2). <ol><li> Utilizzando un tubo, collegare la prima porta di un connettore tubo a forma di Y (connettore 1) alla prima porta di un altro connettore tubo a forma di Y (connettore 2). </li><li> Collegare la luce di ingresso del boccaglio alla seconda porta del connettore del tubo 1. </li><li> Utilizzando un tubo, collegare la terza porta del connettore tubo 1 ad un dispositivo di monitoraggio ossigeno concentrazione. </li><li> Con un tubo, collegare la seconda porta del connettore tubo 2 all&#39;apertura di uscita di una macchina per anestesia. </li><li> Utilizzando un tubo, collegare la terza porta del connettore tubo 2 verso l&#39;uscita di un dispositivo di miscela di gas. </li><li> Collegare una luce di ingresso del dispositivo di miscela di gas ad alta pressione 95% O 2 - 5% di CO 2 bombola di gas utilizzando un tubo. </li><li> Collegare l&#39;altra apertura di entrata del dispositivo di miscela di gas ad alta pressione 95% N 2 - 5% bombola di CO 2 utilizzando un tubo. </li><li> Modificare le portate di gas of O 2 e N 2 utilizzando le manopole rotanti sul dispositivo miscela di gas. </li><li> Controllare e regolare la FiO 2 utilizzando il dispositivo di ossigeno del monitor concentrazione. </li></ol> 4. Acquisizione della riflettanza immagini multispettrali Diffuse <ol><li> Acquisizione di immagini di riferimento NOTA: I componenti ottici utilizzati in questo esperimento, come la sorgente luminosa, fibra ottica, e rilevatori hanno le loro caratteristiche spettrali. Pertanto, l&#39;intensità della luce passata attraverso questi componenti dovrebbe essere registrata come immagine di riferimento. L&#39;immagine di riferimento è un&#39;immagine presa con diffusore bianco standard illuminato con la luce dalla sorgente luminosa. <ol><li> Mettere il diffusore bianco standard sulla scena orizzontalmente. </li><li> Fuoco l&#39;obiettivo della videocamera sulla superficie del diffusore bianco ruotando la ghiera zoom sulla canna. </li><li> Regolare il tempo di integrazione della fotocamera selezionando il valore appropriato dalladiscesa dei tempi di integrazione nel software operativo della telecamera in modo che la maggior quantità di luce produce un segnale che è circa il 75% dei conteggi massimi. Osservando l&#39;istogramma dei valori di pixel, regolare il tempo di integrazione finché il livello di intensità del segnale è di circa il 75% dei conteggi massimi. </li><li> Selezionare il comando &quot;Salva&quot; dal menu File per salvare l&#39;immagine in un file. </li><li> Modificare la posizione del filtro ruotando la ruota portafiltri. </li><li> Salvare un&#39;immagine alle altre lunghezze d&#39;onda secondo il procedimento sopra descritto. Il nome del file deve identificare il campione e la lunghezza d&#39;onda utilizzata (ad esempio, W500, W520, W540 ... W760). </li></ol></li><li> Acquisizione di immagini di esempio Nota: Le immagini di intensità della luce riflessa diffusamente di cervello di ratto esposto a nove lunghezze d&#39;onda vengono acquisite e memorizzate sul disco rigido di un personal computer utilizzando le stesse condizioni di acquisizione. <ol><li> Posizionare delicatamente la rSul palco e regolare lentamente il livello della scena in modo che la fotocamera possa concentrarsi sulla superficie del cervello del ratto. </li><li> Selezionare il comando &quot;salva&quot; dal menu file per salvare un&#39;immagine in un file. </li><li> Cambiare la posizione del filtro ruotando la ruota del filtro. </li><li> Salvare un&#39;immagine alle altre lunghezze d&#39;onda secondo il processo descritto in precedenza. Il nome del file deve identificare il campione e la lunghezza d&#39;onda ( es. R500, R520, R540 ... R760). </li></ol></li><li> Acquisizione di immagini scure NOTA: La telecamera CCD può generare un&#39;intensità luminosa in risposta ad un segnale elettrico. Tuttavia, c&#39;è qualche uscita minore dovuta al rumore nei circuiti elettrici e nei rivelatori, anche se la luce non entra nel rilevatore; Questo è chiamato rumore corrente scuro. Per misurare con precisione l&#39;intensità spettrale della luce, il componente della corrente scura dovrebbe essere registrato come un&#39;immagine scura e quindi sottratta dal segnale misurato. L&#39;immagine scura è un&#39;immagineN con il percorso della luce bloccato. <ol><li> Spegnere la sorgente luminosa della lampada alogena. </li><li> Bloccare il percorso della luce al sistema di telecamere CCD utilizzando una piastra di schermatura. </li><li> Selezionare il comando &quot;salva&quot; dal menu file per salvare un&#39;immagine in un file. Il nome del file deve identificare il campione ( ad esempio, Dark). </li></ol></li></ol> 5. Visualizzazione del contenuto di emoglobina e del parametro di scattering della luce NOTA: Un insieme di immagini a riflessione diffusa multispettrale viene salvato sul disco rigido di un personal computer e analizzato in modalità non in linea. Viene quindi eseguita un&#39;analisi multipla di regressione supportata da una simulazione di Monte Carlo 19 delle immagini a riflessione diffusa multispectrale a nove lunghezze d&#39;onda (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 e 760 nm) per visualizzare la dimensione bidimensionale Mappe di concentrazione dell&#39;emoglobina ossigenata, concentrazione dell&#39;emoglobina deossigenata, concentrazione totale di emoglobina, saturazione cerebrale di ossigeno regionale e scatTering potere. L&#39;algoritmo dettagliato è stato pubblicato nelle letterature 17, 18. <ol><li> Sottrarre l&#39;immagine scura sia l&#39;immagine di riferimento e l&#39;immagine campione a ciascuna lunghezza d&#39;onda. </li><li> Normalizzare l&#39;immagine campione l&#39;immagine di riferimento per ogni lunghezza d&#39;onda λ. Il trattamento dell&#39;immagine normalizzata come il diffuso immagine riflettanza R. </li><li> Calcolare l&#39;assorbanza (densità ottica) immagine A prendendo il logaritmo del reciproco del diffuso immagine riflettanza R ad ogni lunghezza d&#39;onda λ: <img alt="equazione 1" src="/files/ftp_upload/55399/55399eq1.jpg" /> (1) </li><li> Generare una matrice tridimensionale impilando le immagini assorbanza nell&#39;ordine della loro lunghezza d&#39;onda, dove x - piano y mostra le informazioni strutturali ottenute per la superficie del cervello e z -axis mostra le informazioni spettrali. </li><li> PeRformare un&#39;analisi multipla di regressione per lo spettro di assorbanza A ( λ ) ad ogni coordinata xy. </li><li> Utilizzare lo spettro di assorbanza A ( λ ) come variabile dipendente e gli spettri di coefficiente di estinzione molare dell&#39;emoglobina ossigenata ε HbO ( λ ) e dell&#39;emoglobina deossigenata ε HbR ( λ ) come variabili indipendenti per la fase 5.5 (valori pubblicati per ε HbO ( λ ) E ε HbR ( λ ) sono fornite nella tabella 1 ). </li><li> Controllare le mappe bidimensionali (immagini) dei tre coefficienti di regressione multipla un HbO , un HbR e un 0 . </li><li> Generare una matrice tridimensionale impilando le immagini dei coefficienti di regressione multipla nell&#39;ordine un HbO , un HbR e un 0 , dove il <em&gt; x - piano y mostra le informazioni strutturali ottenute per la superficie del cervello e la z -axis propone i molteplici coefficienti di regressione. </li><li> Calcolare la concentrazione ossigenata emoglobina C HbO, il deossigenato concentrazione di emoglobina C HBr, e la potenza di dispersione b dal set di regressione multipla coefficienti a HbO, un HBr, e uno 0 ad ogni xy coordinate utilizzando le seguenti formule empiriche (ha valori di β HbO, i, β HBr, i, e β 0, i (i = 0,1,2,3) sono fornite nella Tabella 2): <img alt="equazione 2" src="/files/ftp_upload/55399/55399eq2.jpg" /> (2) <img alt="equazione 3" src="/files/ftp_upload/55399/55399eq3.jpg" /> (3) <img alt="equazione 4" src="/files/ftp_upload/55399/55399eq4.jpg" /> (4) </li><li> Controllare le mappe bidimensionali (immagini) della concentrazione di emoglobina ossigenata C HbO, la concentrazione di emoglobina deossigenata C HBr, e il potere di scattering b. </li><li> Calcolare una mappa bidimensionale del totale concentrazione di emoglobina C HbT sommando C HBO e C HBr in ogni x - coordinata y. </li><li> Calcolare una mappa bidimensionale della saturazione dell&#39;ossigeno cerebrale regionale RSO 2 dividendo la concentrazione di emoglobina ossigenata C HbO dalla totale concentrazione di emoglobina C HbT in ogni x - coordinata y. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Il passo più critico in questo protocollo è la rimozione della regione sottile di cranio per rendere la finestra cranica; Questo deve essere eseguito attentamente per evitare sanguinamenti imprevisti. Questo passo è importante per ottenere immagini di riflessione diffusa multispettrale di alta qualità con alta precisione. L&#39;uso di uno stereomicroscopio è raccomandato per la procedura chirurgica, se possibile. Piccoli pezzi di spugna di gelatina sono utili per l&#39;emostasi. Il sist...

La formazione di riflessioni diffusive multispectrali è la tecnica più comune per ottenere una mappa spaziale di segnali ottici intrinseci (IOS) nel tessuto corticale. IOS osservati nel cervello in vivo sono principalmente attribuiti a tre fenomeni: varianti di assorbimento e dispersione della luce dovute all&#39;emodinamica corticale, variazione dell&#39;assorbimento a seconda della riduzione o ossidazione dei citocromi nei mitocondri e variazioni nelle proprietà di dispersione della luce indotte da alterazioni morfologiche 1 . La luce nel visibile (VIS) ad infrarosso vicino (NIR) gamma spettrale è efficacemente assorbita e dispersa dal tessuto biologico. Lo spettro di riflessione diffusa del cervello in vivo è caratterizzato da spettri di assorbimento e dispersione. I coefficienti di dispersione ridotti μ s &#39; del tessuto cerebrale nella gamma di lunghezze d&#39;onda VIS-NIR portano ad una mostra monotona di spettro di dispersioneing grandezze più piccole a lunghezze d&#39;onda più lunghe. Il ridotto coefficiente di diffusione spettro μ s &#39;(λ) può essere approssimata essere nella forma della funzione di legge di potenza 2, 3 come μ s&#39; (λ) = a × λ -b. La potenza della dispersione b è correlata alla dimensione del scatterers biologici nel tessuto 2, 3 vivente. Alterazioni morfologiche del tessuto e riduzione della vitalità del vivente tessuto corticale possono influenzare la dimensione dei diffusori biologici 4, 5, 6, 7, 8, 9. Un sistema ottico per l&#39;imaging multispettrale riflettanza diffusa può essere facilmente costruito da un li incandescenzafonte combattere, componenti ottici semplici, e un dispositivo monocromatico carica-(CCD). Pertanto, vari algoritmi e sistemi ottici per l&#39;imaging multispettrale riflettanza diffusa sono stati utilizzati per valutare l&#39;emodinamica corticali e / o morfologia tissutale 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Il metodo descritto in questo articolo è usato per visualizzare sia la proprietà di diffusione della luce di tessuto cerebrale di ratto in vivo usando un sistema di imaging riflettanza multispettrale diffusa convenzionale emodinamica e. I vantaggi di questo metodo rispetto tecniche alternative sono la capacità di valutare le variazioni spazio-temporali in entrambi emodinamica cerebrale e tessuto corticalemorfologia, così come la sua applicabilità a vari modelli animali disfunzione cerebrale. Pertanto, il metodo sarà opportuno per le indagini di lesione traumatica cerebrale, crisi epilettiche, ictus e ischemia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="856">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:289px;">150-W halogen-lamp light source</td>
			<td style="width:281px;">Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:119px;">LA-150SAE</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Light guide</td>
			<td style="width:281px;">Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>LGC1-5L1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Collecting lens</td>
			<td style="width:281px;">Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>SH-F16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Interference filters l@500nm</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>#65088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Interference filters l@520nm</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>#65093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Interference filters l@540nm</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>#65096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Interference filters l@560nm</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>#67766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Interference filters l@570nm</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>#67767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Interference filters l@580nm</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>#65646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Interference filters l@600nm</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>#65102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Interference filters l@730nm</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>#65115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Interference filters l@760nm</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>#67777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized filter wheel&#160;</td>
			<td>Andover Corporation, NH, USA</td>
			<td>FW-MOT-12.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16-bit cooled CCD camera</td>
			<td>Bitran, Japan</td>
			<td>BS-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Video zoom lens</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>VZMTM300i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:289px;">Spectralon white standard with 99% diffuse reflectance</td>
			<td>Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA</td>
			<td>SRS-99-020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and light scattering properties of the in vivo rat brain using multispectral diffuse reflectance imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system. This system is constructed from a broadband white light source, a motorized filter wheel with a set of narrowband interference filters, a light guide, a collecting lens, a video zoom lens, and a monochromatic charged-coupled device (CCD) camera. An ellipsoidal cranial window is made in the skull bone of a rat under isoflurane anesthesia to capture in vivo multispectral diffuse reflectance images of the cortical surface. Regulation of the fraction of inspired oxygen using a gas mixture device enables the induction of different respiratory states such as normoxia, hyperoxia, and anoxia. A Monte Carlo simulation-based multiple regression analysis for the measured multispectral diffuse reflectance images at nine wavelengths (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, and 760 nm) is then performed to visualize the two-dimensional maps of hemodynamics and the light scattering properties of the in vivo rat brain.

Immagini spettrali rappresentative di riflettanza diffusa acquisito da cervelli di ratto in vivo sono mostrati in Figura 3. Le immagini a 500, 520, 540, 560, 570, e 580 nm visualizzare chiaramente una fitta rete di vasi sanguigni nella corteccia cerebrale. Il deterioramento del contrasto tra vasi sanguigni e il tessuto circostante osservata nelle immagini a 600, 730 e 760 nm riflette il minor assorbimento della luce da parte dell&#39;emoglobina a lunghezze d&#39...

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Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

La valutazione simultanea dell&#39;emodinamica cerebrale e delle proprietà di scattering della luce del tessuto cerebrale in vivo è dimostrata usando un sistema di diffusione multispectrale a riflessione diffusa.

La valutazione simultanea di Emodinamica cerebrale e Light Scattering proprietà del<em&gt; In Vivo</em&gt; Cervello del cervello usando l&#39;imaging di riflessione diffusa multispettrale

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

7.6K Views.  Tokyo University of Agriculture & Technology.  La valutazione simultanea dell'emodinamica cerebrale e delle proprietà di scattering della luce del tessuto cerebrale in vivo è dimostrata usando un sistema di diffusione multispectrale a riflessione diffusa. 

Video: Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ricerca

Neuroscienze

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Imaging funzionale di Auditory Cortex in gatti adulti utilizzando ad alto campo fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

La stimolazione cerebrale profonda con simultanea fMRI in Roditori

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultaneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Test funzionale di due retine per<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Elettroretinogramma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultanea a due fotoni<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types that comprise the BBB; these cells have a very high-energy demand, which requires optimal mitochondrial function. In the case of disease or injury, the mitochondrial function in these cells can be altered, resulting in disease or&#160;the opening of the BBB. In this manuscript, we introduce a method to measure mitochondrial function in CVE cells by using whole, intact cells and a bioanalyzer. A mito-stress assay is used to challenge the cells that have been perturbed, either physically or chemically, and evaluate their bioenergetic function. Additionally, this method also provides a useful way to screen new therapeutics that have direct effects on mitochondrial function. We have optimized the cell density necessary to yield oxygen consumption rates that allow for the calculation of a variety of mitochondrial parameters, including ATP production, maximal respiration, and spare capacity. We also show the sensitivity of the assay by demonstrating that the introduction of the&#160;microRNA, miR-34a, leads to a pronounced and detectable decrease in mitochondrial activity. While the data shown in this paper is optimized for the bEnd.3 cell line, we have also optimized the protocol for primary CVE cells, further suggesting the utility in preclinical and clinical models.

Endothelial cell mitochondria are critical to maintain blood-brain-barrier integrity. We introduce a protocol to measure bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells.

Valutazione della funzione bioenergetica in cellule endoteliali vascolare cerebrale

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Immagini di corteccia cerebrale primario celle utilizzando un sistema 2D cultura dal vivo

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Diffuse Reflectance Spectroscopy: Getting the Capillary Refill Test Under One's Thumb

The capillary refill test was introduced in 1947 to help estimate circulatory status in critically ill patients. Guidelines commonly state that refill should occur within 2 s after releasing 5 s of firm pressure (e.g., by the physician&#39;s finger) in the normal healthy supine patient. A slower refill time indicates poor skin perfusion, which can be caused by conditions including sepsis, blood loss, hypoperfusion, and hypothermia. Since its introduction, the clinical usefulness of the test has been debated. Advocates point out its feasibility and simplicity and claim that it can indicate changes in vascular status earlier than changes in vital signs such as heart rate. Critics, on the other hand, stress that the lack of standardization in how the test is performed and the highly subjective nature of the naked eye assessment, as well as the test&#39;s susceptibility to ambient factors, markedly lowers the clinical value. The aim of the present work is to describe in detail the course of the refill event and to suggest potentially more objective and exact endpoint values for the capillary refill test using diffuse polarization spectroscopy.

This protocol describes how the use of diffuse polarization spectroscopy can improve the clinical usefulness of the capillary refill test. We suggest a more detailed analysis of the course of the capillary refill in healthy volunteers using diffuse reflectance spectroscopy videos and new informatic endpoints.

Spettroscopia di riflettanza diffusa: Ottenere la prova di ricarica capillare sotto il pollice

The capillary refill test was introduced in 1947 to help estimate circulatory status in critically ill patients. Guidelines commonly state that refill ...

Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large percentage of TBI patients requiring hospitalization. DAI involves widespread axonal damage from shaking, rotation or blast injury, leading to rapid axonal stretch injury and secondary axonal changes that are associated with a long-lasting impact on functional recovery. Historically, experimental models of DAI without focal injury have been difficult to design. Here we validate a simple, reproducible and reliable rodent model of DAI that causes widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

This protocol validates a reliable, easy-to-perform and reproducible rodent model of brain diffuse axonal injury (DAI) that induces widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

Induzione di lesioni cerebrali assonali diffuse nei ratti in base all'accelerazione rotazionale

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Imaging a singola cellula dell'intero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

La valutazione simultanea di Emodinamica cerebrale e Light Scattering proprietà del

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Neuroimaging funzionale con l'impiego dell'ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI