Questo lavoro è supportato da K-INBRE P20GM103418, Kansas soia Commissione (KSC/PSU 1663), ACS PRF 56629-UNI7 e PSU polimero chimica avvio fondo, tutti a SS. Ringraziamo il videografo di università, il signor Jacob Anselmi, per il suo eccezionale lavoro con il video. Ringraziamo anche il signor Roger Heckert e la signora Katha Heckert per il loro generoso sostegno per la ricerca.

1. sintesi e funzionalizzazione di multi-parametrico Magneto-fluorescente nanosensori (MFnS).
<ol><li>Sintesi di ossido di ferro superparamagnetico nanoparticelle (IONPs) <ol><li>per preparare per la sintesi IONP, preparare le seguenti 3 soluzioni: soluzione 1: FeCl 3 (0,70 g) e FeCl 2 H 2 O (2 mL), soluzione 2: NH 4 OH (2,0 mL, 13,4 M) in H 2 O (15 mL) e soluzione 3: acido poliacrilico (0,855 g) H 2 O (5ml).</li>
		<li>µ L 90 di 2 M di acido cloridrico (HCl) alla soluzione 1 e quindi miscelare immediatamente con soluzione 2 mentre nel Vortex a 875 giri/min. Quindi aggiungere la soluzione 3. Continuare su vortex per 60 min.</li>
		<li>Centrifugare per 20 min a 1.620 x g. Centrifugare il surnatante per 20 min a 2.880 x g.</li>
		<li>Purificare il surnatante finale tramite dialisi. Aggiungere il surnatante di un sacchetto di dialisi (MWCO 6 &#8722; 8 K) e posizionarlo in un becher contenente tamponato fosfato salino (PBS) (pH = 7.4) e spin bar. Lasciare in ammollo per 12 h, sostituendo con tampone fresco ogni 2-3 h.</li>
	</ol></li> <li>Coniugazione degli anticorpi specifici per la destinazione alla superficie del IONPs <ol><li>preparare le seguenti quattro soluzioni: soluzione a: 5 mg di 1-etil - 3-(3-dimetetilpropile) carbodiimide cloridrato (EDC) in 250 µ l MES [2-(N- buffer di morpholino) ethanesulfonic acido] (0,1 M, pH = 6,8), soluzione b: 3 mg di N-Idrossisuccinimide (NHS) a 250 µ l di tampone MES (0,1 M, pH = 6,8), soluzione c: 5 µ g di IgG1, il mAb di e. coli, in 225 µ l di tampone fosfato salino (PBS) (pH 7.4) e soluzione d: 4 mL di IONP (5,0 mmol) in 1 mL di PBS (pH 7,4).</li>
		<li>Aggiungere 2-(N-morfolino) ethanesulfonic acido (MES) del buffer alla soluzione A, quindi immediatamente aggiungere soluzione alla soluzione D in piccoli incrementi entro 15 s, invertendo la soluzione dopo ogni aggiunta per la miscelazione.</li>
		<li>Immediatamente iniziare ad aggiungere soluzione B alla soluzione D in piccoli incrementi per un periodo di tre minuti. Mix invertendo la soluzione dopo ogni aggiunta.</li>
		<li>Aggiungere soluzione C soluzione con incrementi di 5 µ l, invertendo la soluzione dopo ogni aggiunta per la miscelazione.</li>
		<li>Consentire reazione continuare per 3 ore a temperatura ambiente e poi continuare l'incubazione a 4 ° C durante la notte.</li>
		<li>Purificare il IONPs Ab-coniugato risultante tramite colonna magnetica utilizzando PBS (pH = 7,4, finale [Fe] = 3,5 mmol) per rimuovere eventuali anticorpi non coniugate.
		<ol><li>Lavare la colonna magnetica con PBS (1 mL). Fissare la colonna alla piastra magnetica ed aggiungere la soluzione IONP.</li>
			<li>Lavare nuovamente la colonna magnetica con PBS (1 mL). Rimuovere la colonna magnetica dalla piastra magnetica. Aggiungere la colonna di PBS e raccogliere la soluzione. Conservare a 4 ° C</li></ol></li></ol></li> <li>incapsulamento di 1,1 fluorescente &#39; - Diottadecilbis - 3,3,3 &#39;, 3 &#39;-colorante Tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI) nel rivestimento (PAA) l'acido poliacrilico dell'anticorpo coniugato IONPs utilizzando un Metodo di diffusione di solvente.
	<ol><li>A 4 mL della IONPs, aggiungere goccia a goccia 2.0 µ l di colorante DiI (2 mmol) in 100 µ l di DMSO con miscelazione continua a 1100 giri/min.</li>
		<li>Dializzare la soluzione risultante (MWCO 6-8 KDa, 12h) contro PBS, creando una soluzione di MFnS finale con una concentrazione di ferro finale di [Fe] = 2 mmol.</li>
	</ol></li> <li>Caratterizzazione di MFnS <ol><li>per l'analisi spettrofotometrica, utilizzare un lettore di piastre per rilevare incapsulato DiI tintura con l'emissione di fluorescenza a 595 nM.</li>
		<li>Dynamic Light Scattering <ol><li>inserire un esempio della soluzione MFnS in un zetasizer per determinare la dimensione media e la carica superficiale della MFnS. 
			Nota: Qui, la dimensione media e la carica superficiale di MFnS funzionale sono stati trovati per essere 77.09 nm e -22,3 mV, rispettivamente.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. Batterica Culturing e preparazione di soluzione Stock <ol><li><ol>coltura batterica <li>idratare un pellet liofilizzato (e. coli O157: H7) in 1 mL di brodo nutritivo e quindi aggiungere un ulteriore 5 mL di brodo.</li>
		<li>Applicare 100 µ l di questa soluzione a una piastra di agar e striscia utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, seguito da incubazione a 37 ° C per 24 h.</li>
		<li>Dopo 24 h, selezionare una colonia isolata dalla piastra di agar e aggiungerlo a un 15 mL di brodo di coltura. Incubare a 37 ° C per 4-6 h, mentre si controlla il valore di densità ottica (assorbanza a 600 nm).</li>
		<li>Una volta ottenuto un valore di densità ottica di 0,1, interrompere la coltura ed eseguire diluizioni seriali.</li>
	</ol></li> <li>Diluizioni seriali <ol><li>aggiungere 900 µ l di brodo nutritivo per otto microcentrifuga sterile.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l della sospensione batterica al primo tubo (diluizione 10 -1).</li>
		<li>Prendere 100 µ l dalla prima provetta e aggiungerlo al secondo, per ottenere una diluizione di 10 -2. Proseguire in questo modo per i rimanenti tubi, terminando con una diluizione finale di 10 -8.</li>
		<li>Trasferire 100 µ l da ciascuna provetta per separare le piastre di agar e incubare per 24 h a 37 ° C.</li>
		<li>Il giorno successivo, contare la Colonia formando unità (CFUs) su ogni piatto. Selezionare il piatto con CFUs ~ 100. Utilizzare le diluizioni corrispondente per ulteriori esperimenti (100 µ l = ~ 100 CFUs). 
		Nota: Qui era la diluizione di 10 -6 che ha provocato CFUs ~ 100.</li>
	</ol></li></ol> 3. Rapido rilevamento di E. coli O157: H7 utilizzando MFnS <ol><li>Spike varie soluzioni di PBS (1 X, pH 7.4, 300 µ l) con quantità crescenti di stock batterici 10 -6, conseguente CFU varia da 1-100. Aggiungere una quantità costante di MFnS (100 µ l) di queste soluzioni.</li>
	<li>Creare una soluzione di base che contiene solo PBS (1 X, pH 7.4, 300 µ l) e MFnS (100 µ l).</li>
	<li>Incubare soluzioni a 37 ° C per 30 minuti e poi lasciarli raffreddare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferimento soluzioni individuali per la relaxometer magnetica (0,47 Tesla) e registrare le modifiche in tempi di rilassamento (T2) riguardante il CFUs in ogni soluzione.
	<ol><li>Per registrare le modifiche nei valori di T2, iniziare misurando il valore di T2 della soluzione di base che contiene solo PBS e MFnS.
		Relaxometer <ol><li>posto la soluzione in magnetico. Aprire il rispettivo software, selezionare il &#34; rilassamento T2 &#34; impostazione e premere &#34; misura. &#34;</li></ol></li> <li>dopo la raccolta della linea di base T2, misurare i valori di T2 delle soluzioni aggiuntive che sono stati diluiti con vari concentrazioni di batteri. 
		Nota: Il cambiamento in T2 è equivalente al basale T2 sottratto dal T2 spiked.</li>
	</ol></li> <li>Rimuovere i campioni dalla relaxometer magnetica e centrifugare le provette a 2880 x g per 10 min.</li>
	<li>Decantare il supernatante e risospendere il pellet batterico in 100 µ l di PBS (1 X, pH 7.4).</li>
	<li>Aggiungere 80 µ l di ogni risospensione di una piastra a 96 pozzetti e intensità di fluorescenza record a 595 nM. 
	Nota: Test può essere ripetuto utilizzando solventi vari, tra cui Lago di acqua, latte e altri come descritto nella sezione risultati</li></ol>

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</ol>

L'applicazione ha dimostrato di questa nanotecnologia non è stato ancora approvato dalla FDA.

Questo protocollo è stato progettato per produrre completamente funzionale MFnS semplicemente come possibile. Tuttavia, ci sono molti punti chiave in cui alterazione del protocollo può essere utile, a seconda dell'obiettivo finale dell'utente. Ad esempio, l'uso di anticorpi differenti consentirebbe per il targeting di molti altri agenti patogeni. Inoltre, questo protocollo non è limitato all'uso di anticorpi come molecole di targeting. Qualsiasi molecola che ha affinità di legame specifico per agenti patogeni bersaglio, come recettori di host, può essere utilizzato anche come molecole di targeting. Purché la molecola targeting è un'ammina primaria o gruppo alcolico, o possa essere funzionalizzata per avere uno, può essere coniugato alla superficie delle nanoparticelle di ossido di ferro secondo la chimica di coniugazione di EDC/NHS elencata nel protocollo. In secondo luogo, la quantità di MFnS utilizzato in ogni soluzione di rilevamento può essere variata. È importante usare abbastanza in modo che il valore di T2 per la soluzione di base (contenente solo il solvente e il nanosensore senza agente patogeno bersaglio) è nella gamma di 100-250 ms. se il valore basale è inferiore a 100, allora i cambiamenti nei valori di T2 sarà meno sensibili , a causa di una sovrabbondanza di nanosensori. Per aumentare il valore di T2 della linea di base, ridurre la quantità di nanosensori in soluzione. Se, tuttavia, la linea di base è superiore a 250, diventa eccessivamente sensibile, e falsi positivi possono diventare più probabile. Per questi motivi, si consiglia di puntare ad una soluzione di base valore T2 tra 100-250 ms.
Attuali limiti del presente protocollo, se si considera il suo uso come una diagnostica point-of-care, sono la dipendenza la corrente relaxometer magnetico benchtop. Mentre stabile ed efficace, questa piattaforma di rilassamento magnetico potrebbe essere ridotto nelle dimensioni per aumentare la portabilità. Questo aumenterebbe la facilità con cui questa piattaforma potrebbe essere utilizzata in ambienti diversi, come alle fonti d'acqua o nei mercati di generi alimentari, per lo screening batterico in loco efficace. Questo potrebbe anche ridurre il costo di questa macchina, rendendola più fattibile per il rilevamento del patogeno di point-of-care.
Per quanto riguarda l'individuazione della malattia diagnosi e patogeno nelle impostazioni di risorse limitate, questa piattaforma ha il potenziale per essere più efficace del patogeno diagnosi tecniche correnti utilizzati oggi, tra cui PCR ed ELISA. Mentre queste tecniche tradizionali hanno dimostrato di essere in gran parte efficiente, sono altamente complesso, costoso e lento. Come tale, c'è bisogno di una piattaforma diagnostica accurata che poteva essere sviluppato per l'uso nelle impostazioni di risorse limitate per il rilevamento di point-of-care degli agenti patogeni e diagnosi della malattia. Questa piattaforma è relativamente semplice da usare, conveniente e rapida. A parte costi di messa in servizio delle macchine richieste (lettore di piastra e relaxometer), il MFnS reale sono relativamente a buon mercato e molto stabile. Inoltre, l'insieme di valori di T2 è semplice e non richiede un tecnico di laboratorio professionale.
In futuro, sarà perseguito collaborazione con gli ingegneri chimici e biologici per la progettazione di un dispositivo più portatile, tenuto in mano che possa essere utilizzato per entrambi il rilevamento magnetico e fluorescente di contaminazione batterica utilizzando MFnS. Lo sviluppo di un dispositivo più piccolo contribuirebbe a ridurre i costi associati a questa piattaforma di rilevamento ulteriormente e aumentare la sua efficacia nel campo. Inoltre, questa piattaforma ha il potenziale per essere utilizzato per analizzare l'efficacia di sviluppare agenti biocidi. Come illustrato nella nostra banca dati, nostri MFnS erano solo in grado di legarsi con targeting per vivere i batteri e non prodotto poco o nessun segnale quando incubati con calore-ucciso i batteri. Sulla base di questo, la nostra piattaforma potrebbe essere utilizzato per testare l'efficacia dei candidati di biocida, e abbiamo intenzione di esplorare questo ulteriormente in futuro.
Punti critici in questo protocollo sono la sintesi iniziale di MFnS e raccolta dei dati di T2. È importante purificare correttamente il MFnS per garantire che gli anticorpi digalleggiante non interferiscano con raccolta dati T2. Inoltre, la quantità di MFnS collocato in ogni campione deve essere coerenza, come cambiamenti nella concentrazione MFnS modificherà i valori di T2, rischiando di falsi positivi/negativi.
In conclusione, MFnS sono un nuovo passo avanti nella lotta contro la contaminazione batterica e sarà ulteriormente sviluppato come il targeting di ulteriori agenti patogeni è raggiunto e il design più portatile macchine sono perseguita. Il basso costo e bassa complessità associati all'uso di MFnS li rende un valido candidato per essere utilizzato per il rilevamento in loco di contaminazione batterica. Mentre la sintesi di questi nanosensori richiede un'attenta preparazione, loro uso effettivo è relativamente semplice e dà loro il potenziale di ridurre di origine alimentare e le malattie a base acquosa. Con ulteriore sviluppo, l'implementazione di questi nanosensori può essere visti nello screening di serbatoi d'acqua e cibi nei centri di confezionamento, punti vendita e forse anche case di prodotti commercialmente.

La presenza persistente di contaminazione batterica in entrambi il cibo prodotto commercialmente e fonti d'acqua ha creato la necessità di piattaforme diagnostiche sempre più rapide e specifiche. 1 , 2 alcuni dei più comuni contaminanti batterici responsabili della contaminazione di cibo e acqua sono dei generi Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus ed Escherichia. 3 , 4 contaminazione batterica di questi agenti patogeni spesso provoca sintomi quali febbre, colera, gastroenterite e diarrea. 4 contaminazione delle fonti d'acqua spesso ha effetti drastici e negativi sulle comunità senza accesso all'acqua sufficientemente filtrata e contaminazione degli alimenti ha portato ad un gran numero di malattie e sforzi di richiamo del prodotto. 5 , 6
Al fine di ridurre l'occorrenza di malattie causate dalla contaminazione batterica, ci sono stati una serie di sforzi per sviluppare metodi che acqua e cibo possono essere efficientemente acquisiti prima della vendita o consumo. 3 tecniche come la PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,12 (amplificazione isotermica mediata da loop LAMPADA),13,14 , tra gli altri,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 recentemente sono state usate per il rilevamento di vari agenti patogeni. Rispetto al tradizionale batteriche metodi di coltura, queste tecniche sono molto più efficiente per quanto riguarda la specificità e l'ora. Tuttavia, queste tecniche ancora lottano con falsi positivi e negativi, procedure complesse e costo. 1 , 3 , 25 è per questo motivo che multiparametriche magneto-fluorescente nanosensori (MFnS) sono proposti come metodo alternativo per rilevazione batterica.
Questi nanosensori unicamente insieme coppia rilassamento magnetico e modalità fluorescente, permettendo per una piattaforma dual-rilevazione che sia rapida e accurata. Utilizzando e. coli O157: H7 come contaminante campione, la capacità di MFnS per rilevare appena 1 CFU in minuti è dimostrata. Patogeno-specifiche anticorpi sono usati per aumentare la specificità e la combinazione delle modalità sia magnetiche che fluorescente permette per la rilevazione e quantificazione di contaminanti batterici in entrambi gli intervalli di bassa e alta contaminazione. 16 nel caso di contaminazione batterica, i nanosensori saranno sciame intorno i batteri a causa della capacità di targeting degli anticorpi patogeni specifici. L'associazione tra i nanosensori magnetico e batteri limita l'interazione tra il nucleo di ferro magnetico e i protoni dell'acqua circostante. Questo provoca un aumento i tempi di rilassamento T2, come registrato da una relaxometer magnetica. Come la concentrazione di batteri in soluzione aumenta, i nanosensori disperdono con l'aumento del numero di batteri, con conseguente più bassi valori di T2. Al contrario, l'emissione di fluorescenza aumenterà in proporzione con la concentrazione dei batteri, dovuto il numero aumentato di nanosensori direttamente legati al patogeno. Centrifugazione dei campioni e l'isolamento del pellet batterico, conserverà solo le nanoparticelle direttamente collegate ai batteri, rimuovendo qualsiasi nanosensori digalleggiante e direttamente correlare l'emissione di fluorescenza con il numero di batteri presenti nella soluzione. Una rappresentazione schematica di questo meccanismo è rappresentata nella Figura 1.
Questa piattaforma di MFnS è stata progettata con lo screening di point-of-care nella mente, con conseguente caratteristiche portatile e a basso costo. MFnS sono stabili a temperatura ambiente e sono necessarie solo in concentrazioni molto basse per accuratezza nel rilevamento di contaminanti batterici. Inoltre, dopo la sintesi, uso del MFnS è semplice e non richiede l'utilizzo di professionisti qualificati nel settore. Infine, questa piattaforma diagnostica permette per il targeting altamente personalizzabile, fornendo un mezzo da cui questa una piattaforma può essere utilizzata per rilevare gli agenti patogeni di tutti i tipi, in molti contesti diversi.

<table><tbody><tr><td>Ferrous Chloride Tetrahydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>I90-500</td><td></td></tr><tr><td>Ferric Chloride Hexahydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>I88-500</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Polyacryllic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>323667-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC157270250</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E. coli O111 antibody&amp;nbsp;</td><td>sera care</td><td>5310-0352</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6]&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab75244</td><td></td></tr><tr><td>DiI Stain</td><td>Fisher Scientific</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient Broth</td><td>Difco</td><td>233000</td><td></td></tr><tr><td>Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet</td><td>ATCC</td><td>700728</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Relaxomteter&amp;nbsp;</td><td>Bruker</td><td>mq20</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern</td><td>NANO-ZS90</td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Column&amp;nbsp;</td><td>QuadroMACS</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804 Series</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (accuSpin Micro 17)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>Floor Model Shaking Incubator</td><td>SHEL LAB</td><td>SSI5</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Metler Toledo</td><td>ME104E</td><td></td></tr><tr><td>Digital Vortex Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Open-Air Rocking Shaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-217-765</td><td></td></tr></tbody></table>

foodborne pathogen screening using magneto-fluorescent nanosensor: rapid detection of e. coli o157:h7

Enteroemorragica Escherichia coli O157: H7 è stato collegato ad entrambi a base acquosa e malattie di origine alimentare e resta una minaccia nonostante i metodi di screening di cibo e di acqua utilizzata attualmente. Mentre i metodi convenzionali di rilevazione batterica, come reazione a catena della polimerasi (PCR) e analisi enzima-collegate dell'immunosorbente (ELISA) in grado di rilevare specificamente patogeni contaminanti, richiedono preparazione dei campioni ampi e lunghi periodi di attesa. Inoltre, queste pratiche richiedono impostazioni e strumenti di laboratorio sofisticati e devono essere eseguite da professionisti qualificati. Nel presente accordo, un protocollo è proposto per una più semplice tecnica diagnostica che caratterizza la combinazione unica di parametri magnetici e fluorescente in una piattaforma basata su nanoparticelle. La proposta multiparametrica magneto-fluorescente nanosensori (MFnS) in grado di rilevare e. coli O157: H7 contaminazione con appena 1 unità formanti colonie presenti in soluzione entro meno di 1 h. Inoltre, la capacità di MFnS di rimanere altamente funzionale in supporti complessi come latte ed acqua del lago è stata verificata. Ulteriori specificità analisi inoltre sono state usate per dimostrare la capacità di MFnS di rilevare solo i batteri specifici, anche in presenza di specie batteriche simili. L'abbinamento delle modalità magnetica e fluorescente permette per la rilevazione e la quantificazione di contaminazione da agenti patogeni in una vasta gamma di concentrazioni, esibendo le sue alte prestazioni nella rilevazione di contaminazione sia precoce e tardiva-stadio. L'efficacia, convenienza e portabilità della MFnS li rendono un candidato ideale per lo screening di point-of-care per contaminanti batterici in una vasta gamma di impostazioni, dai bacini acquatici per gli alimenti in commercio confezionati.

Nella Figura 1è rappresentato il meccanismo di azione di MFnS. Il clustering di MFnS intorno alla superficie di contaminanti batterici interferisce con le interazioni tra i nuclei del MFnS e i nuclei di idrogeno circostante. A seguito di questo rilassamento clustering, magnetico i valori aumentano. Man mano che aumenta la concentrazione di contaminanti batterici, clustering riduce, e il cambiamento nei valori di T2 diminuisce. Pertanto, l'aggiunta di una modalità fluorescente è fondamentale. La concentrazione batterica aumenta, aumenta la forza del segnale fluorescente prodotta da MFnS, consentendo la rilevazione sensibile di contaminanti batterici in entrambi gli intervalli di concentrazione bassa e alta.
In seguito il protocollo,16 MFnS sono stati sintetizzati e analizzati in soluzioni di PBS (1 X, pH 7.4). La modalità iniziale utilizzata per il rilevamento, rilassamento magnetico, è stata utilizzata per registrare le modifiche nei valori di T2. Conformemente al protocollo, i campioni sono stati poi centrifugati, pellet sono state risospese e fluorescenza dati sono stati raccolti. Il corrispondente ΔT2 e valori di emissione di fluorescenza sono presentati nella Figura 2. Come illustrato, il valore di ΔT2 era più grande alle concentrazioni più basse di contaminazione batterica e raggiunto la saturazione a circa 20 CFU. L'emissione di fluorescenza, d'altra parte, è diventato più preciso alle &#62; 20 CFU, l'importanza di combinare queste due modalità di visualizzazione. A seguito di queste analisi primarie, prove simili sono stati condotti in supporti complessi, compresi latte e acqua del lago. Questo è stato fatto per garantire che i nanosensori sono ancora efficaci nei mezzi di comunicazione più complesse. I dati raccolti da queste analisi sono presentati nella Figura 3 e sono molto simili per le analisi condotte in PBS. Ciò consente di verificare che questi nanosensori rimangano efficaci nel complesso media.
Dopo aver confermato che MFnS potrebbe rilevare la presenza di contaminanti batterici nei media sia semplici che complessi, una serie di test poi sono stati condotti per determinare il livello di specificità mantenuto dai nanosensori. A tal fine, MFnS sono state incubate in soluzioni contenenti batteri bersaglio, batteri bersaglio calore-ucciso, non bersaglio batteri (non patogeni di e. coli e S. typhimurium) e una miscela. Questa era solo un'analisi della specificità, la raccolta di dati di rilassamento magnetico da solo era sufficiente, e i dati corrispondenti sono presentati nella Figura 4. Come si può vedere, il MFnS associato solo a vivere e. coli O157: H7 e non per gli altri batteri calore-ucciso o non bersaglio. Questo livello di specificità è attribuito agli anticorpi coniugati targeting e conferma ulteriormente che MFnS sarà efficace nel rilevare contaminanti patogeni specifici, anche quando in presenza di specie di batteri non patogeni.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55821/55821fig1.jpg"> 
Figura 1 : Meccanismo di rilevamento di magneto-fluorescente. Rappresentazione schematica della sintesi di MFnS e il meccanismo dual-modal di rilevazione batterica. Dopo un periodo di incubazione breve (30 min), MFnS sono in grado di rilevare con sensibilità i batteri di destinazione tramite una combinazione di risonanza magnetica e l'emissione di fluorescenza. Clustering di MFnS intorno alla superficie di contaminanti batterici provoca cambiamenti nei valori di rilassamento magnetico, rilevabili da una relaxometer magnetica. Inoltre, i segnali fluorescenti possono essere raccolti da MFnS direttamente associato a contaminanti batterici. Questo fornisce una piattaforma dual-modal rilevamento capace di contaminanti batterici di rilevamento in entrambi gli intervalli di concentrazione bassa e alta. 16 questa figura è stata modificata con il permesso. 16
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55821/55821fig2v3.jpg"> 
Figura 2 : Proof of Concept. A) dati magnetico relax (ΔT2) in primo luogo è stato raccolto da diluizioni di e. coli O157: H7 (1-100 CFU) in solvente PBS (1 X, pH = 7.4). Signor rilevazione dei batteri era altamente sensibile a bassa conta CFU (inserto: che vanno da 1-20 CFU). Tuttavia, le letture di ΔT2 è diventato saturo alle più alte concentrazioni batteriche (&#62; 20 CFU), che indica che il signor è più prezioso per la rilevazione e la quantificazione della fase iniziale di contaminazione batterica. B) dati di emissione di fluorescenza dallo stesso spillo soluzioni PBS (inserto: trama di linearità). I risultati hanno mostrato che il metodo di rilevazione di fluorescenza è più sensibile al più alto numero di CFU, mentre è privo di sensibilità per Bassi campioni di CFU. Insieme, questi dati dimostrano la capacità di modalità sia magnetiche che fluorescente per rilevare e quantificare la contaminazione batterica in precoce e tardiva-fasi di contaminazione batterica. 16 valori medi di tre misurazioni sono raffigurati ± errore standard. Questa figura è stata modificata con il permesso. 16
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55821/55821fig3v3.jpg"> 
Figura 3 : Rilevazione batterica nel complesso Media. Rilassamento magnetico ΔT2 dati raccolti dai mezzi più complessi, compreso A) Lago acqua e B) di latte intero. Simile ai dati raccolti dalle precedenti soluzioni di PBS, è stato notato che la rilevazione di contaminanti batterici era più sensibile nella gamma di 1-20 CFU (inserti). Corrispondenti dati di emissione di fluorescenza è stato raccolto per la C) acqua del lago e D) campioni di latte (inserti: trame di linearità), che ha mostrato maggiore sensibilità con l'aumento del numero di CFU. Ancora una volta, questi dati dimostrano l'efficacia con cui ogni modalità complementare a altro e convalidare la loro capacità di rimanere funzionale in supporti complessi. 16 valori medi di tre misurazioni sono raffigurati ± errore standard. Questa figura è stata modificata con il permesso. 16
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55821/55821fig4v3.jpg"> 
Figura 4 : MFnS specificità. La specificità del MFnS è stata testata utilizzando analisi signor nelle soluzioni di brodo nutritivo contenente A) un numero di croce-contaminanti batterici e una miscela e B) calore inattivanti Escherichia coli O157: H7. Come illustrato, è chiaro che i nanosensori non hanno poco o nessuna associazione con batteri non mirati e sono ancora in grado di rilevare i batteri di destinazione in presenza di altri contaminanti, assicurando che questa forma di screening sarebbe viaBLE per uso nei mezzi di comunicazione complessi che contengono un numero di specie di batteri non patogeni. C) ulteriore specificità test è stato condotto mediante la sintesi di MFnS con un isotipo dell'anticorpo (cerchi rossi: Anti -Escherichia coli O111), che ha provocato poco a nessuna associazione rispetto alla MFnS di anticorpo coniugato O157: H7 (quadrati neri). Questi dati dimostrano che MFnS solo reagire con batteri bersaglio praticabile, ulteriormente verificando la loro efficacia come una piattaforma diagnostica point-of-care. 16 valori medi di tre misurazioni sono raffigurati ± errore standard. Questa figura è stata modificata con il permesso. 16

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Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

L'obiettivo generale del presente protocollo è di sintetizzare funzionale Nanosensori per il portatile, conveniente, e rilevamento rapido di specificamente mirati batteri patogeni attraverso una combinazione di rilassamento magnetico e le modalità di emissione di fluorescenza.

Agenti patogeni di origine alimentare Screening utilizzando Magneto-fluorescente nanosensore: Rilevazione rapida di e. Coli O157: H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

foodborne-pathogen-screening-using-magneto-fluorescent-nanosensor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

7.6K Views.  Pittsburg State University. L'obiettivo generale del presente protocollo è di sintetizzare funzionale Nanosensori per il portatile, conveniente, e rilevamento rapido di specificamente mirati batteri patogeni attraverso una combinazione di rilassamento magnetico e le modalità di emissione di fluorescenza.

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Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Rilevamento ottico di<em&gt; E. coli</em&gt; Batteri di mesoporosi Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Bioingegneria

Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and its conjugation with deferoxamine, a siderophore recognized by Yersinia enterocolitica, using a succinyl moiety as a linker are described.
Magnetic nanoparticles (MNP) of magnetite (Fe3O4) were prepared by solvothermal method and coated with SiO2 (MNP@SiO2) using the St&#246;ber process followed by functionalization with APTES (MNP@SiO2@NH2). Then, feroxamine was conjugated with the MNP@SiO2@NH2 by carbodiimide coupling to give MNP@SiO2@NH2@Fa. The morphology and properties of the conjugate and intermediates were examined by eight different methods including powder X-Ray diffraction (XRD), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), Raman spectroscopy, X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), transmission electron microscopy (TEM) and energy dispersive X-Ray (EDX) mapping. This exhaustive characterization confirmed the formation of the conjugate. Finally, in order to evaluate the capacity and specificity of the nanoparticles, they were tested in a capture bacteria assay using Yersinia enterocolitica.

This work describes protocols for the preparation of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and its conjugation with deferoxamine using a succinyl moiety as a linker. A deep structural characterization description and a capture bacteria assay using Y. enterocolitica for all the intermediate nanoparticles and the final conjugate are also described in detail.

Sintesi di nanoparticelle magnetiche funzionalizzate, la loro coniugazione con la feroxamina Sideroforo e la sua valutazione per il rilevamento dei batteri

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with ...

Chimica

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Rapida rilevazione omogenea dei saggi biologici Utilizzando Magnetic biopercezione sistema di modulazione

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Biologia

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Sviluppo di un biosensore elettrochimico del DNA per rilevare un patogeni di origine alimentare

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

Nanosensori per rilevare attività della proteasi In Vivo per la diagnostica non invasiva

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System

Polymerase chain reaction (PCR) is a traditional method employed for the amplification of a target gene that has played an important role in biomolecular diagnostics. However, traditional PCR is very time-consuming because of the low-temperature variation efficiency. This work proposes a continuous-flow-PCR (CF-PCR) system based on a microfluidic chip. The amplification time can be greatly reduced by running the PCR solution into a microchannel placed on heaters set at different temperatures. Moreover, as capillary electrophoresis (CE) is an ideal way to differentiate positive and false-positive PCR products, a CE system was built to achieve efficient separation of the DNA fragments. This paper describes the process of amplification of Escherichia coli (E. coli) by the CF-PCR system built in-house and the detection of the PCR products by CE. The results demonstrate that the target gene of E. coli was successfully amplified within 10 min, indicating that these two systems can be used for the rapid amplification and detection of nucleic acids.

Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System

This protocol describes how to build a continuous-flow-polymerase chain system based on a microfluidic chip and how to build a capillary electrophoresis system in the lab. It presents a simple method for the analysis of nucleic acids in the lab.

Amplificazione di Escherichia coli in un chip microfluidico PCR a flusso continuo e sua rilevazione con un sistema di elettroforesi capillare

Polymerase chain reaction (PCR) is a traditional method employed for the amplification of a target gene that has played an important role in biomolecular ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Rilevamento dal vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 Celle di PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. Such methods need to be user-friendly and produce reliable results that can be easily interpreted by both specialists and non-professionals. The litmus test for pH is simple, quick, and effective as it reports the pH of a test sample via a simple color change. We have developed an approach to take advantage of the litmus test for bacterial detection. The method exploits a bacterium-specific RNA-cleaving DNAzyme to achieve two functions: recognizing a bacterium of interest and providing a mechanism to control the activity of urease. Through the use of magnetic beads immobilized with a DNAzyme-urease conjugate, the presence of bacteria in a test sample is relayed to the release of urease from beads to solution. The released urease is transferred to a test solution to hydrolyze urea into ammonia, resulting in an increase of pH that can be visualized using the classic litmus test.

We describe a protocol for colorimetric detection of E. coli using a modified litmus test that takes advantage of an RNA-cleaving DNAzyme, urease, and magnetic beads.

Colorimetrico rilevamento di batteri Uso tornasole Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Agenti patogeni di origine alimentare Screening utilizzando Magneto-fluorescente nanosensore: Rilevazione rapida di e. Coli O157: H7

Riepilogo

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