Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) e il Network Bioactive Paper Sentinel.

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A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pH3DZ1+-+An+RNA-cleaving+deoxyribozyme+with+optimal+activity+at+pH+3.">Characterization of pH3DZ1 - An RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 3.</a> Can. J. Chem. 85, 261-273 (2007).</li><li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+signaling+platforms+built+from+a+small+catalytic+DNA+and+doubly+labeled+fluorogenic+substrates.">Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates.</a> Nucleic Acids Res. 35, 401-405 (2007).</li><li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+MgZ+based+on+a+non-classic+allosteric+design.">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA MgZ based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS ONE. 2, e1224 (2007).</li><li>Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapment+of+fluorescence+signaling+DNA+enzymes+in+sol+gel-derived+materials+for+metal+ion+sensing.">Entrapment of fluorescence signaling DNA enzymes in sol gel-derived materials for metal ion sensing.</a> Anal. 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K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+protein-binding+DNA+aptamers+as+ligands+for+biosensing+applications.">In vitro selection of protein-binding DNA aptamers as ligands for biosensing applications.</a> Methods Mol. Biol. 504, 399-415 (2009).</li><li>Ali, M. M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+sensing+by+using+allosteric-DNAzyme-coupled+rolling+circle+amplification+and+a+peptide+nucleic+acid-organic+dye+probe.">Colorimetric sensing by using allosteric-DNAzyme-coupled rolling circle amplification and a peptide nucleic acid-organic dye probe.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 3512-3515 (2009).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

La maggior parte dei metodi comuni di rilevazione batteriche oggi sono o lento (microbica classico) o tecnicamente impegnativo (anticorpi, PCR). Pertanto, riteniamo che la prossima generazione di strumenti di rilevazione devono provvedere verso la velocità e la semplicità. A questo scopo, abbiamo creato un RNA-congiunzione e fluorescenza DNAzyme segnalazione che può essere usato per sviluppare saggi semplici per segnalare la presenza di batteri attraverso la generazione di un segnale di fluorescenza. La funzionalità DNAzyme sonda, RFD-EC1, viene attivato dal CEM prodotto durante la crescita di E. coli in terreni di coltura. Poiché il nostro metodo utilizza miscele grezze extracellulari di un batterio come destinazione di rilevamento e bypassa l&#39;estrazione laboriosa bersaglio e passaggi di amplificazione, può essere utilizzato per impostare molto semplice, &quot;mix-e-leggere&quot; tipo di analisi per la scoperta batterica. L&#39;utilizzo del nostro DNAzyme non è limitato a fluorescenza metodo di rilevamento basato. Ad esempio, il rilevamento colorimetrico utilizzando lo stesso sistema di dosaggio DNAzyme cuno essere realizzato utilizzando un metodo precedentemente riportato che sfrutta amplificazione laminazione cerchio in combinazione con un colorante organico. 32 Si prevede l&#39;uso di DNAzimi per la rivelazione batterica come un attraente via per generare nuovi biosensori batterici con maggiore semplicità operativa.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo o modello </td></tr><tr><td> Agar </td><td> Bioshop Canada </td><td> AGR003 </td></tr><tr><td> Ammonio persolfato (APS) </td><td> Bioshop Canada </td><td> AMP001 </td></tr><tr><td> L&#39;acrilamide / bis-acrilammide (40%, 29:1) </td><td> Bioshop Canada </td><td> ACR004 </td></tr><tr><td> Acido borico </td><td> Bioshop Canada </td><td> BOR001 </td></tr><tr><td> Blu di bromofenolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8026 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> EM Science </td><td> EXO539-1 </td></tr><tr><td> HCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 38281 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshop Canada </td><td> HEP001 </td></tr><tr><td> LB brodo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3022 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> EMDProdotti chimici </td><td> B10149-34 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop Canada </td><td> SOD002 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> EMD Chemicals </td><td> SXO255-1 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> EMD Chemicals </td><td> SXO590-1 </td></tr><tr><td> SDS </td><td> Bioshop Canada </td><td> SDS001 </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Bioshop Canada </td><td> TEM001 </td></tr><tr><td> Tris-base </td><td> Bioshop Canada </td><td> BST666 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9416 </td></tr><tr><td> Urea </td><td> Bioshop Canada </td><td> URE001 </td></tr><tr><td> Xylenecyanol FF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X4126 </td></tr><tr><td> DNA concentratore </td><td> Thermo Scientific </td><td> Savant DNA SpeedVac 120 </td></tr><tr><td> Millex Unità di filtraggio </td><td> Millipore </td><td> SLGP033RS </td></tr><tr><td> Gel di carico suggerimenti </td&gt; <td> DiaMed </td><td> TEC200EX-K </td></tr><tr><td> Software ImageQuant </td><td> Dinamica Molecolare </td><td> Versione 5.0 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark Professional </td><td> 34705 </td></tr><tr><td> Mini vortex </td><td> VWR </td><td> 58816-121 </td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Pechiney Plastic Packaging </td><td> PM996 </td></tr><tr><td> Scatole Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> FISHERBRAND 08-757-12 </td></tr><tr><td> Stripettor Plus (Pipette pistola) </td><td> Corning </td><td> 07764714 </td></tr><tr><td> Cuvette di quarzo </td><td> Varian Inc </td><td> 66-100216-00 </td></tr><tr><td> Shaker / Incubatore </td><td> New Brunswick Scientific </td><td> Classic Series C24 </td></tr><tr><td> Typhoon Scanner </td><td> GE Healthcare </td><td> 9200 Modalità variabile </td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X22-R </td></tr><tr><td> Spettrofotometro UV </td><td> Thermo Scientific </td><td> GenesysUV 10 </td></tr><tr><td> Spettrofotometro a fluorescenza </td><td> Varian Inc </td><td> Cary Eclipse </td></tr></tbody></table>

detection of bacteria using fluorogenic dnazymes

Le epidemie legate al cibo-borne e acquisita in ospedale conto patogeni per milioni di morti e ricoveri, nonché colossali perdite economiche ogni anno. La prevenzione di tali epidemie o minimizzare l&#39;impatto di un luogo epidemia in corso una sempre crescente domanda di metodi analitici in grado di identificare con precisione i patogeni colpevole nella fase più precoce. Anche se vi è una vasta gamma di metodi efficaci per l&#39;individuazione degli agenti patogeni, nessuno di loro può soddisfare tutte le seguenti cinque requisiti premier incarnati per un metodo ideale di rilevazione: alta specificità (la rilevazione solo il batterio di interesse), elevata sensibilità (in grado di rilevare il più basso come una singola cellula batterica dal vivo), a breve time-to-risultati (minuti a ore), grande semplicità operativa (senza bisogno di lunghe procedure di campionamento e l&#39;uso di attrezzature specializzate), e l&#39;efficacia dei costi. Ad esempio, classici metodi microbiologici sono altamente specifici, ma richiedono un lungo tempo (days a settimana) per acquisire un risultato definitivo. 1 PCR e tecniche basate su anticorpi offrono brevi tempi di attesa (ore o giorni), ma richiedono l&#39;uso di reagenti costosi e / o apparecchiature sofisticate. 2-4 conseguenza, vi è ancora una grande richiesta per la ricerca scientifica verso lo sviluppo di innovativi metodi di rilevazione di batteri in grado di offrire caratteristiche migliorate in uno o più dei requisiti di cui sopra. Il nostro laboratorio è interessati ad esaminare il potenziale di DNAzimi come una nuova classe di sonde molecolari per applicazioni di biosensori inclusa l&#39;individuazione di batteri. 5 DNAzimi (noto anche come deoxyribozymes enzimi o DNA) sono artificiali elica singola molecole di DNA con la capacità di catalizzare reazioni chimiche. 6-8 Queste molecole possono essere isolato da una vasta casuale sequenza di DNA piscina (che contiene fino a 10 16 singole sequenze) mediante un processo noto come &quot;selezione in vitro&quot; or &quot;SELEX&quot; (evoluzione sistematica di ligandi di arricchimento esponenziale). 9-16 Queste molecole di DNA speciali sono stati ampiamente esaminati negli ultimi anni, come strumenti molecolari per applicazioni di biosensori. 6-8 Il nostro laboratorio ha stabilito nelle procedure di selezione in vitro per l&#39;isolamento di RNA-cleaving DNAzimi fluorescenti (RFD;. Fig. 1) e ha studiato l&#39;uso di RFD come strumenti analitici 17-29 RFD catalizzare la scissione di un substrato di DNA-RNA chimerico in un ribonucleotide singolo. giunzione (R) che è affiancato da un fluoroforo (F) e un quencher (Q). La vicinanza di F e Q rende la fluorescenza non scissa substrato minimo. Tuttavia, l&#39;evento scissione porta alla separazione di F e Q, che è accompagnato da significativo aumento dell&#39;intensità di fluorescenza. Più recentemente, abbiamo sviluppato un metodo per isolare RFD per la rilevazione dei batteri. 5 Questi RFD speciali sono stati isolati a &quot;illuminare &quot;in presenza della miscela grezza extracellulare (CEM) lasciata da un tipo specifico di batteri nel loro ambiente o nei mezzi di coltura sono essi (Fig. 1). L&#39;uso della miscela grezza aggira il processo di purificazione e tedioso identificazione di un bersaglio adatto dal microbo di interesse per lo sviluppo biosensore (che potrebbe richiedere mesi o anni per completare). L&#39;uso di obiettivi extracellulari: la procedura è semplice saggio perché non vi è alcuna necessità di attivarsi per ottenere bersagli intracellulari. Utilizzando l&#39;approccio di cui sopra, abbiamo derivato uno RFD che fende il suo substrato (FS1;. Fig. 2A) solo in presenza del CEM prodotta da E. coli (CEM-CE). 5 Questa E. coli-sensing RFD, di nome RFD-EC1 (Fig. 2A), è stato ritenuto strettamente rispondenti alle CEM-CE, ma che non risponde a CEM da una serie di altri batteri (Fig. 3). Qui Present le procedure chiave sperimentale per la costituzione di E. coli test di rilevazione utilizzando i risultati RFD-EC1 e rappresentativo.

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Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Abbiamo recentemente riportato un nuovo approccio per generare sonde DNAzyme fluorogenici che possono essere applicati per impostare un semplice, &quot;mix-e-leggere&quot; test di fluorescenza per la rilevazione batterica. Queste sonde di DNA specifiche catalizzare il clivaggio di un cromoforo-modificato DNA-RNA chimerico substrato in presenza della miscela grezza extracellulare (CEM) prodotta da un batterio specifico, così traducendo rilevamento batterica nella generazione del segnale di fluorescenza. In questa relazione si descrivono principali procedure sperimentali in cui è occupato di una sonda specifica indicata DNAzyme &quot;RFD-EC1&quot; per il rilevamento del batterio del modello,<em&gt; Escherichia coli (E. coli)</em&gt;.

Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

detection-of-bacteria-using-fluorogenic-dnazymes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.7K Views.  McMaster University. Abbiamo recentemente riportato un nuovo approccio per generare sonde DNAzyme fluorogenici che possono essere applicati per impostare un semplice, "mix-e-leggere" test di fluorescenza per la rilevazione batterica. Queste sonde di DNA specifiche catalizzare il clivaggio di un cromoforo-modificato DNA-RNA chimerico substrato in presenza della miscela grezza extracellulare (CEM) prodotta da un batterio specifico, così traducendo rilevamento batterica nella generazi...