Questo metodo affronta come analizzare i processi di sviluppo come le contrazioni muscolari e il rotolamento che si verificano nell'embrione Drosophila. Alcuni vantaggi di questa tecnica sono che non è invasiva e abbastanza dettagliata, ma è relativamente semplice da eseguire. Il nostro metodo può essere ulteriormente sviluppato per lo screening basato sull'analisi ad alto contenuto per isolare e analizzare nuove mutazioni che influenzano le contrazioni muscolari embrionali e altri processi di sviluppo.
Quando si visualizzano le contrazioni muscolari, è importante temporizzare correttamente le raccolte di embrioni perché le contrazioni iniziano solo in una fase di sviluppo specifica. La dimostrazione visiva dettagliata può aiutare notevolmente nell'analisi quantitativa dei processi di sviluppo. Per l'imaging dal vivo di embrioni Drosophila montati, posizionare gli embrioni sullo stadio di un microscopio a epifluorescenza con funzione timelapse e una fotocamera digitale con filtri di emissione adatti e selezionare un obiettivo di immersione in acqua 10X.
Quindi i video in diretta registrano gli embrioni utilizzando l'appropriato software di registrazione al microscopio per circa una o due ore con una velocità di acquisizione di quattro fotogrammi al secondo. Alla fine dell'esperimento, esportare il video registrato direttamente in ImageJ. Seleziona l'immagine e ritaglia per disegnare una scatola intorno a ogni singolo embrione per ritagliare le registrazioni video alle dimensioni di ogni embrione.
Fate clic su Immagine (Image), Trasforma (Transform) e Ruota (Rotate) per ruotare le immagini ritagliate per ottenere una posizione verticale della linea mediana dell'embrione rispetto allo schermo. Per impostare le misurazioni della distanza su micrometri, fate clic su Analizza (Analyze) e imposta scala (Set Scale), quindi immettete il fattore di conversione noto tra pixel e micron ratio per la configurazione del microscopio. Tutte le misurazioni successive saranno quindi riportate in micrometri.
Per analizzare il rotolamento dell'embrione, contrassegnare innanzitutto la posizione di una o entrambe le trachee di un embrione nel primo fotogramma del video a metà strada tra le estremità posteriore e anteriore e fare clic su Analizza, Strumenti e Region of Interest Manager. Disegna una casella approssimativa di sette micrometri per sette micrometri intorno alla trachea e fai clic sul tasto T sulla tastiera per registrare questa posizione come coordinata XY. Contrassegnare la posizione della stessa area della trachea dopo contrazioni peristaltiche di interesse e tracciare una linea che colleghi i centri di ogni casella facendo clic su M sulla tastiera per misurare la distanza dalla posizione di pre-contrazione alla posizione post-contrazione.
Per analizzare le contrazioni muscolari embrionali utilizzando embrioni che esprimono marcatori muscolari fluorescenti, utilizzare la registrazione della lettura fluorescente per disegnare una regione di interesse incentrata sui muscoli fluorescenti di un particolare segmento corporeo di interesse. Selezionare la scheda Aggiungi T in Gestione regioni di interesse per registrare la posizione dell'area di interesse. Fare clic su Region of Interest Manager e Measure per registrare l'intensità fluorescente media di ogni area di interesse selezionata per ogni fotogramma del video.
Spostate la casella ai centri di altri segmenti di corpo di interesse e fate clic su Aggiungi T per registrare le loro posizioni per ottenere regioni di interesse di dimensioni identiche in tutti i segmenti del corpo da analizzare. In Region of Interest Manager tenere premuto ctrl selezionando tutte le regioni di interesse registrate come coordinate XY. Fate clic su Altro (More) e Multi-misura (Multi-Measure) per misurare l'intensità fluorescente media di ogni regione di interesse per tutti i fotogrammi del video.
In questo modo ogni misurazione verrà riportata in una tabella con ogni area di interesse come colonna della tabella e ogni fotogramma come riga. Quindi trasferire la tabella in un programma di fogli di calcolo per ulteriori analisi. Tracciate un grafico con il numero di fotogramma sull'asse x e l'intensità media della fluorescenza sull'asse y e convertite il numero di fotogramma nel tempo utilizzando i quattro fotogrammi al secondo.
Le contrazioni muscolari aumentano l'intensità della GFP in quanto portano più GFP in prossimità dell'area focale man mano che più muscoli vengono tirati durante queste contrazioni. Per determinare l'ampiezza della contrazione muscolare, stimare l'intensità della FPG di base come intensità media delle regioni tra i picchi. Quindi valutare l'aumento dell'intensità di fluorescenza della FPG rispetto a questa linea di base.
Quindi dividi ogni valore di intensità della regione di interesse per l'intensità della linea di base per normalizzare l'intensità della FPG alla linea di base. Confrontare le intensità GFP normalizzate nei segmenti posteriore, mediale e anteriore durante l'onda di contrazione muscolare per esaminare i cambiamenti nell'estensione della contrazione muscolare man mano che l'onda si propaga e per determinare la direzione dell'onda. Per confrontare le contrazioni muscolari sui lati sinistro e destro dell'embrione, analizzare le intensità di picco per gli stessi segmenti su entrambi i lati dell'embrione.
Usa l'ampiezza della contrazione e la tempistica dei picchi per rivelare le eventuali differenze, e l'estensione e la tempistica delle onde di contrazione muscolare peristaltica. Qui vengono mostrate normali contrazioni muscolari peristaltiche in un embrione di Drosophila di tipo selvatico. In questo video di rotolamento in un embrione di tipo selvatico, si noti che l'appendice dorsale non si muove mentre la trachea indica che l'embrione è rotolato all'interno del suo guscio.
In questa analisi rappresentativa, i picchi di contrazione muscolare durante il periodo di tempo da 165 a 178 secondi rappresentano una singola onda in avanti. Per questo embrione, nessuna differenza nell'ampiezza e nel tempo delle contrazioni muscolari è stata misurata sul lato destro e sinistro dell'embrione. Una contrazione peristaltica è designata come onda di tipo 1 anteriore se il suo profilo ha un picco che si presenta nella regione posteriore per primo seguito da picchi nelle regioni centrali e anteriori.
Un'onda di tipo uno all'indietro è un picco che si verifica prima nei segmenti anteriori e poi si propaga verso le regioni posteriori. Le onde di tipo due iniziano da un'estremità dell'embrione e procedono verso le regioni centrali prima di tornare alla loro origine come un'onda di spazzamento ria iniziata all'estremità opposta. Gli embrioni mutanti della postura corporea dimostrano una frequenza relativa anomala di tipo uno alla generazione di onde di tipo due che si traduce in un'anomalia della postura corporea designata come torsione del corpo o fenotipo di rotazione.
Per usare la fluorescenza come lettura per i parametri di contrazione muscolare, è essenziale utilizzare embrioni con un reporter nel tessuto muscolare. Questo metodo può essere utilizzato per la registrazione simultanea delle contrazioni muscolari di molti embrioni e per la valutazione delle risposte a vari stimoli, farmaci o cambiamenti ambientali.
