Siamo grati a Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya per l&#39;assistenza durante la preparazione di questo manoscritto; Mariana Wolfner per le discussioni su attivazione uovo; Matt Wayland per il supporto delle immagini; e Nan Hu per il supporto generale in laboratorio. Questo lavoro è stato sostenuto dalla University of Cambridge, ISSF a TTW [concessione numero 097.814].

Nota: Eseguire tutte le misure a temperatura ambiente, se non diversamente indicato. 1. Preparazione per la dissezione Nota: I passi qui descritti sono conformi E. Gavi, Princeton University e Weil et. al. 18. Effettuare le seguenti operazioni due giorni prima di imaging. <ol><li> Prendere una fiala mosca contenente circa 10 ml di cibo solido e aggiungere una piccola quantità di lievito secco per un angolo, meno di 1 g è sufficiente. Nota: Per informazioni su fiale mosca o cibo vedere &#39;Drosophila Manutenzione&#39; 19. </li><li> Aggiungere 1 - 3 gocce d&#39;acqua per idratare il lievito. </li><li> Impostare la fiala parte ad un angolo di 45 ° e consentire 3 - 5 min per il lievito per prendere l&#39;acqua. </li><li> Mentre il lievito sta assorbendo l&#39;acqua, scegliere una bottiglia di mosche che esprimono UASt- MYR GCaMP5 20 guidata da vasca-VP16GAL4 (denominato GCaMP5) che hanno recentemente emerse (un myristoymodulo lata del GCaMP5 è stata scelta per fornire un elevato rapporto segnale rumore attraverso legare il GECI alla membrana nell&#39;uovo). </li><li> Anestetizzare le mosche in bottiglia con gas CO 2. Assicurarsi di tenere la bottiglia capovolta in modo da non perdere le mosche nel cibo umido. </li><li> Suggerimento le mosche anestetizzati su un batuffolo di CO 2 e di tipo 10 - 15 femmine e 5 maschi con un pennello sotto un microscopio da dissezione. Nota: E &#39;standard per includere i maschi per fornire le femmine sani per la dissezione. </li><li> Quando la fiala dal punto 1.3 è pronto, aggiungere le mosche selezionati al flaconcino. Fare attenzione a tenere la orizzontale flacone fino a quando le mosche diventano attivi. </li><li> Posizionare il flacone a 25 ° C per circa 36 ore. </li><li> Riportare le restanti mosche dal CO 2 pad per la bottiglia o scarti. </li></ol> 2. dissezione Drosophila ovaie Nota: I passi qui descritti sono conformi Weil et. al. <sup&gt; 18. <ol><li> Dopo 36 ore, anestetizzare le mosche dal flaconcino yeasted con CO 2. </li><li> Una volta che le mosche all&#39;interno della fiala vengono anestetizzati loro punta sul pad CO 2 per essere filtrate con un pennello sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Selezionare una femmina. </li><li> Isolare le due ovaie dalla femmina. Per un pieno protocollo dettagliato vedere Weil et. al. 18. In sintesi: <ol><li> Mettere una piccola goccia di olio Halocarbon ossigenato (serie 95) su un No. 1.5, 22 x 40 mm coprioggetto. </li><li> Afferrare la femmina con una pinza a anterior dell&#39;addome. </li><li> Tenendo la femmina sotto il microscopio da dissezione, utilizzare il secondo set di pinze per rimuovere delicatamente la parte posteriore del femminile. </li><li> Pulire il tessuto posteriore, dalla seconda pinza. </li><li> Premere sulla cavità addominale con la seconda pinza da anteriore a posteriore dell&#39;addome. I due ovaie opache devono attenersi ai forcipe al di fuori della femaLe. </li><li> Toccare le ovaie nell&#39;olio. </li><li> Rimuovere qualsiasi tessuto dalle pinze pulendo fuori le pinze. </li><li> Ripetere questi passaggi (2.4.1 - 2.4.7) per ottenere tre lamelle, ognuna ovaie contenenti da una mosca. </li></ol></li></ol> 3. isolamento individuale uova mature <ol><li> Sotto un microscopio da dissezione di serie con l&#39;ingrandimento impostato 4X, il primo vetrino dal punto 2.4, separare le due ovaie strappando ovidotto. </li><li> Introdurre un paio di pinze chiuse al centro di un singolo ovaio, facendo attenzione a non forare qualsiasi camere d&#39;uovo. </li><li> Inserire una sonda dissezione standard al centro della dell&#39;ovaio accanto alle pinze chiuse. </li><li> trascinare delicatamente la sonda dissezione attraverso l&#39;ovaio verso il polo posteriore, dove si trovano le uova mature (fase 14 camere d&#39;uovo). </li><li> Ripetere i passi 3.1 - 3.4 2 - 5 volte a seconda delle dimensioni delle ovaie e numero di uova. Nota: L&#39;aggiunta di CO 2 </sub&gt; normalmente provoca la deposizione di un singolo uovo che apparirà più grande con appendici dorsali sollevate dalle uova pre-depositato. Questo uovo deve essere eliminata per l&#39;imaging in quanto è già stato attivato all&#39;interno della femmina. Nota: le uova mature sono suscettibili di separare facilmente dal tessuto connettivo ovarico. </li><li> Se non ci sono le uova mature sono visibili al di fuori delle ovaie, continua dolcemente prendere in giro con la sonda dissezione. </li><li> Una volta che le uova mature sono visibili sul vetrino di fuori delle ovaie, manovrare 3 - 5 in una linea al centro del vetrino. Nota: Per ottenere risultati ottimali, eseguire la sonda delicatamente lungo il lato delle uova. Nota: Evitare di tirare su le appendici dorsali come questo può danneggiare l&#39;uovo. Nota: A seconda del futuro di imaging di set-up, allineare le uova di circa 200 micron a parte perpendicolare al vetrino per la massima area di esposizione. </li><li> Una volta allineata, rimuovere il resto del tessuto ovarico trascinandola lontano dalle uova allineate usando l&#39;forceps. </li><li> Rimuovere l&#39;olio in eccesso tamponando con l&#39;angolo di pulire un medico. Fare attenzione a non toccare le uova mature con il medico wipe uova mature che vengono contattati verranno persi. </li><li> Disegnare un mirino sul vetrino con un pennarello per semplificare l&#39;individuazione del campione sotto il microscopio. </li><li> Impostare il vetrino in un luogo sicuro e lasciare le camere di uova preparate sul vetrino di riposare per 5 - 10 minuti. Questo permette l&#39;uovo di stabilirsi nell&#39;olio. I campioni possono essere utilizzati fino a 1 ora dopo la dissezione. </li><li> Ripetere i passaggi 3,1-3,11 per il resto i coprioggetti con ovaie su di loro. </li></ol> 4. Preparazione per l&#39;imaging <ol><li> Portare buffer di attivazione preparati 15 a temperatura ambiente. Nota: tampone attivazione è un buffer ipotonico: 3.3 mM NaH 2 PO 4, 16.6 mM KH 2 PO 4, 10 mM NaCl, 50 mM KCl, 5% di polietilenglicole 8000, 2 mM CaCl 2, portata a pH 6,4 con 1: 5 rapporto di NaOH: KOH.Per ulteriori informazioni, vedere Mahowald 1983 15. Aliquote di buffer di attivazione può essere conservato a -20 ° C per mesi e a 4 ° C fino a 2 settimane. </li><li> trasportare con cura vetrini preparati, buffer di attivazione e pipette di vetro per l&#39;impianto di imaging. Nota: Un grande campo, confocale, disco rotante o microscopio foglio di luce possono essere utilizzati. Si consiglia di utilizzare un microscopio invertito. I nostri risultati rappresentativi sono stati ottenuti utilizzando un microscopio confocale. </li><li> Un obiettivo adatto per l&#39;imaging dell&#39;intero uovo maturo dovrebbe essere scelto (qui: 20X 0.7 NA). </li><li> Montare il primo vetrino preparato sul palco microscopio. Fare attenzione a non rompere i coprioggetti sul palco. </li><li> selezionare Qualitativamente un campo visivo con una camera di uovo maturo per l&#39;attivazione. Non immagine forato camere uovo o con blebbing nella membrana. Nota: Per i passaggi 4.6 - 4.7, comandi software variano a seconda del microscopio e produttore. </li><li> Set para immaginimetri per l&#39;eccitazione di serie GFP (488 nm) ed emissione (500-580 nm). Anche impostare una visualizzazione brillante campo, al fine di visualizzare e orientare l&#39;uovo maturo e olio di sfollati. </li><li> Selezionare la più bassa Z-piano in cui le uova mature sono visibili e impostare un Z-stack completo da prendere per 40 micron a circa 2 micron per passo. Impostare i parametri in modo non vi è alcun ritardo tra l&#39;acquisizione Z-stack. Impostare la serie temporale per catturare per circa 30 min. </li></ol> L&#39;attivazione 5. Imaging Ex Vivo Egg <ol><li> Inizia la cattura delle immagini. </li><li> Attendere 1 - 2 pieni Z-stack da acquisire. Ciò dimostra l&#39;uovo maturo prima dell&#39;attivazione. </li><li> Prelevare circa 300 ml di tampone di attivazione in una pipetta di vetro. </li><li> Posizionamento la punta della pipetta di vetro contenente tampone di attivazione ad un angolo di 45 ° al di sopra del vetrino, spostare lentamente la pipetta nel percorso del raggio fino a quando non si trova direttamente sopra l&#39;uovo maturo viene esposta. La pipetta di vetro dovrebbeessere di 1 - 2 cm sopra l&#39;olio. </li><li> Aggiungere 1 - 2 gocce di tampone di attivazione in meno di 5 secondi dalla pipetta di vetro. Questo dovrebbe sostituire l&#39;olio. Evitare di aggiungere buffer di attivazione eccesso o toccare l&#39;uovo con la pipetta di vetro in quanto può causare lo spostamento della uovo maturo. Fare attenzione a non toccare il vetrino con la pipetta come questo può causare un cambiamento nel piano o bolle d&#39;aria focali per formare in olio di immersione tra l&#39;obiettivo e il vetrino. </li><li> Mentre l&#39;aggiunta di buffer di attivazione durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine, controlla il canale in campo chiaro per garantire che l&#39;olio è stato spostato dal buffer di attivazione. Nota: Innanzitutto, verrà visualizzato come un ombra di pipetta rompendo il percorso del fascio ma anche provocare la comparsa di piccole goccioline di olio. Alcune gocce di olio possono rimanere associati con l&#39;uovo maturo che interesserà i risultati sperimentali e la qualità delle immagini. </li><li> Se l&#39;olio non si sposti dalla aggiunta iniziale di ripetizione buffer di passaggi di attivazione 5.4 - 5.6. </li><li> Una volta che l&#39;olio è spostato con successo, consentire la serie temporale di eseguire fino al completamento. Nota: a causa di gonfiore di ovociti in attivazione, alcuni camere d&#39;uovo si sposteranno drammaticamente fuori del piano focale o campo visivo dopo l&#39;aggiunta di tampone di attivazione. In questa situazione, interrompere l&#39;acquisizione e montare il successivo coprioggetto. </li><li> Dopo la sequenza di immagini è stata completata l&#39;acquisizione, il salvataggio dei dati. </li></ol> 6. post-acquisizione Image Processing <ol><li> Aprire il set di dati tramite Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), o il software di elaborazione delle immagini equivalente, e selezionare i file rilevanti per l&#39;analisi. </li><li> Per costruire una proiezione dei dati acquisiti selezionare: Immagine&gt; Stack&gt; Z-progetto. </li><li> Selezionare un inizio Z-slice e una fermata Z-slice, in genere l&#39;intera sezione. Selezionare un tipo di proiezione, di solito impostato su &#39;Max intensita&#39;. Casella di spunta &#39;All Time Frames&#39; per applicare le impostazioni selezionate per l&#39;intera serie. </li><li> Sepiù di un canale fluorescente è stato ripreso, utilizzare lo strumento dei canali per consentire il movimento tra i colori, fare un composito, o fare la scala di grigio dell&#39;immagine. Seleziona Immagine&gt; Colori&gt; Canali strumento. </li><li> Per regolare la luminosità e il contrasto selezionare Immagine&gt; Regola&gt; Luminosità / Contrasto. </li><li> Per esportare una singola immagine, spostare cursore scala temporale al fotogramma rilevante e selezionare File&gt; Salva con nome&gt; Jpeg, o qualsiasi formato preferito. </li><li> Scegliere una posizione e il titolo per il file esportato, quindi salvare. Nota La frequenza di fotogrammi dal software di imaging sarà tenuto a dare un timestamp sull&#39;immagine. </li><li> Per esportare la serie temporale come un film selezionare: File&gt; Salva con nome&gt; AVI, quindi selezionare il frame rate (~ 7 fotogrammi al secondo). </li><li> Scegliere una posizione e il titolo per il file esportato, quindi salvare. </li><li> Per salvare il file in formato rettificato Fiji, selezionare File&gt; Salva. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

Un cambiamento di Ca 2+ intracellulare di concentramento di uovo (ovocita) di attivazione è un componente conservato di tutti gli organismi studiati 1,2. Questo evento avvia una vasta gamma di Ca 2+ -dipendente processi, compresa ripresa del ciclo cellulare e la traduzione di mRNA memorizzati. A causa di questo requisito di Ca 2+, visualizzando i cambiamenti transitori intracellulare di Ca 2+ concentrazioni è stato di interesse di riferimento. Storicamente, organismi modello sono stati selezionati per lo studio di attivazione uovo in base alle dimensioni e alla disponibilità delle loro uova. Vari approcci di visualizzazione sono stati utilizzati per seguire e quantificare i cambiamenti in intracellulare di Ca 2+ concentrazioni in questi sistemi, tra cui: la aequorina fotoproteina in Medaka pesce 3; Ca 2+ coloranti fluorescenti sensibili come Fura-2 in riccio di mare e criceto 4,5; e calcio verde-1-destrano in Xenopus 6. La generazione e miglioramento degli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS) ha trasformato la capacità di visualizzare Ca 2+ dinamica in vivo 7. Questi costrutti genetici sono espressi in tessuti specifici e limitano la necessità di una preparazione di tessuto invasive 8. GCaMPs sono un verde proteina fluorescente (GFP) classe basata su di GECIS che sono stati molto efficaci a causa della loro elevata Ca 2+ affinità, il rapporto e la capacità di rapporto segnale-rumore per essere personalizzati 9-11. In presenza di Ca 2+, il complesso GCaMP subisce una serie di cambiamenti conformazionali, iniziando con il legame di Ca 2+ a calmodulina, che si traduce in una maggiore intensità fluorescente del componente GFP 9. GCaMPs sono stati ampiamente utilizzati nel campo della ricerca sui neuroni Drosophila di visualizzare cambiamenti nel calcio intracellulare 12. Le appli recentisu tecnologia GCaMP di visualizzare Ca 2+ in uova di Drosophila mature ha rivelato un solo transitorio Ca 2+ onda all&#39;attivazione uovo 13,14. L&#39;onda Ca 2+ può essere visualizzato a basso ingrandimento durante l&#39;ovulazione in vivo 13 o a maggiore ingrandimento utilizzando un test ex vivo di attivazione 13,14. Nel test ex vivo, singoli ovociti maturi sono isolati dalle ovaie e attivate con una soluzione ipotonica, indicati come buffer di attivazione, che ha dimostrato di ricapitolare gli eventi vivo attivazione 15-17. Questo test ex vivo consente una facile visualizzazione ad alta risoluzione del Ca 2+ onda in diverse condizioni sperimentali, tra cui interruzione farmacologica, manipolazioni fisiche e mutanti genetici. Questo articolo illustra la preparazione di uova di Drosophila maturi per ex vivo di attivazione e THe successivamente microscopio usato per visualizzare l&#39;onda Ca 2+ tramite GCaMP. Questo approccio può essere utilizzato per testare l&#39;apertura e controllo dell&#39;onda Ca 2+ e per sondare risultati valle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry active yeast</td>
			<td style="width:373px;">Fleischman&#8217;s</td>
			<td style="width:243px;">#2192</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamp</td>
			<td>Mircotec Fibre optic</td>
			<td>MF0-90</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Medical wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Corporation</td>
			<td>KLEW3020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marker pen</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>841/46</td>
			<td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 pad</td>
			<td>&#160;Genesee Scientific</td>
			<td>59-114 (789060 Dutscher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm</td>
			<td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td>
			<td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;">Halocarbon oil, series 95</td>
			<td rowspan="2">Halocarbon Products Corp.</td>
			<td>Distributor in Europe:</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Solvadis (GMBH)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oil 10 S</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td align="right">24627.188</td>
			<td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass pipette</td>
			<td>Fisherbrand,</td>
			<td>FB50251</td>
			<td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vial</td>
			<td style="width:373px;">Regina Industries</td>
			<td style="width:243px;">P1014</td>
			<td>GPPS&#160; 80mm x 25mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Qui abbiamo dimostrato come preparare le uova di Drosophila mature per l&#39;attivazione ex vivo. Le uova che esprimono un consentirà di imaging GECI di Ca 2+ dinamiche all&#39;attivazione uovo e l&#39;inizio dello sviluppo embrionale (Figura 1). Va notato che in base alla GCaMP utilizzato, in particolare la presenza di un gruppo miristoile, i risultati possono avere leggere differenze qualitative 13 14. Abbiamo anche dimostrato un ruolo per actina funzionale durante l&#39;attivazione uovo con l&#39;aggiunta di un inibitore di polimerizzazione, citocalasina D, al buffer di attivazione (Figura 2) 14. Un requisito per il citoscheletro all&#39;attivazione uovo si conserva. In C. elegans, dopo la fecondazione, i componenti del citoscheletro vengono riorganizzati per preparare l&#39;embrione unicellulare per la prima divisione asimmetrica 21,22. In riccio di mare, interruzione di cytoskeletal riorganizzazione seguente attivazione è mostrato di influenzare il ciclo cellulare, impedendo la formazione dell&#39;anello contrattile 23. Il ruolo di actina nel mediare un&#39;onda di Ca 2+ e la sua funzione a valle di attivazione uovo in Drosophila deve essere ancora pienamente chiarito. In Drosophila, co-visualizzazione del Ca 2+ onda e citoscheletro actina può essere ottenuto da questo test attivazione ex vivo. Serie temporali di più canali possono essere acquisite e dinamica del intracellulare di Ca 2+ può essere abbinato con i cambiamenti nell&#39;organizzazione actina nell&#39;ovocita (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> Figura 1:. A Single Ca 2+ Saluto in serie Drosophila uovo di attivazione Tempo di ex vivo maturo Drosophila uovo esprimere UASt- myrGCaMP5 dopo l&#39;unaddition di tampone di attivazione (AH). L&#39;aumento Ca 2+ citoplasmatico origine al polo posteriore (B) e si propaga (BF) con una velocità media di circa 1,5 micron / sec. Initiation dell&#39;onda è tipicamente osservata entro 3 min della aggiunta di tampone di attivazione. Dopo l&#39;attivazione, i livelli intracellulari di calcio del uovo maturo torna a livelli pre-attivazione (G, H). Vedere film supplementare 1 (tempo totale 33 min). Barre di scala = 50 micron. Proiezione MAX = 40 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> Figura 2: Aggiunta di Citocalasina D per l&#39;attivazione del buffer perturba Ca2+ onda di propagazione. Serie temporali di ex vivo maturo Drosophila uovo esprimere UASt- myrGCaMP5 seguente aggiunta di tampone di attivazione contenente 10 mg / ml citocalasina D concentrazione finale (AH). Mentre il Ca 2+ onda viene avviata al polo posteriore (A), viene compromessa e non raggiunge anteriore dell&#39;uovo (F) (frecce bianche indicano il fronte dell&#39;onda). Nessun ulteriore state osservate Ca 2+ modifiche oltre 30 min). Vedere film supplementare 2 (tempo totale di 30 minuti). Barre di scala = 50 micron. Proiezione MAX = 40 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> Figura 3: Co-visualizzazione di actina e Ca 2+ in EAttivazione gg in serie Drosophila. Tempo di ex vivo maturo Drosophila uovo esprimere UASt- myrGCaMP5 (Ciano) e UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) in seguito all&#39;aggiunta di buffer di attivazione (AH). Il Ca 2+ onda inizia dal polo posteriore e recupera come in figura 1. Actina sembra cambiare nel tempo, frecce bianche (A vs H). La mancanza di rilevamento del segnale Ca 2+ nel centro dell&#39;uovo matura è dovuto al movimento del campione durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. Barre di scala = 50 micron. Proiezione MAX = 40 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Questo articolo descrive un adattabile ex vivo protocollo per la visualizzazione Ca 2+ durante l&#39;attivazione uovo in Drosophila.

Calcio Imaging in<em&gt; Drosophila</em&gt; All&#39;attivazione Egg

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

7.8K Views.  University of Cambridge.  Questo articolo descrive un adattabile ex vivo protocollo per la visualizzazione Ca 2+ durante l'attivazione uovo in Drosophila. 

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-imaging del<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Imaging Upright di<em&gt; Drosophila</em&gt; Chambers Egg

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Imaging Azzerato embrionale e postnatale Cuori a risoluzione di una singola cella

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

I metodi per esaminare le ghiandole linfatiche e ematociti concentrati in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A lungo termine Imaging in diretta di<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

In Vivo Formazione immagine del muscolo-tendine morfogenesi in Drosophila pupe

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Analisi delle dinamiche di Actomyosin su scale cellulari e tissutali locali utilizzando film time-lapse di camere d'uovo di Drosophila coltivate

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging e analisi delle contrazioni muscolari nell'embrione di Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Scongelamento, coltura e Cryopreserving linee di cellule di Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...