Siamo grati a Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya per l&#39;assistenza durante la preparazione di questo manoscritto; Mariana Wolfner per le discussioni su attivazione uovo; Matt Wayland per il supporto delle immagini; e Nan Hu per il supporto generale in laboratorio. Questo lavoro è stato sostenuto dalla University of Cambridge, ISSF a TTW [concessione numero 097.814].

Nota: Eseguire tutte le misure a temperatura ambiente, se non diversamente indicato. 1. Preparazione per la dissezione Nota: I passi qui descritti sono conformi E. Gavi, Princeton University e Weil et. al. 18. Effettuare le seguenti operazioni due giorni prima di imaging. <ol><li> Prendere una fiala mosca contenente circa 10 ml di cibo solido e aggiungere una piccola quantità di lievito secco per un angolo, meno di 1 g è sufficiente. Nota: Per informazioni su fiale mosca o cibo vedere &#39;Drosophila Manutenzione&#39; 19. </li><li> Aggiungere 1 - 3 gocce d&#39;acqua per idratare il lievito. </li><li> Impostare la fiala parte ad un angolo di 45 ° e consentire 3 - 5 min per il lievito per prendere l&#39;acqua. </li><li> Mentre il lievito sta assorbendo l&#39;acqua, scegliere una bottiglia di mosche che esprimono UASt- MYR GCaMP5 20 guidata da vasca-VP16GAL4 (denominato GCaMP5) che hanno recentemente emerse (un myristoymodulo lata del GCaMP5 è stata scelta per fornire un elevato rapporto segnale rumore attraverso legare il GECI alla membrana nell&#39;uovo). </li><li> Anestetizzare le mosche in bottiglia con gas CO 2. Assicurarsi di tenere la bottiglia capovolta in modo da non perdere le mosche nel cibo umido. </li><li> Suggerimento le mosche anestetizzati su un batuffolo di CO 2 e di tipo 10 - 15 femmine e 5 maschi con un pennello sotto un microscopio da dissezione. Nota: E &#39;standard per includere i maschi per fornire le femmine sani per la dissezione. </li><li> Quando la fiala dal punto 1.3 è pronto, aggiungere le mosche selezionati al flaconcino. Fare attenzione a tenere la orizzontale flacone fino a quando le mosche diventano attivi. </li><li> Posizionare il flacone a 25 ° C per circa 36 ore. </li><li> Riportare le restanti mosche dal CO 2 pad per la bottiglia o scarti. </li></ol> 2. dissezione Drosophila ovaie Nota: I passi qui descritti sono conformi Weil et. al. <sup&gt; 18. <ol><li> Dopo 36 ore, anestetizzare le mosche dal flaconcino yeasted con CO 2. </li><li> Una volta che le mosche all&#39;interno della fiala vengono anestetizzati loro punta sul pad CO 2 per essere filtrate con un pennello sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Selezionare una femmina. </li><li> Isolare le due ovaie dalla femmina. Per un pieno protocollo dettagliato vedere Weil et. al. 18. In sintesi: <ol><li> Mettere una piccola goccia di olio Halocarbon ossigenato (serie 95) su un No. 1.5, 22 x 40 mm coprioggetto. </li><li> Afferrare la femmina con una pinza a anterior dell&#39;addome. </li><li> Tenendo la femmina sotto il microscopio da dissezione, utilizzare il secondo set di pinze per rimuovere delicatamente la parte posteriore del femminile. </li><li> Pulire il tessuto posteriore, dalla seconda pinza. </li><li> Premere sulla cavità addominale con la seconda pinza da anteriore a posteriore dell&#39;addome. I due ovaie opache devono attenersi ai forcipe al di fuori della femaLe. </li><li> Toccare le ovaie nell&#39;olio. </li><li> Rimuovere qualsiasi tessuto dalle pinze pulendo fuori le pinze. </li><li> Ripetere questi passaggi (2.4.1 - 2.4.7) per ottenere tre lamelle, ognuna ovaie contenenti da una mosca. </li></ol></li></ol> 3. isolamento individuale uova mature <ol><li> Sotto un microscopio da dissezione di serie con l&#39;ingrandimento impostato 4X, il primo vetrino dal punto 2.4, separare le due ovaie strappando ovidotto. </li><li> Introdurre un paio di pinze chiuse al centro di un singolo ovaio, facendo attenzione a non forare qualsiasi camere d&#39;uovo. </li><li> Inserire una sonda dissezione standard al centro della dell&#39;ovaio accanto alle pinze chiuse. </li><li> trascinare delicatamente la sonda dissezione attraverso l&#39;ovaio verso il polo posteriore, dove si trovano le uova mature (fase 14 camere d&#39;uovo). </li><li> Ripetere i passi 3.1 - 3.4 2 - 5 volte a seconda delle dimensioni delle ovaie e numero di uova. Nota: L&#39;aggiunta di CO 2 </sub&gt; normalmente provoca la deposizione di un singolo uovo che apparirà più grande con appendici dorsali sollevate dalle uova pre-depositato. Questo uovo deve essere eliminata per l&#39;imaging in quanto è già stato attivato all&#39;interno della femmina. Nota: le uova mature sono suscettibili di separare facilmente dal tessuto connettivo ovarico. </li><li> Se non ci sono le uova mature sono visibili al di fuori delle ovaie, continua dolcemente prendere in giro con la sonda dissezione. </li><li> Una volta che le uova mature sono visibili sul vetrino di fuori delle ovaie, manovrare 3 - 5 in una linea al centro del vetrino. Nota: Per ottenere risultati ottimali, eseguire la sonda delicatamente lungo il lato delle uova. Nota: Evitare di tirare su le appendici dorsali come questo può danneggiare l&#39;uovo. Nota: A seconda del futuro di imaging di set-up, allineare le uova di circa 200 micron a parte perpendicolare al vetrino per la massima area di esposizione. </li><li> Una volta allineata, rimuovere il resto del tessuto ovarico trascinandola lontano dalle uova allineate usando l&#39;forceps. </li><li> Rimuovere l&#39;olio in eccesso tamponando con l&#39;angolo di pulire un medico. Fare attenzione a non toccare le uova mature con il medico wipe uova mature che vengono contattati verranno persi. </li><li> Disegnare un mirino sul vetrino con un pennarello per semplificare l&#39;individuazione del campione sotto il microscopio. </li><li> Impostare il vetrino in un luogo sicuro e lasciare le camere di uova preparate sul vetrino di riposare per 5 - 10 minuti. Questo permette l&#39;uovo di stabilirsi nell&#39;olio. I campioni possono essere utilizzati fino a 1 ora dopo la dissezione. </li><li> Ripetere i passaggi 3,1-3,11 per il resto i coprioggetti con ovaie su di loro. </li></ol> 4. Preparazione per l&#39;imaging <ol><li> Portare buffer di attivazione preparati 15 a temperatura ambiente. Nota: tampone attivazione è un buffer ipotonico: 3.3 mM NaH 2 PO 4, 16.6 mM KH 2 PO 4, 10 mM NaCl, 50 mM KCl, 5% di polietilenglicole 8000, 2 mM CaCl 2, portata a pH 6,4 con 1: 5 rapporto di NaOH: KOH.Per ulteriori informazioni, vedere Mahowald 1983 15. Aliquote di buffer di attivazione può essere conservato a -20 ° C per mesi e a 4 ° C fino a 2 settimane. </li><li> trasportare con cura vetrini preparati, buffer di attivazione e pipette di vetro per l&#39;impianto di imaging. Nota: Un grande campo, confocale, disco rotante o microscopio foglio di luce possono essere utilizzati. Si consiglia di utilizzare un microscopio invertito. I nostri risultati rappresentativi sono stati ottenuti utilizzando un microscopio confocale. </li><li> Un obiettivo adatto per l&#39;imaging dell&#39;intero uovo maturo dovrebbe essere scelto (qui: 20X 0.7 NA). </li><li> Montare il primo vetrino preparato sul palco microscopio. Fare attenzione a non rompere i coprioggetti sul palco. </li><li> selezionare Qualitativamente un campo visivo con una camera di uovo maturo per l&#39;attivazione. Non immagine forato camere uovo o con blebbing nella membrana. Nota: Per i passaggi 4.6 - 4.7, comandi software variano a seconda del microscopio e produttore. </li><li> Set para immaginimetri per l&#39;eccitazione di serie GFP (488 nm) ed emissione (500-580 nm). Anche impostare una visualizzazione brillante campo, al fine di visualizzare e orientare l&#39;uovo maturo e olio di sfollati. </li><li> Selezionare la più bassa Z-piano in cui le uova mature sono visibili e impostare un Z-stack completo da prendere per 40 micron a circa 2 micron per passo. Impostare i parametri in modo non vi è alcun ritardo tra l&#39;acquisizione Z-stack. Impostare la serie temporale per catturare per circa 30 min. </li></ol> L&#39;attivazione 5. Imaging Ex Vivo Egg <ol><li> Inizia la cattura delle immagini. </li><li> Attendere 1 - 2 pieni Z-stack da acquisire. Ciò dimostra l&#39;uovo maturo prima dell&#39;attivazione. </li><li> Prelevare circa 300 ml di tampone di attivazione in una pipetta di vetro. </li><li> Posizionamento la punta della pipetta di vetro contenente tampone di attivazione ad un angolo di 45 ° al di sopra del vetrino, spostare lentamente la pipetta nel percorso del raggio fino a quando non si trova direttamente sopra l&#39;uovo maturo viene esposta. La pipetta di vetro dovrebbeessere di 1 - 2 cm sopra l&#39;olio. </li><li> Aggiungere 1 - 2 gocce di tampone di attivazione in meno di 5 secondi dalla pipetta di vetro. Questo dovrebbe sostituire l&#39;olio. Evitare di aggiungere buffer di attivazione eccesso o toccare l&#39;uovo con la pipetta di vetro in quanto può causare lo spostamento della uovo maturo. Fare attenzione a non toccare il vetrino con la pipetta come questo può causare un cambiamento nel piano o bolle d&#39;aria focali per formare in olio di immersione tra l&#39;obiettivo e il vetrino. </li><li> Mentre l&#39;aggiunta di buffer di attivazione durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine, controlla il canale in campo chiaro per garantire che l&#39;olio è stato spostato dal buffer di attivazione. Nota: Innanzitutto, verrà visualizzato come un ombra di pipetta rompendo il percorso del fascio ma anche provocare la comparsa di piccole goccioline di olio. Alcune gocce di olio possono rimanere associati con l&#39;uovo maturo che interesserà i risultati sperimentali e la qualità delle immagini. </li><li> Se l&#39;olio non si sposti dalla aggiunta iniziale di ripetizione buffer di passaggi di attivazione 5.4 - 5.6. </li><li> Una volta che l&#39;olio è spostato con successo, consentire la serie temporale di eseguire fino al completamento. Nota: a causa di gonfiore di ovociti in attivazione, alcuni camere d&#39;uovo si sposteranno drammaticamente fuori del piano focale o campo visivo dopo l&#39;aggiunta di tampone di attivazione. In questa situazione, interrompere l&#39;acquisizione e montare il successivo coprioggetto. </li><li> Dopo la sequenza di immagini è stata completata l&#39;acquisizione, il salvataggio dei dati. </li></ol> 6. post-acquisizione Image Processing <ol><li> Aprire il set di dati tramite Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), o il software di elaborazione delle immagini equivalente, e selezionare i file rilevanti per l&#39;analisi. </li><li> Per costruire una proiezione dei dati acquisiti selezionare: Immagine&gt; Stack&gt; Z-progetto. </li><li> Selezionare un inizio Z-slice e una fermata Z-slice, in genere l&#39;intera sezione. Selezionare un tipo di proiezione, di solito impostato su &#39;Max intensita&#39;. Casella di spunta &#39;All Time Frames&#39; per applicare le impostazioni selezionate per l&#39;intera serie. </li><li> Sepiù di un canale fluorescente è stato ripreso, utilizzare lo strumento dei canali per consentire il movimento tra i colori, fare un composito, o fare la scala di grigio dell&#39;immagine. Seleziona Immagine&gt; Colori&gt; Canali strumento. </li><li> Per regolare la luminosità e il contrasto selezionare Immagine&gt; Regola&gt; Luminosità / Contrasto. </li><li> Per esportare una singola immagine, spostare cursore scala temporale al fotogramma rilevante e selezionare File&gt; Salva con nome&gt; Jpeg, o qualsiasi formato preferito. </li><li> Scegliere una posizione e il titolo per il file esportato, quindi salvare. Nota La frequenza di fotogrammi dal software di imaging sarà tenuto a dare un timestamp sull&#39;immagine. </li><li> Per esportare la serie temporale come un film selezionare: File&gt; Salva con nome&gt; AVI, quindi selezionare il frame rate (~ 7 fotogrammi al secondo). </li><li> Scegliere una posizione e il titolo per il file esportato, quindi salvare. </li><li> Per salvare il file in formato rettificato Fiji, selezionare File&gt; Salva. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

Un cambiamento di Ca 2+ intracellulare di concentramento di uovo (ovocita) di attivazione è un componente conservato di tutti gli organismi studiati 1,2. Questo evento avvia una vasta gamma di Ca 2+ -dipendente processi, compresa ripresa del ciclo cellulare e la traduzione di mRNA memorizzati. A causa di questo requisito di Ca 2+, visualizzando i cambiamenti transitori intracellulare di Ca 2+ concentrazioni è stato di interesse di riferimento. Storicamente, organismi modello sono stati selezionati per lo studio di attivazione uovo in base alle dimensioni e alla disponibilità delle loro uova. Vari approcci di visualizzazione sono stati utilizzati per seguire e quantificare i cambiamenti in intracellulare di Ca 2+ concentrazioni in questi sistemi, tra cui: la aequorina fotoproteina in Medaka pesce 3; Ca 2+ coloranti fluorescenti sensibili come Fura-2 in riccio di mare e criceto 4,5; e calcio verde-1-destrano in Xenopus 6. La generazione e miglioramento degli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS) ha trasformato la capacità di visualizzare Ca 2+ dinamica in vivo 7. Questi costrutti genetici sono espressi in tessuti specifici e limitano la necessità di una preparazione di tessuto invasive 8. GCaMPs sono un verde proteina fluorescente (GFP) classe basata su di GECIS che sono stati molto efficaci a causa della loro elevata Ca 2+ affinità, il rapporto e la capacità di rapporto segnale-rumore per essere personalizzati 9-11. In presenza di Ca 2+, il complesso GCaMP subisce una serie di cambiamenti conformazionali, iniziando con il legame di Ca 2+ a calmodulina, che si traduce in una maggiore intensità fluorescente del componente GFP 9. GCaMPs sono stati ampiamente utilizzati nel campo della ricerca sui neuroni Drosophila di visualizzare cambiamenti nel calcio intracellulare 12. Le appli recentisu tecnologia GCaMP di visualizzare Ca 2+ in uova di Drosophila mature ha rivelato un solo transitorio Ca 2+ onda all&#39;attivazione uovo 13,14. L&#39;onda Ca 2+ può essere visualizzato a basso ingrandimento durante l&#39;ovulazione in vivo 13 o a maggiore ingrandimento utilizzando un test ex vivo di attivazione 13,14. Nel test ex vivo, singoli ovociti maturi sono isolati dalle ovaie e attivate con una soluzione ipotonica, indicati come buffer di attivazione, che ha dimostrato di ricapitolare gli eventi vivo attivazione 15-17. Questo test ex vivo consente una facile visualizzazione ad alta risoluzione del Ca 2+ onda in diverse condizioni sperimentali, tra cui interruzione farmacologica, manipolazioni fisiche e mutanti genetici. Questo articolo illustra la preparazione di uova di Drosophila maturi per ex vivo di attivazione e THe successivamente microscopio usato per visualizzare l&#39;onda Ca 2+ tramite GCaMP. Questo approccio può essere utilizzato per testare l&#39;apertura e controllo dell&#39;onda Ca 2+ e per sondare risultati valle.

<table><tbody><tr><td>Dry active yeast</td><td>Fleischman&amp;rsquo;s</td><td>#2192</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Various will work</td></tr><tr><td>Lamp</td><td>Mircotec Fibre optic</td><td>MF0-90</td><td>Various will work</td></tr><tr><td>Medical wipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>KLEW3020&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marker pen</td><td>Stabilo</td><td>841/46</td><td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; pad</td><td>&amp;nbsp;Genesee Scientific</td><td>59-114 (789060 Dutscher)</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm</td><td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td><td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon oil, series 95</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td>Distributor in Europe:</td><td></td></tr><tr><td>Solvadis (GMBH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oil 10 S</td><td>VWR Chemicals</td><td>24627.188</td><td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td></tr><tr><td>Probe</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td>Fisherbrand,</td><td>FB50251</td><td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vial</td><td>Regina Industries</td><td>P1014</td><td>GPPS&amp;nbsp; 80 mm x 25 mm</td></tr></tbody></table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Qui abbiamo dimostrato come preparare le uova di Drosophila mature per l&#39;attivazione ex vivo. Le uova che esprimono un consentirà di imaging GECI di Ca 2+ dinamiche all&#39;attivazione uovo e l&#39;inizio dello sviluppo embrionale (Figura 1). Va notato che in base alla GCaMP utilizzato, in particolare la presenza di un gruppo miristoile, i risultati possono avere leggere differenze qualitative 13 14. Abbiamo anche dimostrato un ruolo per actina funzionale durante l&#39;attivazione uovo con l&#39;aggiunta di un inibitore di polimerizzazione, citocalasina D, al buffer di attivazione (Figura 2) 14. Un requisito per il citoscheletro all&#39;attivazione uovo si conserva. In C. elegans, dopo la fecondazione, i componenti del citoscheletro vengono riorganizzati per preparare l&#39;embrione unicellulare per la prima divisione asimmetrica 21,22. In riccio di mare, interruzione di cytoskeletal riorganizzazione seguente attivazione è mostrato di influenzare il ciclo cellulare, impedendo la formazione dell&#39;anello contrattile 23. Il ruolo di actina nel mediare un&#39;onda di Ca 2+ e la sua funzione a valle di attivazione uovo in Drosophila deve essere ancora pienamente chiarito. In Drosophila, co-visualizzazione del Ca 2+ onda e citoscheletro actina può essere ottenuto da questo test attivazione ex vivo. Serie temporali di più canali possono essere acquisite e dinamica del intracellulare di Ca 2+ può essere abbinato con i cambiamenti nell&#39;organizzazione actina nell&#39;ovocita (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> Figura 1:. A Single Ca 2+ Saluto in serie Drosophila uovo di attivazione Tempo di ex vivo maturo Drosophila uovo esprimere UASt- myrGCaMP5 dopo l&#39;unaddition di tampone di attivazione (AH). L&#39;aumento Ca 2+ citoplasmatico origine al polo posteriore (B) e si propaga (BF) con una velocità media di circa 1,5 micron / sec. Initiation dell&#39;onda è tipicamente osservata entro 3 min della aggiunta di tampone di attivazione. Dopo l&#39;attivazione, i livelli intracellulari di calcio del uovo maturo torna a livelli pre-attivazione (G, H). Vedere film supplementare 1 (tempo totale 33 min). Barre di scala = 50 micron. Proiezione MAX = 40 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> Figura 2: Aggiunta di Citocalasina D per l&#39;attivazione del buffer perturba Ca2+ onda di propagazione. Serie temporali di ex vivo maturo Drosophila uovo esprimere UASt- myrGCaMP5 seguente aggiunta di tampone di attivazione contenente 10 mg / ml citocalasina D concentrazione finale (AH). Mentre il Ca 2+ onda viene avviata al polo posteriore (A), viene compromessa e non raggiunge anteriore dell&#39;uovo (F) (frecce bianche indicano il fronte dell&#39;onda). Nessun ulteriore state osservate Ca 2+ modifiche oltre 30 min). Vedere film supplementare 2 (tempo totale di 30 minuti). Barre di scala = 50 micron. Proiezione MAX = 40 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> Figura 3: Co-visualizzazione di actina e Ca 2+ in EAttivazione gg in serie Drosophila. Tempo di ex vivo maturo Drosophila uovo esprimere UASt- myrGCaMP5 (Ciano) e UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) in seguito all&#39;aggiunta di buffer di attivazione (AH). Il Ca 2+ onda inizia dal polo posteriore e recupera come in figura 1. Actina sembra cambiare nel tempo, frecce bianche (A vs H). La mancanza di rilevamento del segnale Ca 2+ nel centro dell&#39;uovo matura è dovuto al movimento del campione durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. Barre di scala = 50 micron. Proiezione MAX = 40 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Questo articolo descrive un adattabile ex vivo protocollo per la visualizzazione Ca 2+ durante l&#39;attivazione uovo in Drosophila.

Calcio Imaging in<em&gt; Drosophila</em&gt; All&#39;attivazione Egg

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

7.8K Views.  University of Cambridge.  Questo articolo descrive un adattabile ex vivo protocollo per la visualizzazione Ca 2+ durante l'attivazione uovo in Drosophila. 

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Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Imaging Upright di<em&gt; Drosophila</em&gt; Chambers Egg

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Neuroscienze

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and apoptosis, development and ageing, to neuronal synaptic plasticity and regeneration have been associated with Ryanodine receptors (RyRs). Despite the importance of calcium signaling, the exact mechanism of its function in early development is unclear. As an organism with a short gestational period, the embryos of Drosophila melanogaster are prime study subjects for investigating the distribution and localization of CICR associated proteins and their regulators during development. However, because of their lipid-rich embryos and chitin-rich chorion, their utility is limited by the difficulty of mounting embryos on glass surfaces. In this work, we introduce a practical protocol that significantly enhances the attachment of Drosophila embryo onto slides and detail methods for successful histochemistry, immunohistochemistry, and in-situ hybridization. The chrome alum gelatin slide-coating method and embryo pre-embedding method dramatically increases the yield in studying Drosophila embryo protein and RNA expression. To demonstrate this approach, we studied DmFKBP12/Calstabin, a well-known regulator of RyR during early embryonic development of Drosophila melanogaster. We identified DmFKBP12 in as early as the syncytial blastoderm stage and report the dynamic expression pattern of DmFKBP12 during development: initially as an evenly distributed protein in the syncytial blastoderm, then preliminarily localizing to the basement layer of the cortex during cellular blastoderm, before distributing in the primitive neuronal and digestion architecture during the three-gem layer phase in early gastrulation. This distribution may explain the critical role RyR plays in the vital organ systems that originate in from these layers: the suboesophageal and supraesophageal ganglion, ventral nervous system, and musculoskeletal system.

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Here, we describe a protocol for detection and localization of Drosophila embryo protein and RNA from collection to pre-embedding and embedding, immunostaining, and mRNA in situ hybridization.

Un protocollo per l'immunoistochimica e la distribuzione dell'RNA in situ all'interno dell'embrione di drosofila precoce

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Monitoraggio del calcio nelle prime fasi di sviluppo di C. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualizzazione in vivo dei transitori di calcio durante la fecondazione e lo sviluppo precoce in C. elegans

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

Visualizzazione in vivo dei transitori di calcio durante la fecondazione e lo sviluppo precoce in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex Vivo Calcio Imaging per visualizzare le risposte del cervello alla segnalazione endocrina in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

In Vivo Optical Calcium Imaging della plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Monitoraggio degli eventi epilettiformi in Drosophila tramite imaging del calcio

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

Autore in primo piano: approfondimenti sulle tecniche e sui risultati dei recenti progressi nella ricerca sull'epilessia 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

Calcio Imaging in

Riepilogo

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Visualizzazione in vivo dei transitori di calcio durante la fecondazione e lo sviluppo precoce in C. elegans

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Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila

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