Ringraziamo M. Douglas Benson per le prime conversazioni riguardanti l&#39;imaging secondario del palato. Riconosciamo anche David Castaneda-Castellanos (Leica) e Chris Rieken (Zeiss) per il loro aiuto per regolare le condizioni di imaging in microscopia confocale. Apprezziamo Lynsey Hamilton (Bitplane) per suggerimenti utili per l&#39;analisi quantitativa di immagini utilizzando il software Imaris. Questo lavoro è stato finanziato da NIH / NIDCR R01 DE025887.

Tutti gli esperimenti su animali sono stati eseguiti in conformità ai protocolli dell&#39;Università della California a San Francisco, istituto di cura e uso degli animali. 1. Preparazione di Media Live Imaging <ol><li> Preparazione di supporti di coltura liquida <ol><li> Aggiungere 20% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U / mL penicillina, 100 μg / mL streptomicina, 200 μg / mL acido L-ascorbico, 15 mM HEPES a Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 media. NOTA: Il supporto di imaging live è stato appena fatto prima dell&#39;immagine. Questo supporto contiene fenolo-rosso che può portare alla fototossicità lungo i corsi di imaging in tempo reale. Sostituendo per i media senza fenolo-rosso può migliorare l&#39;imaging a lungo termine. </li></ol></li><li> Preparazione della soluzione di agarosio a bassa fusione <ol><li> Sciogliere 350 mg di agarosio a basso contenuto di fusione in 10 ml di acqua distillata autoclavata per ottenere una soluzione di riserva del 3,5%. </li><li> Mescolare bene la soluzione agarosica e incubare a 70 ° C in un bagno d&#39;acqua per sciogliere completamente l&#39;agarosio. </li><li> Riscaldare la soluzione agarosica in un bagno d&#39;acqua di 37 ° C prima di aggiungerlo al supporto di imaging in diretta. </li><li> Aggiungere 1 ml della soluzione di stock di agarosio a 5 ml del mezzo di imaging vivente liquido per ottenere una concentrazione finale (0,6%). </li><li> Conservare i supporti con agarosio in un bagno d&#39;acqua di 37 ° C per prevenire la solidificazione prematura. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione della cultura esplosiva del palato per l&#39;imaging live <ol><li> Dissezione degli scaffali palatali secondari E14.5 recentemente aderiti NOTA: nella nostra esperienza la fusione di immagini richiede l&#39;avvio con una coppia leggermente aderita di mensole palatine; Questa aderenza evita movimenti esplosivi che impediscono la fusione durante la formazione dell&#39;immagine. <ol><li> Dissectare gli embrioni di stadio E14.5 in una soluzione salina con tampone fosfato (PBS) e scegliere la proteina fluorescente verde (GFP) - esprimere (daK14-cre; ROSA26-mTmG flox ) o (Red fluorescente proteina) RFP- express (da Lifeact-mRFPruby ) embrioni positivi usando un microscopio di dissezione dotato di lampade fluorescenti. Trasferire il tessuto in un materiale pre-riscaldato di coltura in vivo senza agarosio. </li><li> Tagliare la testa dell&#39;embrione e rimuovere l&#39;area superiore del cervello usando due pinze fine n. 5 ( Figura 1 A-C ). Usare una pinza n. 5 per tenere l&#39;embrione mentre l&#39;altro n. 5 pende per tagliare i tessuti extra fuori dagli scaffali palatari. NOTA: Le forbici raffinate possono essere usate per tagliare la testa dell&#39;embrione (il primo passo) anziché una pinza No. 5. Tuttavia, due pinze fine No. 5 daranno un migliore controllo per eseguire tagli precisi. </li><li> Rimuovere la mandibola attentamente senza danneggiare mensole palatali come mostrato in Figura 1 D e 1E . Per ridurre la possibilità di danneggiare i palati, mantenere la lingua attraverso la dissezione della mandibola, fDopo aver attentamente rimosso la lingua. </li><li> Dopo aver rimosso la mandibola e la lingua, esaminare il lato orale del palato secondario con uno stereomicroscopio con fluorescenza per confermare il forte segnale reporter nel MES ( Figura 1 M ). </li><li> Disseccare le parti posteriori, tra cui l&#39;indice e lo stelo del cervello dopo aver rimosso la mandibola e la lingua ( Figura 1 F ). </li><li> Rimuovere entrambi i maxilla con mensole palatine aderenti ( Figura 1 G ). </li><li> Tagliare il tessuto anteriore superiore della ganascia mantenendo intatte sia il palato primario che quello secondario ( Figura 1 H e I ). </li><li> Rimuovere il setto nasale sul lato nasale dell&#39;esplosione esponendo la MES. NOTA: Queste ultime fasi di dissezione richiedono un&#39;attenta attenzione per non disturbare i contatti tra due ripiani secondari palatali. La rimozione del setto nasale aiutaRidurre il segnale di sfondo da altre aree e ridurre anche il movimento verticale dei tessuti, consentendo immagini stabili ( Figura 1 J-L ). </li><li> Dopo aver disseccato gli scaffali palatali, esaminare nuovamente il segnale del reporter della linea mediana per assicurarsi che non vi siano danni allo strato epiteliale tra i tessuti. </li></ol></li><li> Impostazione di esplanti del palato nel piatto di coltura con supporti di imaging live <ol><li> Mettete i supporti di imaging in diretta in un piatto di fondo in vetro da 35 mm. </li><li> Mettete le mensole palatali scoperte rivolte verso il basso come vicino al fondo del vetro, per quanto possibile per l&#39;imaging con un microscopio confocale invertito ( Figura 1 N ). </li><li> Posizionare i pellets di ghiaccio secco su una superficie conduttiva vicina al piatto di coltura per accelerare la solidificazione agarosa diminuendo rapidamente la temperatura o mettere il piatto di coltura a 4 ° C. Una piastra fredda, come quella utilizzata per l&#39;inserimento di paraffina, potrebbe anche essere utilizzata a questo stage. NOTA: quando si utilizza ghiaccio secco, il cambiamento di agarosio deve essere monitorato con attenzione per evitare il congelamento. </li></ol></li></ol> 3. Confocal Time-lapse Imaging di Palate Explant <ol><li> Imaging e acquisizione dati <ol><li> Dopo che l&#39;agarosio è stato semi-solidificato, montare il piatto di coltura in un microscopio confocale invertito dotato di camera di incubazione a 37 ° C. Utilizzare un microscopio confocale a luce bianca e un microscopio confocale a spinning del disco di osservazione delle cellule. NOTA: Abbiamo utilizzato un supporto modificato contenente 15 mM HEPES senza gas CO 2 . </li><li> Mettere la gelatina di petrolio tra il piatto di coltura e la copertura usando una siringa per evitare l&#39;evaporazione dei supporti ( Figura 1 N ). NOTA: Alcune condensazioni in cima alla copertura del piatto di coltura dopo la coltura durante la notte (O / N) si verificano ma il volume dei supporti non cambia, suggerendo che la gelatina di petrolio evita che i media si evaporino. </li><li> Individuare la regione di interesse con obiettivi di ingrandimento ridotti (10x) e utilizzare obiettivi di ingrandimento più elevati (obiettivo 20x con zoom digitale 3x o obiettivo 40x con Immersol W) per l&#39;imaging in tempo reale. NOTA: I ripiani secondari secchi secondari non sono piatti. Il palato secondario è una struttura curva e questo rende difficile l&#39;immagine dell&#39;intera MES nello stesso piano. L&#39;imaging a basso ingrandimento (10x) può consentire l&#39;imaging completo del palato, ma gli obiettivi 40x forniranno una migliore risoluzione delle immagini per esaminare movimenti cellulari dettagliati in posizioni più profonde Z. La curvatura è alta nella regione del palato medio. Il palato anteriore e posteriore sono relativamente piatti rispetto al palato medio. Spesso immaginiamo verso la metà anteriore del palato secondario per evitare regioni di massima curvatura. </li><li> Scansiona più stack Z con 5 μm ogni passo per 16-24 ore usando una giusta eccitazione laser (488 nm per GFP e 532/561 nm per RFP) ( Figura 2 ). NOTA: Per ridurre la fototossicità potenziale, utilizzare il minimo potere laser e il tempo di esposizione. Ciò è importante soprattutto in caso di imaging multicolore. Utilizza il 22% del 552 nm di potenza laser per la membranaTomato (mT), il 30% della potenza laser di 495 nm per la membranaGFP (mG) e il 25% della potenza laser 561 nm per la membranaRFP. Il tempo medio di esposizione era di 550 ms. </li><li> Utilizzare il software di analisi delle immagini per eseguire il monitoraggio delle celle e l&#39;analisi quantitativa. </li></ol></li></ol> 4. Analisi delle immagini dei dati NOTA: qui, è stato usato Imaris. Analisi analoghe di dati possono anche essere eseguite con pacchetti software ImageJ o Volocity. <ol><li> Rendering di superfici tridimensionali (3D) dalle sequenze di immagini. NOTA: Questa sezione consente di generare una superficie da un filmato generato con un segnale GFP a membrana. <ol><li> Fai clic su Modifica | Mostra la regolazione del display e utilizzare il cursore di istogramma per regolare l&#39;intensità del segnale in modo che il segnale della membrana sia chiaroFuori la lunghezza del film ( Figura 3 A ). </li><li> Correggere il segnale sbiancato utilizzando l&#39;immagine Lavorazione | Correzione di attenuazione . Regolare i valori di Intensità anteriore e Intensità in modo che il segnale della membrana sia chiaro per tutta la lunghezza del filmato. Alcuni tentativi ed errori potrebbero essere necessari per l&#39;impostazione di questi valori. NOTA: Il valore di Intensità Indietro (profondità Z) sarà inferiore al valore dell&#39;intensità del fronte (valore della superficie Z) a causa della limitata penetrazione del laser. Questi valori possono quindi essere modificati anche per normalizzare l&#39;intensità del segnale nella serie Z. Entrambi i valori possono essere regolati per ottenere la correzione della candeggina. La correzione dell&#39;attenuazione è anche chiamata correzione dell&#39;attenuazione delle emissioni 19 . </li><li> Per generare una superficie dal segnale della membrana, selezionare Surpass | Superfici , scegli un canale di origine e un tipo di soglia (intensità assoluta) e sotto le impostazioni di algoritmolect Segmentare solo una Regione di Interesse E infine il processo dell&#39;intera immagine , seguito dalla scorrimento della freccia in avanti; Continuare a spingere la freccia in avanti (utilizzare le impostazioni predefinite o specificare i livelli di dettaglio della superficie di superficie e il metodo di soglia di soglia per prova ed errore), verificando se la superficie generata rifletta il segnale di fluorescenza. Per specificare una regione di interesse, selezionare la regione e le ore da rendere tratteggiando le posizioni X, Y, Z. NOTA: selezionare Processo dell&#39;intera immagine finalmente in modo che le regolazioni e le soglie saranno applicate in tutto il filmato. </li><li> Creare una superficie facendo clic nuovamente sul pulsante freccia in avanti. Quindi regolare la soglia cambiando l&#39;istogramma in Filtri per corrispondere al segnale della membrana. </li><li> Dopo la generazione della superficie, scegliere la superficie in Superfici / Impostazioni per visualizzare il segnale di superficie e completare il processo di generazione della superficie spingendo il doppio forwPulsante freccia ARD ( Figura 3 B ). </li><li> Vai a Surface | Modificare e fare clic su Maschera tutte le Proprietà maschera per generare un&#39;immagine di canale mascherata. </li><li> Dopo aver fatto clic su OK, la finestra Maschera si apre automaticamente; Selezionare il canale GFP, impostare voxels al di fuori della superficie al valore massimo di intensità del segnale (trovato nella regolazione Edit | Display ) e voxels all&#39;interno della superficie al valore minimo di intensità GFP Modifica | Regolazione della visualizzazione ), in Impostazioni maschera per generare una maschera del segnale a membrana. </li><li> Poiché la maschera del segnale della membrana verrà visualizzata in visualizzazione Volume , generare immagini invertite usando Image Processing | Contrasto cambiamento Inverti ( Figura 3 C ). </li></ol></li><li> Individuazione di macchie da immagini in superficie invertita. NOTA: questa sezione consente di avere il centro di ciascuna cellaContrassegnato da un punto unico e tracciato nello spazio e nel tempo. <ol><li> Seleziona Scena superamento. | Spots | Crea ; In Impostazioni di algoritmo selezionare il segmento solo una regione di interesse , il processo dell&#39;intera immagine in ultima analisi e le tracce di punti (nel tempo) . </li><li> Fare clic sulla freccia in avanti e specificare una Regione di interesse; Selezionare la regione e le ore per la traccia delle macchie; Continuare a spingere la freccia in avanti, scegliere il canale mascherato come canale di origine e determinare il diametro stimato di punti XY. </li><li> Facendo clic sul pulsante freccia in avanti si apre automaticamente una finestra del filtro; Regolare la soglia di rilevamento del puntatore modificando i valori nell&#39;istogramma per generare punti singoli al centro di ciascuna cella ( Figura 3 D ). </li><li> Facendo clic sul pulsante freccia in avanti si apre la finestra Algoritmo , scegliete il modello di monitoraggio del movimento autoregressivo 20 e specificate il massimo tracking diPosizione e la dimensione massima del gap per collegare tracce che divengono discontinue per un breve periodo di tempo. </li><li> Facendo nuovamente clic sul pulsante freccia in avanti si apre la finestra Filtri, imposta la soglia di durata della traccia regolando l&#39;istogramma in modo che ogni cella venga tracciata. Facendo clic sul pulsante a doppia freccia avanti, verrà finalizzato il rilevamento del punto. </li><li> Per correggere la deriva del tessuto, fare clic su Spots | Track Editor e selezionare Corretto Drift . Una finestra di algoritmo si apre automaticamente; Selezionare la deriva di transizione selezionata , Includi intero risultato e Correggere le posizioni degli oggetti . </li></ol></li><li> Generazione di diagrammi per analisi quantitativa. NOTA: Lo Scatterplot del programma è uno strumento per generare grafici multidimensionali (X, Y, Z, Color e Scala) con più oggetti. Queste trame sono utili per visualizzare le tendenze di molti movimenti di cellule nel tempo. <ol><li> Rendere 2D o 3D le tracce dei dati di tracciamento delle celle usando il comandoVantage-Aggiungi nuovo menu di trama Vantage ( Figura 3 E e 3F ). </li><li> Seleziona Volume o Spots e scegli Crea / Categoria e Plot Type </li><li> Regolare i valori di trama per generare diversi grafici Vantage. </li><li> Esportare i grafici utilizzando la funzione Snapshot . NOTA: i dati statistici possono anche essere esportati come fogli di calcolo per ulteriori analisi quantitativa facendo clic su Plot Numbers Area | Salva . </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

L&#39;imaging in tempo reale della morfogenesi tissutale con la cultura dell&#39;esplosivo dell&#39;organo 3D può fornire informazioni dettagliate sui processi cellulari che non possono essere mostrati in analisi convenzionali di colorazione delle sezioni dei tessuti fissi. Utilizzando la cultura esplante in vitro del palato secondario embrionale del mouse, abbiamo osservato diversi comportamenti cellulari interessanti che ci hanno portato a proporre un nuovo meccanismo di fusione di palato che coinvolge la co...

La fusione tissutale è un passo importante nello sviluppo di organi multipli. I principali difetti della nascita umana, quali il labbro e il palato, la bifida delle spine e le malformazioni del cuore possono derivare da difetti nella fusione tissutale 1 . La fusione del palato secondario del mouse è stata ampiamente studiata per identificare i meccanismi cellulari e molecolari che controllano la fusione tissutale nello sviluppo 2 , 3 , 4 . Nel topo, lo sviluppo del palato secondario inizia a circa E11.5 con l&#39;espansione di un ripiano secondario palatale da ognuno dei processi bilaterali maxillari. La crescita iniziale degli scaffali palatali si verifica verticalmente lungo la lingua, fino a circa l&#39;E14.0, durante i quali gli scaffali palatari si elevano orizzontalmente sopra la lingua. La crescita medialmente diretta produce un contatto fisico tra l&#39;epiteli apposita dei due ripiani palatari, formando l&#39;epitelio della medianaAl seam (MES) a E14.5. Il MES interveniente deve essere rimosso tra gli scaffali palatali secondari per consentire la confluenza mesenchimale e lo sviluppo di un palato secondario intatto, completamente fuso, da E15.5 3 . Come uno strato di cellule MES epiteliale condiviso tra due mensole palatine separate e poi rimosso per ottenere confluenza mesenchimale, è stata una questione centrale nello sviluppo del palato. Sulla base di studi sul microscopio istologico e elettronico del microscopio (EM), sugli studi sulla cultura esplosiva e sugli esperimenti funzionali di genetica del mouse, sono stati implicati diversi comportamenti di cellule fondamentali in questo processo. Le proiezioni simili a filopodie dall&#39;epitelio mediale del bordo MEE di ogni mensola palatina facilitano il contatto iniziale 5 , 6 , seguito da intercalazione di queste cellule epiteliali a un singolo MES 6 , 7 condiviso. Rimozione della conseguente MES condivisaÈ stato proposto di procedere con tre meccanismi non esclusivi. Gli studi iniziali che impiegavano osservazioni istologiche e tracciamento lineare ex vivo con coloranti vitali indicavano che la MES potrebbe essere rimossa dall&#39;epitelio alla transizione mesenchimale (EMT) delle cellule MES 8 , 9 , anche se più recentemente il tracciamento genetico delle cellule epiteliali ha aumentato l&#39;incertezza Il contributo a lungo termine delle cellule epiteliali al mesenchimico palatale 10 , 11 , 12 . Un numero significativo di cellule apoptotiche e una riduzione del loro numero in alcuni mutanti che non subiscono una corretta fusione di palato hanno portato all&#39;idea che l&#39;apoptosi può essere un fattore importante della dissoluzione MES 2 , 3 . Infine, basata inizialmente su studi che coinvolgono l&#39;etichettatura epiteliale e l&#39;osservazione statica a tempi progressivi, le cellule MESSono stati proposti di migrare nelle dimensioni oronasali e anteroposterior 11 , 13 , ma tali comportamenti dinamici di cellule sono stati inizialmente non confermati a causa di una incapacità di osservarli nel tessuto palatale vivo. Recentemente siamo stati in grado di osservare direttamente questi comportamenti sviluppando una nuova metodologia di imaging dal vivo che combina i metodi genetici del mouse con l&#39;etichettatura fluorescente con l&#39;imaging live in confocale di scaffali palatali esplorati. In primo luogo, per visualizzare i comportamenti cellulari dinamici nelle cellule epiteliali del palato durante la fusione del palato, abbiamo generato un mouse reporter specifico epiteliale attraversando i topi flox ROSA26-mTmG con i topi Keratin 14 -cre 14 , 15 . L&#39;imaging in diretta confocale della cultura esplante del palato degli embrioni risultanti ha confermato alcuni comportamenti cellulari proposti in precedenza e ha identificato nuovi eventi nel processo di fusione 6 </sup&gt;. Le protuberanze della membrana delle cellule epiteliali hanno preceduto il contatto cellulare iniziale seguito da convergenza epiteliale mediante intercalazione delle cellule e spostamento delle cellule oronasali. Notevolmente, abbiamo anche scoperto che l&#39;estrusione cellulare, un processo segnalato per svolgere ruoli importanti nell&#39;omeostasi epiteliale, è stato un meccanismo importante che porta la fusione dei palati secondari del mouse 6 , 16 . Questo metodo di imaging può essere utilizzato con altre linee di reporter; Abbiamo utilizzato i topi transgenici Lifeact-mRFPruby 17 , 18 per esaminare le dinamiche citoscheletriche dell&#39;atina durante il processo di fusione. Altri giornalisti possono anche essere impiegati per osservare altri aspetti specifici della fusione di palato e questo metodo può essere adattato sia alla microscopia confocale a scansione laser che alla microscopia confocale del disco di filatura, a seconda delle esigenze di imaging e della disponibilità del microscopio. L&#39;imaging in diretta sta diventando sempre più un approccio fondamentale nella biologia dello sviluppo. PartiLa morfogenesi craniofacialica è complessa e le difese di nascita umane che colpiscono il viso sono comuni. Questo metodo di imaging live in confocale aiuterà a consentire una migliore comprensione dei meccanismi fondamentali di sviluppo fondamentali e delle origini delle anomalie craniofacciali umane.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1193">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Reagents</td>
			<td style="width:360px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pennicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Low melting agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3111-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Petrolieum Jelly (Vaseline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16415-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Keratin14-cre</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:65294</td>
			<td>Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ROSA26mTmG</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:124702</td>
			<td>Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lifeact-mRFPruby</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:164274</td>
			<td>Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">White Light SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell Observer spinning disk confocal microscope</td>
			<td>Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of mouse secondary palate fusion

La fusione degli scaffali palatali secondari per formare il palato secondario intatto è un processo chiave nello sviluppo mammifero e la sua rottura può portare a palato secondario, una comune anomalia congenita negli esseri umani. La fusione secondaria del palato è stata ampiamente studiata portando a diversi meccanismi cellulari proposti che possono mediare questo processo. Tuttavia, questi studi sono stati eseguiti principalmente su tessuti embrionali fissi a tempi progressivi durante lo sviluppo o in colture fisse esplorate analizzate a tempi statici. L&#39;analisi statica è limitata per l&#39;analisi di processi morfogenetici dinamici come una fusione di palato e quali tipi di comportamenti cellulari dinamici mediare la fusione palatale è incompleta. Qui si descrive un protocollo per l&#39;imaging dal vivo di ex vivo fusione palato secondario in embrioni di topo. Per esaminare i comportamenti cellulari della fusione del palato, la chirurgia Keratin14 specifica epiteliale è stata usata per etichettare le cellule epiteliali del palato in ROSEmbrioni A26-mTmG flox reporter. Per visualizzare l&#39;actina filamentosa, sono stati utilizzati topi reattore Lifeact-mRFPruby . L&#39;imaging in vivo di fusione secondaria del palato è stato eseguito dissezionando i ripiani secondari palatali recentemente aderiti di embrioni di fase di embrione (E) 14.5 e coltivando in supporti contenenti agarosio su un piatto di fondo in vetro per consentire l&#39;imaging con un microscopio confocale invertito. Utilizzando questo metodo, abbiamo rilevato una varietà di nuovi comportamenti cellulari durante la fusione secondaria del palato. Un apprezzamento di come i comportamenti cellulari distinti sono coordinati nello spazio e nel tempo contribuiscono notevolmente alla nostra comprensione di questo processo morfogenetico dinamico. Questo protocollo può essere applicato alle linee del topo mutante o alle colture trattate con inibitori farmacologici per migliorare ulteriormente la comprensione di come viene controllata la fusione secondaria del palato.

L&#39;imaging in vivo della cultura esplante del palato ha rivelato molteplici processi cellulari che mediano la fusione dei palati 6 . I contatti iniziali tra due cellule epiteliali sono fatti da protuberanze a membrana ( Figura 2 B-2E ). Quando due strati epiteliali si incontrano, formano una MES stratificata a più cellule seguita da intercalazione per creare un unico MES a livello cellulare integrato attraverso la...

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Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Qui presentiamo un protocollo per l&#39;imaging in diretta di fusione secondaria del palato del mouse usando la microscopia confocale. Questo protocollo può essere utilizzato in combinazione con una varietà di linee fluorescenti del mouse del reporter, e con inibitori del percorso per l&#39;intuizione meccanica. Questo protocollo può essere adattato all&#39;immagine dal vivo in altri sistemi di sviluppo.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

live-imaging-of-mouse-secondary-palate-fusion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K Views.  University of California San Francisco.  Qui presentiamo un protocollo per l'imaging in diretta di fusione secondaria del palato del mouse usando la microscopia confocale. Questo protocollo può essere utilizzato in combinazione con una varietà di linee fluorescenti del mouse del reporter, e con inibitori del percorso per l'intuizione meccanica. Questo protocollo può essere adattato all'immagine dal vivo in altri sistemi di sviluppo. 

Video: Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-imaging del<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

La differenziazione in vitro di miofibre mature per Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Vivere Confocale Imaging di sviluppare Arabidopsis Fiori

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A lungo termine Imaging in diretta di<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioingegneria dei microrganismi del midollo osseo umano nel mouse e la loro visualizzazione mediante imaging live

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Coltivazione dell'ovulo per Live cell Imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Live Cell Imaging della segregazione cromosomica durante la mitosi

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging e analisi delle contrazioni muscolari nell'embrione di Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Casting vascolare di polmoni di mouse postnatali adulti e precoci per l'imaging Micro-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Dissezione e Live-Imaging della Drosophila Gonad embrionale tardiva

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...