I bioreattori, noti anche come fermentatori, sono sistemi di coltura cellulare che forniscono ambienti di crescita adatti. Due tipi di bioreattori sono comunemente usati nelle colture cellulari, nei bioreattori a batch e in continuo agitato. Un reattore batch è un sistema a recipiente chiuso contenente tutti i componenti necessari per la coltura cellulare, mentre un reattore a serbatoio agitato continuo è un sistema aperto in cui i componenti fluiscono attivamente dentro e fuori, consentendo la rimozione dei rifiuti e il rifornimento di sostanze nutritive. Per massimizzare la crescita e la densità delle celle, è possibile controllare più parametri del reattore per entrambi i sistemi, tra cui temperatura, pressione, ossigeno disciolto e pH. Questo video introdurrà i principi fondamentali alla base dei reattori batch e continui e dimostrerà una procedura che ne dettaglia l'uso in laboratorio.
Il tipo più semplice di bioreattore è il reattore batch, che è un sistema chiuso contenente mezzi di coltura cellulare e una popolazione di cellule. Man mano che le cellule crescono, consumano i nutrienti ed espellono i rifiuti, che si accumulano nella nave. Vengono utilizzati anche reattori a serbatoio agitato continuo, che sono sistemi aperti in cui i nutrienti fluiscono continuamente e le cellule e i rifiuti cellulari fuoriescono. Ciò consente il controllo della densità cellulare attraverso la rimozione dei rifiuti e il reintegro dei nutrienti. Prima dell'uso di entrambi i sistemi, i componenti vengono sterilizzati, di solito utilizzando vapore per mitigare la contaminazione. Quando il reattore è completamente assemblato, il mezzo di coltura sterile viene aggiunto al recipiente principale e quindi inoculato con una coltura di avviamento. Durante l'uso, la miscelazione e l'ossigenazione sono controllate con l'uso di giranti per mantenere una soluzione omogenea in cui le cellule vengono fornite con quantità sufficienti di nutrienti e ossigeno necessari per la crescita. Inoltre, i sistemi di serbatoi dei fermenti sono spesso dotati di sonde per misurare condizioni come temperatura, ossigeno disciolto e pH per garantire condizioni ottimali per la crescita. Durante la crescita del lotto, la popolazione cellulare subisce le fasi di crescita classiche. In primo luogo, le cellule entrano nella fase di ritardo, in cui le cellule crescono lentamente mentre si adattano al loro ambiente. Successivamente, le cellule entrano nella fase di log e si dividono a un ritmo esponenziale fino a quando i nutrienti non sono esauriti o i sottoprodotti tossici raggiungono un livello critico. Alla fine, la crescita rallenta e le cellule raggiungono la fase stazionaria che offre l'opportunità di raccogliere il prodotto di interesse dalla coltura. Il prodotto viene secreto dalle cellule e raccolto direttamente dal brodo di coltura, oppure il prodotto rimane nella cellula e deve essere rimosso tramite lisi cellulare. Dopo la raccolta, il reattore viene preparato per un nuovo lotto di coltura cellulare mediante pulizia e sterilizzazione.
I reattori a serbatoio agitato continuo mostrano inizialmente modelli di crescita simili e raggiungono una densità di cella costante al funzionamento allo stato stazionario. Tuttavia, questa densità di cella dipende dalla velocità di diluizione, che è la velocità di alimentazione e di effluente divisa per il volume del reattore. Pertanto, quando il tasso di diluizione si avvicina a uno, la densità cellulare diminuisce. Quando si considerano le configurazioni dei bioreattori, è utile tenere presente che i reattori batch vengono spesso utilizzati a causa della loro semplicità e del basso costo, sebbene la densità delle celle sia limitata. I reattori continui sono in grado di aumentare la densità delle celle. Tuttavia, ad alte densità cellulari può verificarsi l'aggregazione, impedendo una crescita ottimale. Inoltre, periodi di fermentazione più lunghi possono aumentare il rischio di contaminazione della coltura.
Ora che abbiamo introdotto i reattori batch e continui, esaminiamo una procedura per entrambi, a partire dal reattore batch. Prima dell'uso del reattore batch, i mezzi cellulari vengono aggiunti a un recipiente di reazione pulito. Una volta riempiti, i componenti del recipiente vengono risciacquati con acqua deionizzata e assemblati. I componenti includono la piastra di testa, il tubo di raccolta per il campionamento della coltura, una girante per mantenere l'uniformità della coltura e l'ossigenazione dei mezzi e lo sparger di gas per fornire l'infusione di gas alla coltura. L'assemblaggio continua con l'installazione di una sonda di ossigenazione per misurare il contenuto di ossigeno disciolto nel recipiente, linee di alimentazione per l'aggiunta di acido o base per controllare il pH e una sonda di pH calibrata. Quando tutti i componenti sono installati, il reattore assemblato viene sterilizzato utilizzando un'autoclave. Il recipiente viene quindi installato nella base del fermentatore, dove sia la sonda di pH che la sonda di ossigeno sono collegate al computer. Inoltre, lo sparger di gas è collegato a un rotametro a gas, che misura la portata del gas. A questo punto, la girante viene accesa e il flusso di gas, la temperatura e l'agitazione del recipiente vengono regolati fino a raggiungere i parametri desiderati. La porta di inoculazione viene quindi sterilizzata con alcool e la coltura di avviamento erogata nel contenitore del reattore. Durante il funzionamento, i campioni di coltura cellulare vengono prelevati in punti temporali selezionati per costruire una curva di crescita basata su misurazioni della densità cellulare. Quando la densità cellulare raggiunge il livello desiderato, la coltura viene interrotta e le cellule vengono raccolte dal vaso attraverso una serie di passaggi di filtrazione. Il restante contenuto del recipiente viene smaltito utilizzando candeggina o altri contenuti antimicrobici.
Simili ai reattori batch, i reattori a serbatoio agitato continuo, a volte chiamati chemiostati, richiedono che i loro singoli componenti siano risciacquati accuratamente con acqua deionizzata prima del montaggio. Una volta puliti, il gruppo agitatore e i componenti dell'albero di trasmissione sono montati insieme e il recipiente del reattore riempito con acqua deionizzata per migliorare la sterilizzazione durante l'autoclave. Le sonde di ossigeno disciolto, pH e temperatura vengono calibrate, quindi successivamente installate. Con il recipiente completamente assemblato, il reattore viene sterilizzato utilizzando un'autoclave. Dopo la sterilizzazione, il recipiente viene posto in una camicia di calore per controllarne la temperatura e le sonde calibrate sono collegate. Quindi, il media carboy e l'alimentazione d'aria con un filtro sterile vengono collegati prima di accendere il flusso d'aria. La nave viene innescata con mezzi sterili sbloccando il tubo del carboy e quindi eseguendo il programma di fermentazione di base. Mentre il fluido scorre nel reattore attivo, la porta di inoculazione viene sterilizzata con alcool prima che un millilitro di coltura di avviamento venga aggiunto alla nave. Durante il funzionamento, i campioni di coltura vengono prelevati in punti temporali selezionati per misurare la densità cellulare. Questi dati vengono quindi utilizzati per costruire una curva di crescita. La crescita ottimale si ottiene quando la coltura raggiunge lo stato stazionario, il che significa che la densità cellulare rimane costante.
Ora che hai imparato a conoscere i reattori a serbatoio agitato in batch e in continuo, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni pratiche di questa tecnologia. La produzione di birra viene in genere eseguita dalla coltivazione del lievito in un sistema di reattori batch. Un insieme di ingredienti di base costituito da acqua purificata, orzo maltato, luppolo e lievito vengono aggiunti a un reattore. L'orzo maltato stimola il processo di fermentazione fungendo da fonte di cibo ricco di zucchero per il lievito, che, se consumato, si traduce nella produzione di alcol come prodotto di scarto. Una volta che la miscela ha raggiunto il suo contenuto alcolico target, o fermentata per il periodo di tempo prescritto, può essere filtrata, confezionata e lasciata invecchiare per indurre la carbonatazione prima che il prodotto finale venga distribuito. I reattori standard possono anche essere personalizzati per scopi specializzati. Ad esempio, i reattori specializzati possono essere utilizzati per aumentare la vitalità cellulare degli scaffold tissutali attraverso una migliore distribuzione cellulare e dei nutrienti mediante miscelazione costante. Allo stesso tempo, la stimolazione meccanica può essere applicata all'impalcatura per incoraggiare la produzione di matrice extracellulare e dirigere attivamente la crescita e la differenziazione cellulare. Gli scaffold risultanti hanno migliorato le proprietà fisiologiche e meccaniche, rendendoli attraenti per l'impianto.
Hai appena visto il video di Jove sui reattori a batch e continui agitati. Ora dovresti capire come funzionano i bioreattori a serbatoi agitati in batch e in continuo e come questi sistemi possono essere applicati nel campo della bioingegneria. Grazie per l'attenzione.
