Il mio laboratorio ha studiato il ruolo del percorso di Ippopotamo nel cancro al seno e ai polmoni, e recentemente, abbiamo sviluppato un nuovo biosensore per monitorare l'attività di segnalazione di Ippopotamo. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave sulle reti di segnalazione cellulare, come il modo in cui il percorso Ippopotamo risponde ai fattori e come interagisce con altri percorsi di segnalazione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è la sua grande sensibilità e anche il gran numero di campioni può essere elaborato rapidamente e simultaneamente.
Questa tecnica ha diverse applicazioni nella ricerca di base e traslazione per indagare i regolatori della via di segnalazione dell'Ippopotamo sia in vitro che in vivo. Per iniziare, i plasmidi mini-prep LATS-BS freschi di coltura liquida dei batteri DH5-Alpha. Un'ora prima della trasfezione, aspirare il mezzo dalla piastra e aggiungere 500 microlitri di mezzo di crescita ad ogni pozzo.
Un punto importante è che il biosensore LATS deve essere preparato fresco per ottenere la massima espressione e attività. Inoltre, si consiglia di utilizzare sempre un regolatore a monte del percorso Ippopotamo, come msd, come controllo positivo quando si esegue il saggio luciferasi. Dopo questo, riportare le cellule nell'incubatrice.
Successivamente, preparare la soluzione A, una soluzione di DNA, e la soluzione B, un reagente di trasfezione diluito a base polimerica, come descritto nel protocollo di testo. Successivamente, aggiungere immediatamente la soluzione B alla soluzione A e pipettare delicatamente su e giù per mescolare. Incubare il campione a temperatura ambiente per 15 minuti per consentire la forma dei complessi di trasfezione.
Quindi aggiungere il volume totale dei complessi di trasfezione a goccia ad ogni pozzetto della piastra con un delicato vortice. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere il supporto contenente complessi di trasfezione e sostituirlo con nuovi supporti completi.
Quindi coltura le cellule a 37 gradi Celsius per un altro giorno. Diluire una quantità appropriata di tampone di lisi passiva 5x con acqua distillata. Quindi, aspirare completamente il supporto dalla piastra.
Aggiungere un millilitro di PBS a ciascun pozzo e ruotare delicatamente la piastra per rimuovere le cellule staccate e i mezzi di crescita residui. Quindi aspirare completamente il PBS. Quindi, aggiungere 250 microlitri da 1xPLB a ciascun pozzo.
Posizionare la piastra di coltura su una piattaforma a dondolo per 15 minuti per garantire una copertura uniforme del monostrato cellulare con PLB. Successivamente, trasferire il lysate in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Rimuovere il LAR-2 dallo stoccaggio di 80 gradi Celsius ed equilibrarlo a temperatura ambiente.
Quindi, preparare il reagente di rilevamento renilla per una quantità appropriata di saggi. Aggiungere il reagente di rilevamento Renilla al substrato 50x e al suo buffer. Quindi, erogare 10 microlitri di ogni litolato cellulare in tubi da 1,5 millilitri.
Quindi, programmare un luminometro per eseguire un ritardo di pre-misurazione di due secondi, seguito da un periodo di misurazione di 10 secondi. Con attenzione, trasferire 20 microlitri di reagente LAR-2 in un unico tubo e pipettare rapidamente su e giù per mescolare. Quindi, posizionare immediatamente il tubo nel luminometro e iniziare la lettura.
Dopo la lettura, rimuovere il tubo campione dal luminometro, aggiungere 20 microlitri di reagente di Renilla e pipettare su e giù per mescolare. Quindi, posizionare il campione nel luminometro e iniziare la lettura successiva. In primo luogo, le celle di coltura, disconnetti, conteggio e piastra HEK293 Ad come descritto nel protocollo di testo.
Quindi, un'ora prima della trasfezione, aspirare il supporto dalla piastra e sostituirlo con cinque millilitri di nuovi mezzi di crescita completi. Infine, aggiungere la soluzione diluita B alla soluzione A e pipettare su e giù per mescolare. Quindi, incubare il campione a temperatura ambiente per 15 minuti prima di aggiungere il volume totale dei complessi di trasfezione alla piastra, ruotando delicatamente.
Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, tripinare e contare le celle. Piastra da 10.000 a 20.000 celle in ogni pozzo di una piastra da 96 porri in un volume totale di 100 microlitri di supporti per pozzo.
Dopo questo, incubare le cellule per un altro giorno. Da una a quattro ore prima di eseguire il saggio di luciferasi, aggiungere agenti che potenzialmente regolano la via dell'Ippopotamo, ad una concentrazione finale di 10 micromolari per pozzo. Successivamente, aspirare completamente il supporto dalle cellule e lavare le cellule in ogni pozzo con 100 microlitri di PBS.
Quindi, aggiungere 20 microlitri di PLB ad ogni pozzo. Posizionare il piatto di coltura su una piattaforma a dondolo per 15 minuti. Quindi, trasferire 20 microlitri di reagente LAR-2 in ogni pozzo della piastra e pipettare su e giù per mescolare.
Subito dopo, posizionare la piastra in un luminometro di lettura della piastra e iniziare la lettura. Nella prima parte di questo protocollo, il LATS-BS è stato cotrasfetto con diversi geni per valutarne l'effetto sull'attività della chinasi LATS. Nel secondo protocollo, la LATS-BS è stata trasfettata in HEK293-Ad, e le cellule sono state passate in piastre da 96 pozzi.
40 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state trattate con diversi regolatori di piccole molecole noti della segnalazione di Ippopotamo, seguiti da un saggio di luciferasi. Quando si interpretano i risultati di questi test, va notato che proteine e trattamenti farmacologici possono attivare percorsi di feedback che influenzano l'attività del biosensore. Ulteriori esperimenti saranno necessari per confermare una relazione tra il candidato e il percorso di segnalazione dell'Ippopotamo.
Seguendo questa procedura, altri metodi come la PCR quantitativa in tempo reale, o Western Blot, possono essere utilizzati per rispondere a domande aggiuntive sull'attività lats chinasi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia del cancro per esplorare la dinamica e l'attività della chinasi LATS e della via di segnalazione di Ippopotamo in molti processi biologici e biochimici. Non dimenticare che i farmaci per lo screening possono essere estremamente pericolosi e dovrebbero sempre essere prese precauzioni appropriate durante l'esecuzione di questa procedura.
