Utilizzando questo protocollo, la migrazione cellulare e l'invasione possono essere svelate in condizioni in tempo reale che consentono di determinare la cinetica cellulare in perdita o guadagno di funzione genica e farmaci. A differenza di altri metodi, non sono necessarie macchie, danni meccanici alle celle o marcatori fluorescenti. Ancora più importante, la cinetica cellulare in tempo reale può essere determinata in modo efficace.
Quando la coltura della linea cellulare U-118MG raggiunge il 70-80% di confluenza, lavare le cellule con PBS prima di trattare le cellule con due millilitri dello 0,5% di tripside-EDTA. Dopo 30 secondi a 37 gradi Celsius, interrompere la reazione con 10 millilitri di mezzo di coltura fresco e trasferire le cellule staccate in un tubo conico da 15 millilitri. Dopo il conteggio, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e rimorsi il pellet in una concentrazione di sei volte 10-quinta per condizione nel volume appropriato di mezzo fresco.
Trasferire sei volte 10 alla quinta colonna in un tubo di microcentrifugo per condizione e aggiungere 800 microlitri del PBS di Dulbecco a ciascun tubo. Dopo la centrifugazione, rimorsi ogni pellet in 60 microlitri di tampone di resuspensione R e sei micromolari del siRNA di interesse. Mescolare ogni tubo con maschiatura delicata prima di elettroporare 10 aliquote microliter di ogni sospensione cellulare con tre impulsi da 10 millisecondi da 1.350 volt.
Dopo ogni trattamento, mettere in comune le cellule elettroporate da ogni condizione in singoli cinque aliquote millilitri di mezzo di coltura fresco. Quindi seminare le cellule in due piatti di coltura di 35 millimetri per condizione e posizionare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per tre giorni. Da cinque a sei ore prima dell'analisi cellulare in tempo reale, posizionare il sistema di analisi cellulare in tempo reale nell'incubatore di coltura cellulare.
Per impostare un saggio di invasione, utilizzare la pipettazione inversa per posizionare 50 microlitri di DMEM integrati con 0,1 microgrammi per millilitro di gel a matrice extracellulare in ogni pozzo della camera superiore di una piastra di invasione cellulare. Immediatamente dopo la placcatura, rimuovere 30 microlitri della soluzione a matrice extracellulare da ogni pozzo e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per quattro ore. Per impostare un programma di misurazione dell'impedenza, sei ore prima della misurazione, sostituire il mezzo in tutte le colture cellulari elettroporate con mezzo siero basso.
Nella scheda Layout del software di misurazione dell'impedenza associato selezionare pozzi quadruplicati per ogni condizione biologica. Nella scheda Pianificazione impostare un passaggio di sweep di misurazione della linea di base una sola volta con un intervallo di un minuto e impostare un secondo passaggio per misurare l'impedenza della cella nelle rispettive singole culle per l'esperimento effettivo. Un'ora prima dell'inizio della misurazione dell'impedenza cellulare, aggiungere 160 microlitri di mezzo integrati con siero bovino fettale al 10% come chemioattrattante nei pozzi della camera inferiore della piastra di invasione cellulare e migrazione.
Per misurare l'invasione, assemblare la camera superiore contenente i pozzi rivestiti in gel a matrice extracellulare. Per misurare la migrazione, utilizzare pozzi non rivestiti nella camera superiore. Per entrambi i tipi di esperimento, riempire i pozzi nella camera superiore con 50 microlitri di mezzo siero basso e posizionare le camere nella culla del sistema.
Fare clic sulla scheda Messaggio nel software per determinare se tutti i pozzi sono riconosciuti dall'unità di controllo. Se il messaggio viene visualizzato come previsto, la piastra nella culla è pronta per l'esperimento. Quindi posizionare le piastre completamente imballate nell'incubatore di coltura cellulare nella culla del sistema di analisi cellulare in tempo reale per un'ora per acclimatare la piastra alle condizioni di coltura cellulare.
Mentre le piastre sono equilibranti, raccogliere le cellule del glioblastoma come dimostrato e rimostrare le cellule da ogni condizione a otto volte 10 alla quinta colonna per 800 microlitri a bassa concentrazione media siere. Inoltre, mettere da parte un tre volte 10 alla quinta cellule in due millilitri di mezzo di coltura per la semina in un piatto da 35 millimetri per l'analisi western a valle della macchia. Per misurare la lettura pre-migrazione prevista, al termine dell'acclimatazione fare clic sul pulsante Start della base.
Una volta acquisita la misurazione di base, trasferire la migrazione e le piastre di invasione dalle rispettive culle in un armadio di biosicurezza. Pipetta inversa 100 microlitri di cellule in pozzi quadruplicati della camera superiore per ogni condizione biologica nel pozzo appropriato delle piastre di invasione cellulare e migrazione come programmato nell'unità di controllo della culla. Dopo la semina, tenere le piastre nell'armadio di biosicurezza per 30 minuti a temperatura ambiente per consentire alle cellule di depositarsi uniformemente sul fondo della piastra prima di trasferire le piastre nelle rispettive culle.
Fare clic sul pulsante Start della base per iniziare a misurare l'impedenza della cella. Per visualizzare le modifiche nell'impedenza delle celle come indice di cella in modo dipendente dal tempo durante o dopo il completamento dell'esperimento, aprire la scheda Analisi dati. Per visualizzare i dati per ciascuna delle rispettive condizioni singolarmente o come medie e/o deviazioni standard, fare clic sulle caselle delle opzioni per la deviazione media e standard.
Per esportare i dati dell'indice delle celle in un file di foglio di calcolo, posizionare il cursore al centro della finestra di analisi dei dati e fare clic con il pulsante destro del mouse. Nella finestra di dialogo visualizzata selezionare l'opzione copia dati in formato elenco e incollarli in un foglio di calcolo aperto. Per rilasciare l'esperimento, fare clic sul pulsante Rilascia in ogni base.
L'abbattimento delle proteine dell'adattatore Crk diminuisce i livelli di proteine Crk1 e Crk2 rispettivamente dell'85% e dell'86% senza indurre livelli proteici simili a Crk. L'abbattimento di simili a Crk riduce l'espressione proteica simile alla Crk dell'85% con lievi riduzioni dei livelli proteici di Crk1 e Crk2. La combinazione di entrambi i siRNA riduce l'espressione simile a Crk1, Crk2 e Crk di oltre l'80%, mentre né Vinculin né l'espressione alfa-tubulina sono influenzate da alcuna combinazione di knockdown simile a Crk o Crk.
Le cellule del glioblastoma cerebrale umano migrano lungo un gradiente in risposta ad alte concentrazioni siere che raggiungono il livello massimo di migrazione a 13 ore. Nelle celle di abbattimento Crk, sebbene la migrazione sia inizialmente ritardata, le cellule hanno continuato a migrare fino a 23 ore. L'abbattimento simile a una Crk riduce sostanzialmente la migrazione cellulare con la linea cellulare del glioblastoma che perde completamente la loro capacità migratoria a causa dell'abbattimento sia di Crk che di Crk che suggeriscono che crk e crk-like svolgono ruoli essenziali sovrapposti nella migrazione delle cellule tumorali.
Tuttavia, quando l'invasione cellulare viene monitorata per diversi giorni, le cellule di abbattimento della Crk raggiungono un livello massimo simile di invasione cellulare rispetto alle cellule di glioblastoma di controllo a 60 ore con cellule simili a Crk che recuperano parzialmente la loro capacità invasiva di 90 ore e doppie cellule Crk-Crk che dimostrano una ridotta capacità di invadere dopo 40 ore. I risultati supportano chiaramente il suggerimento che l'invasione cellulare dovrebbe essere analizzata durante l'intero periodo dell'esperimento. Seminare il giusto numero di cellule ed evitare le bolle d'aria durante la registrazione della matrice extracellulare per il test di invasione e le cellule di semina sono punti chiave per il successo di questo esperimento.
Seguendo una procedura simile, ma utilizzando piastre e-plates, è possibile determinare l'adesione cellulare e la cinetica di proliferazione cellulare.
