Questo metodo facilita l'efficace caratterizzazione dei metodi della RAF chinasi correlati alla malattia. Questa tecnica è altamente sensibile e riproducibile, economica, intuitiva e non richiede alcuna attrezzatura avanzata. Per misurare l'attività catalitica dei mutanti della RAF, introdurre mutazioni della tecnologia della bandiera nella sequenza di codifica RAF da PCR, prima di inserire intere sequenze nel vettore appropriato secondo protocolli standard.
Inserire il glutatione come sequenza di codifica transferasi a monte delle sequenze di codifica mutante DELLA RAF, per generare vettori che codificano il glutatione come mutanti RAF fusi transferasi, allo stesso modo. Trasvetta le colture cellulari 293T dall'80% al 90% confluenti con i vettori che codificano le chinasi RAF contrassegnate con flag o i loro mutanti, secondo i protocolli standard. Dopo 24 ore di cultura, sostituisci il mezzo in ogni cultura.
Dopo 48 ore di coltura, aggiungere 400 microlitri di tampone di lysis integrati con inibitori della proteasi e della fosfatasi, ad ogni pozzo sul ghiaccio. Dopo cinque o 10 minuti trasferire i llysati cellulari in un tubo da 1,5 millilitri per la centrifugazione per sedimentare i detriti cellulari. Trasferire 300 microlitri di ciascun campione in singoli tubi di microfuga da 1,5 millilitri.
Mettere da parte 40 microlitri per campione per l'analisi della chinasi extra cellulare fossile a valle regolata dalla chinasi, una e due espressioni e attività. Aggiungere 20 microlitri di perline di affinità anti-FLAG a ciascun tubo, per un'incubazione di un'ora con rotazione in una stanza fredda di quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione lavare rapidamente e delicatamente le perline antiflag una volta con tampone di lisi nella stanza fredda e una volta con tampone di reazione della chinasi prima di aggiungere 20 microlitri di miscela di reazione chinasi.
I mutanti grafici con una bassa affinità di Dima possono perdere la loro attività catalitica in vitro a causa della dissociazione di Dima. Pertanto, il lavaggio rapido e delicato è fondamentale. Dopo 10 minuti a temperatura ambiente con il capovolgimento a giorni diversi, interrompere le reazioni della chinasi con cinque microlitri di cinque tamponi campione XSDS, per campione e far bollire i campioni a 90 gradi Celsius per cinque minuti.
Al termine dell'incubazione, eseguire i campioni su un gel di elettroforesi poliacrilammide dal nove al 12% con 0,1%SDS, quindi trasferire le proteine su una membrana di nitrocellulosa per consentire il rilevamento dei livelli di protein chinasi proteica attivata dal fosfo mitogeno e mutanti RAF in ogni campione, mediante immunoblotting. Per valutare l'attività allosterica dei mutanti della RAF morti della chinasi, costruisci vettori che codificano il ricevitore RAF o gli attivatori della RAF morti della chinasi. Transvect 293 T cellule con due vettori che codificano sia il ricevitore RAF che l'attivatore RAF morto chinasi, o un singolo vettore che codifica una delle proteine come dimostrato.
Raccogliere l'intera cellula lysates dopo 48 ore di coltura come dimostrato, e mescolare rapidamente il lisce di cellule intere pulite con cinque tamponi campione XSDS a temperatura ambiente, Prima di bollire i lisce per cinque minuti a 90 gradi Celsius. Quindi eseguire i campioni di lisato a cellule intere bollite su un gel di elettroforesi poliacrilammide dal nove al 12% che è 0,1%SDS e trasferire le proteine su una membrana di nitrocellulosa per rilevare i livelli di fosfo segnale cellulare extra regolato chinasi uno e due e controllare le proteine mediante macchia immunitaria come dimostrato. Per misurare l'affinità relativa del dimero e o la stabilità dei mutanti della RAF costruiscono vettori che codificano mutanti di bandiera tech draft fusi al capolinea della luciferasi firefly o del C Terminus una lucciola luciferasi.
Transvect 293 T cellule con un paio di vettori che codificano diversi e Terminus di mutanti della RAF luciferasi lucciola e C Terminus una lucciola luciferasi MUTANTI RAF come dimostrato. 24 ore dopo la ritrasfusione si ritrascono due volte 10 alla quinta transazione di celle da 293 T per pozzo in lastre di immagine nero cristallo nel mezzo privo di colore. 48 ore dopo la trasvezione aggiungere la luciferina a 293 transvectenti cellulari T e incubare per 30 minuti.
Prima di misurare i segnali luciferasi su un sistema multi rilevamento. Al termine della misurazione aspirare i supernanti e blice le cellule 293 T transazionali con tampone di lysas come dimostrato. Eseguire i campioni di lysato a celle intere su un gel di elettroforesi di poliacrilammide dal nove al 12% con 0,1%SDS.
Rileva i livelli di espressione del capolinea finale dei mutanti della RAF Firefly luciferase, o il capolinea C dei mutanti raf firefly luciferasi da un ammino macchia antiflag come dimostrato. Quindi normalizzare i segnali luciferasi dei transvectanti a cellule 293 T in base ai livelli di espressione del capolinea finale della luciferasi firefly e del capolinea C dei mutanti RAF Firefly luciferase. L'asa chinasi in vitro può essere usata per sondare efficacemente l'attività catalitica di alcuni mutanti R-spine costitutivamente attivi, ma non quella dei mutanti morti chinasi con una colonna vertebrale C fusa.
L'attività catalitica dei mutanti RAF costitutivamente attivi con una debole affinità o stabilità del dimero, tuttavia, potrebbe non essere sondata usando questa ASA poiché i loro dimeri sono rotti durante il processo di purificazione. Per evitare la perdita dell'attività catalitica dei mutanti della RAF con debole affinità o stabilità dei dimeri, questi mutanti possono essere fusi con glutothionas transferasi per salvare l'attività catalitica dei mutanti. La co-attivazione della RAF ASA può essere usata per valutare l'attività allosterica dei mutanti raf morti di chinasi.
Come illustrato mutanti morti chinasi con un motivo terminale finale acido e fusione della colonna vertebrale C, funzionano come attivatori allosterici per innescare l'attività catalitica di mutanti con un motivo terminale acido relabile non fosforabile, quando co espresso in cellule 293T. Inoltre, una split luciferasi SA gratuita può essere utilizzata per misurare l'affinità relativa del dimero o la stabilità delle chinasi familiari della RAF e dei loro mutanti. L'uso di un tampone di lisas con una bassa concentrazione di detergente e una rapida procedura di lavaggio delicato durante la purificazione del campione è essenziale per una SA di chinasi in vitro di successo. Questa tecnica aiuterà i ricercatori a determinare con precisione come la malattia trasmette i mutanti della RAF, attivare la via a valle, facilitando la selezione di strategie terapeutiche appropriate per il trattamento delle malattie.
