Il vantaggio principale di questo saggio di torbidità a base di piastre è che è veloce e consente di modificare diversi inibitori dell'interazione amiloide-beta fibrinogeno contemporaneamente senza una configurazione o requisiti sofisticati. I composti della testa che si trovano nel test di torbidità della fibrina possono essere ulteriormente valutati per la loro capacità di ripristinare l'anomalia strutturale indotta da A-beta nei coaguli di fibrina analizzati mediante microscopia elettronica a scansione. La dimostrazione visiva della preparazione del coagulo per l'analisi della microscopia elettronica a scansione è fondamentale in quanto qualsiasi variazione nella preparazione può contribuire a variazioni all'interno dei risultati sperimentali.
Il focus di questa dimostrazione qui è sulle interazioni fibrinogene A-beta. Questo protocollo può essere facilmente modificato per analizzare altre interazioni con altre proteine e i composti con il coagulo di fibrina. Iniziare aggiungendo 1,5 micromolari di fibrinogeno appena preparato in 200 microlitri di tampone di formazione di coaguli a ciascun A-beta negativo 42 contenente e controllare i pozzi e incubare la piastra su una piattaforma rotante a temperatura ambiente.
Dopo 30 minuti aggiungere contemporaneamente 30 microlitri di soluzione di trombina appena preparata direttamente al centro del pozzo contenente fibrinogeni per avviare la formazione di coaguli e leggere immediatamente l'assorbanza dei coaguli in vitro a 350 nanometri, ripetendo la misurazione ogni 30-60 secondi nel corso di 10 minuti. Per valutare l'effetto degli inibitori dell'interazione del fibrinogeno A-beta sulla struttura del coagulo di fibrina, utilizzare prima le forcep per posizionare una copertura del cerchio di vetro siliconizzata pulita da 12 millimetri scivola sui singoli pozzi di una piastra di 12 pozzi e aggiungere 80 microlitri di fibrinogeno su ogni slittamento di copertura, diffondendo delicatamente la soluzione in modo che siano distribuiti uniformemente. Aggiungere 20 microlitri di soluzione di trombina ad ogni pozzo per iniziare la formazione di coaguli.
Coprire la piastra per un'incubazione da 30 a 60 minuti a temperatura ambiente, quindi immergere delicatamente ogni coagulo in due millilitri di tampone di cacodilato di sodio ghiacciato per due minuti, coperto, a temperatura ambiente due volte, utilizzando una pipetta millilitro per rimuovere con cura il tampone dopo ogni lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, controllare lo stato della formazione di coaguli sullo scivolo di copertura e fissare i coaguli in due o tre millilitri di glutaraldeide ghiacciata al 2% sul ghiaccio per 30 minuti. Alla fine dell'incubazione, rimuovere delicatamente la glutaraldeide da ogni pozzo e lavare i coaguli con tampone di cacodilato di sodio fresco come dimostrato sul ghiaccio.
Idratare i coaguli fissi in una serie graduata di lavaggi di etanolo ghiacciato di cinque minuti sul ghiaccio senza rimuovere completamente l'etanolo tra i lavaggi per mantenere i coaguli protetti dall'esposizione all'aria. Durante l'ultimo lavaggio al 100% di etanolo, trasferire il coperchio scivola in un supporto critico per campioni di essiccatore a punti, posizionando almeno 1 rondella tra ogni slittamento del coperchio e posizionare il supporto in una camera di essiccazione a punti critici riempita di etanolo. Dopo un ciclo di asciugatura di 30 minuti, utilizzare il nastro di carbonio per montare i coperchi sui singoli stub di microscopia elettronica a scansione e trasferire i campioni nella camera di rivestimento dello sputter di un rivestimento dello sputter sottovuoto.
Quindi lo sputter rivestire meno di 20 nanometri di palladio d'oro o altri materiali conduttivi sui campioni per 25 secondi a quattro angstrom al secondo e immaginiamo i campioni su un microscopio elettronico a scansione dotato di un rivelatore di elettroni secondari di tipo due a quattro kilovolt. La formazione di coaguli di fibrina provoca la dispersione della luce che passa attraverso la soluzione, con conseguente aumento della torbidità che si altiva alla fine del periodo di lettura. Quando il fibrinogeno viene incubato in presenza di A-beta 42 la torbidità della soluzione diminuisce con la curva che raggiunge un'altezza massima di circa la metà di quella del solo fibrinogeno.
In presenza di un blocco di interazione A-beta 42 l'effetto della beta-amiloide viene migliorato e la torbidità è superiore a quella con solo A-beta. L'effetto del bloccante non appare a causa della torbidità dello sfondo in quanto il composto non cambia la torbidità del coagulo di fibrina quando A-beta è assente. Inoltre, la formazione di coaguli in presenza di GPRP, un peptide noto per interferire con la polimerizzazione della fibrina, dimostra una torbidità significativamente ridotta rispetto alla formazione di coaguli di fibrina in assenza dell'inibitore.
Il fibrinogeno generato in presenza di trombina e cloruro di calcio forma solo una rete di fibrina con fili allungati e intercalati di fibrina e fasci più grandi. Quando è presente L'A-beta, i fili di fibrina sono diventati più sottili con diversi grumi appiccicosi negli aggregati, indicando anomalie strutturali indotte da A-beta. Coerentemente con i risultati del test di torbidità, la formazione di coaguli in presenza di un bloccante di interazione fibrinogeno A-beta ripristina parzialmente la struttura del coagulo di fibrina dai cambiamenti indotti da A-beta man mano che si osservano meno grumi con questo trattamento.
Il test di torbidità del coagulo e i protocolli di analisi del microscopio elettronico a scansione sono stati ottimizzati per valutare diversi inibitori dell'interazione fibrinogeno A-beta in modo rapido e riproducibile. E presto i dati forniranno preziose informazioni sulla formazione di coaguli di fibrina che possono essere applicati a ulteriori studi sia in vitro che in vivo.
