Questa tecnica di microscopia elettronica a volume è usata per eseguire studi biologici che richiedono l'osservazione di una struttura 3D. Offre un'asta, una vista del fielder e una memoria di esempio prima che l'immagine ripresta. Fx2 Asan ha progettato gli stadi del percorso che catalizzano la deabilazione per aumentare il test elettronico delle strutture bersaglio e possono essere utilizzati per individuare uno specifico bersaglio di interesse.
Queste particelle combinano l'uso della luce correlativa e della tecnica di microscopia elettronica 3D per indagare le interazioni tra organelli membrianosi e cellule ospiti. Da 16 a 24 ore dopo la trasfezione, lavare delicatamente la coltura con soluzione di fissaggio da 250 microlitri da 30 a 37 gradi Celsius. Sostituire rapidamente il lavaggio con 1,5 millilitri di soluzione di fissaggio fresco e mettere la coltura sul ghiaccio per 30 minuti.
Alla fine dell'incubazione, sciacquare le cellule con tre lavaggi di dieci minuti in un millilitro di tampone di cacodilato di sodio molare 0,1 per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere un millilitro di ghiacciato da 0 a 4 gradi Celsius soluzione di glicina millimolare al piatto per un'incubazione di dieci minuti sul ghiaccio seguita da tre lavaggi di cinque minuti con un millilitro di tampone di cacodilato di sodio molare fresco e freddo 0,1 per lavaggio. Successivamente, etichettare le celle con 500 microlitri di soluzione DAB preparata al momento.
E incubare le cellule sul ghiaccio per circa cinque-quarantacinque minuti. Quando una macchia marrone chiaro è visibile al microscopio a luce invertita, sciacquare le cellule tre volte con un millilitro di cacodilato di sodio molare fresco e freddo 0,1 per dieci minuti per lavaggio. Quindi, utilizzare un microscopio invertito a contrasto di fase per visualizzare la colorazione DAB con un ingrandimento 100 volte superiore o superiore e contrassegnare il fondo del vetro in cui si trova la regione di interesse.
Per la preparazione del campione di blocchi al microscopio elettronico, prima post-fissare le cellule con un millilitro di tetrossido di osmio ridotto del 2% per un'ora a quattro gradi Celsius. Al termine della fissazione, sciacquare le cellule con tre lavaggi di cinque minuti e un millilitro di acqua distillata fresca per lavaggio. Prima di trattare le cellule con un millilitro di soluzione TCH filtrata per 20 minuti.
Al termine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte in acqua distillata come appena dimostrato e fissare le cellule con un'incubazione di 30 minuti in tetrossido di osmio ridotto del 2%. Alla fine della seconda fissazione, lavare le cellule tre volte con acqua distillata e coprire la coltura con un millilitro di acetato acquoso dell'1%uranil durante la notte a 4 gradi Celsius protetto dalla luce. La mattina seguente, lavare le cellule tre volte con acqua distillata prima di macchiare con un millilitro di 60 gradi Celsius riscaldato la soluzione di aspartato di piombo di Walton per 30 minuti in un forno a 60 gradi Celsius.
Alla fine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte in acqua distillata. E incubare la coltura in una serie graduata di aliquote di etanolo da 20 minuti e 2 millilitri. Dopo l'ultima esposizione al 100% all'etanolo, incubare le cellule per 30 minuti in un millilitro da tre a uno etanolo a mezzo miscela incorporante a bassa viscosità a temperatura ambiente.
Alla fine dell'incubazione, sostituire il mezzo con un millilitro di etanolo uno-a-uno a mezzo miscela incorporante a bassa viscosità per un'altra incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, sostituire il mezzo con un millilter di etanolo uno-a-tre a mezzo miscela di incorporamento a bassa viscosità per altri 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, sostituire il mezzo con un millilitro di mezzo di incorporamento di viscosità bassa al 100% durante la notte, seguito dall'incorporamento del campione in una miscela di incorporamento di viscosità bassa al 100% per 24 ore a 60 gradi Celsius.
Per l'analisi della microscopia elettronica a trasmissione, il giorno successivo, utilizzare un ultra microtomo per ottenere sezioni spesse 90 nanometri e osservare la griglia sotto microscopia elettronica a trasmissione a 200 kilovolt. Prima di iniziare la preparazione del campione, pulire le coperture in vetro rivestito in ossido di stagno indio con delicata agitazione in isopropanolo per 30-60 secondi. Alla fine dell'agitazione, scolare l'alcol in eccesso e posizionare i copriparsi in un ambiente privo di polvere.
Quando i copricapo sono asciutti, utilizzare un rivestimento al plasma per brillare scaricare i copricapo per un minuto. Quindi inserire le coverlips nel supporto del substrato e posizionare il supporto del substrato nella barca del coltello. Per ottenere campioni per la microscopia elettronica a scansione, inserire il blocco campione incorporato nel portacampioni dell'ultramicrotoma.
E impostare il supporto nel blocco di taglio. Utilizzare una lama di rasoio per tagliare via la resina in eccesso intorno alla posizione di destinazione in modo che la faccia del blocco acquisisca una forma trapezoidale o rettangolare. I bordi iniziali e d'avanguardia dovrebbero essere strettamente paralleli l'uno all'altro.
Non è facile acquisire un gran numero di sezioni seriali. Tuttavia, è necessario avere i bordi iniziali e gli spigoli d' trainato completamente paralleli. Quindi, inserire il portacampioni nel braccio dell'ultramicrotomo.
Posizionare il coltello diamantato nel portapenne e riempire la barca del coltello con acqua distillata filtrata. Quindi, spingere con attenzione la maniglia del supporto per regolare la posizione del supporto in modo che il bordo dei copripavimenti sia vicino al coltello. Dopo aver ottenuto il campione, interrompere il processo di sessatura, aprire lentamente la vite di bloccaggio del tubo e drenare la barca ad acqua.
Al termine del processo di raccolta del nastro, rimuovere il substrato con la maniglia del dispositivo di bloccaggio e asciugare il nastro. L'uso di plasmidi geneticamente taggati che esprimono proteine di interesse, consente l'identificazione delle cellule bersaglio trasfette dopo la colorazione per le proteine taggate. La microscopia elettronica a luce correlativa può quindi essere utilizzata per visualizzare ulteriormente la coltura cellulare etichettata.
Ad esempio, la macchia scura generata da SCO1-APEX2 è osservata esclusivamente nello spazio intermembrana mitocondriale e non nello spazio matriciale dei mitocondri. Le cellule trasfette di codice con plasmidi SCO1-APEX2 e HRP-KDEL esprimono un segnale elettronico altamente denso nello spazio intermembrana mitocondriale e nel reticolo endoplasmatico. Tuttavia, nessuna colorazione del reticolo endoplasmatico si osserva nelle cellule che sono trasfette solo con SCO1-APEX2.
Per l'imaging seriale mediante microscopia elettronica a scansione, viene creata una panoramica dell'intera immagine dell'array utilizzando un rivelatore di elettroni backscatter su una vasta area. Successivamente, la regione di interesse viene posizionata nella prima sezione e propagata a tutte le altre sezioni. Infine, l'area di interesse contenente cinque celle di destinazione viene immagine con cinque pixel di immagine nanometrici.
L'ingrandimento rivela strutture subcellulari dettagliate come l'apparato di Golgi, i mitocondri e il reticolo endpolasmico. L'imaging seriale rivela chiaramente che i contatti endoplasmatici tra reticolo e mitocondri si verificano su diversi piani z. Dovresti avere una buona comprensione di come localizzare una specifica struttura bersaglio usando la luce correlativa e la microscopia elettronica per indagare gli effetti di una specifica modifica dell'identità.
Queste tecniche di colorazione combinate con la microscopia elettronica a volume potrebbero essere utilizzate per i mercati emergenti su larga scala per studiare le interazioni cellulari in particolare nell'eurovirus. Ricorda che la glutaraldeide, anche l'enteterocida e il TCH sono molto tossici, quindi assicurati di indossare indumenti protettivi e di lavorare in una cappa aspirante quando usi questi materiali.
