L'analisi crio-EM a singola particella è diventata una tecnica di routine nella cassetta degli attrezzi del biologo strutturale applicabile a una vasta gamma di campioni tra cui proteine di membrana, fibrille amiloidi, proteine leganti gli acidi nucleici e virus. Una volta completata la preparazione del campione e caricate le griglie nel microscopio, la raccolta dei dati può essere effettuata da remoto in molte strutture crio-EM come l'Astbury Biostructure Laboratory e l'eBIC. I principali ostacoli al successo della determinazione della struttura si trovano spesso nelle fasi di preparazione del campione e di screening della griglia con più iterazioni a volte richieste attraverso questo processo.
Qui, dimostreremo lo screening remoto della griglia e l'acquisizione di dati a singola particella. Nella scheda del caricatore automatico dell'interfaccia utente del microscopio, selezionare la finestra di dialogo delle opzioni utilizzando la freccia e premere il pulsante dell'inventario. Questo controllerà sequenzialmente ogni posizione nella cassetta per determinare se è presente una cartuccia.
L'inventario verrà eseguito su ogni slot in sequenza. Quando tutti gli slot occupati sono mappati, l'inventario si fermerà. Evidenziare la griglia da trasferire nella colonna del microscopio e fare clic su Carica.
L'etichetta dello slot passerà dal blu al giallo una volta che la griglia sarà stata caricata correttamente sul palco. Per schermare le griglie, aprire il software EPU. Nella pagina di preparazione, seleziona l'ottica di acquisizione e le impostazioni, quindi seleziona il preset dell'atlante dal menu a discesa.
Scegliere i preset di impostazione del fascio appropriati e premere set per spingere i parametri al microscopio. Premere per aprire le valvole a colonna e inserire lo schermo antinfluenzale. Verificare che un raggio sia visibile e sufficientemente diffuso e centrato per coprire il rilevatore.
Se necessario, passare a una regione più sottile della griglia utilizzando il joystick o i pannelli manuali virtuali per controllare i movimenti del palco in X e Y.Sollevare lo schermo antinfluenzale e scattare un'immagine utilizzando il pulsante di anteprima in EPU. In EPU, vai alla pagina dell'atlante e premi nuova sessione. Selezionare il formato immagine MRC e immettere un nome e una posizione di cartella adatti per salvare la sessione di screening, quindi fare clic su Applica.
Seleziona screening dal menu a sinistra. Seleziona le caselle di controllo accanto a ciascuna griglia per acquisire un montaggio dell'atlante, quindi avvia la sessione di screening in EPU. Viene acquisito un atlante per ogni griglia controllata e i quadrati della griglia disponibili vengono elencati al completamento.
Ogni atlante può essere visualizzato evidenziandolo nella pagina di screening. Al termine, rivedere gli atlanti raccolti e identificare le griglie adatte per valutare la qualità del campione a ingrandimenti più elevati. Evidenziare la griglia scelta nel menu di screening EPU e fare clic su Carica campione.
Dal menu di screening dell'atlante, selezionare la griglia attualmente caricata e spostare lo stage in un quadrato della griglia contenente i fori riempiti facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla posizione desiderata sull'immagine della griglia e selezionando sposta lo stage qui. Tornate alla pagina di preparazione dell'EPU e selezionate il preset quadrato della griglia. Apri la pagina delle funzioni automatiche dell'EPU ed esegui l'inclinazione auto-eucentrica per stadio con il quadrato della griglia preimpostato per spostare il campione all'altezza eucentrica.
Nella preparazione dell'EPU, acquisire una nuova immagine di anteprima quadrata della griglia. Osservate i valori di grigio attraverso fori diversi che indicano diversi spessori di ghiaccio. Spostate lo stage su un foro facendo clic con il pulsante destro del mouse e spostate lo stage qui.
Selezionate il foro o l'altezza eucentrica preimpostata, quindi fate clic su Anteprima ( Preview). Selezionare il preset di acquisizione dati e impostare un ingrandimento che consenta una facile identificazione delle particelle. Impostare l'offset di sfocatura su negativo da tre a cinque micrometri.
Scorrere i passaggi per rivalutare una gamma di spessori di ghiaccio per la distribuzione delle particelle, l'orientamento e la contaminazione attraverso la griglia. A seconda della disponibilità del microscopio, continuare direttamente alla raccolta dei dati o le griglie possono essere rimosse dal microscopio per la raccolta futura, anche in altri siti. Raccogliere un atlante se non è disponibile dallo screening impostando le impostazioni dell'atlante e selezionando la griglia per acquisire l'atlante.
Acquisisci l'atlante e fai clic sulla posizione della griglia per vedere l'output. Una volta completato l'atlante, definire ciascuno dei preset di impostazione del fascio in base alle esigenze sperimentali del progetto. Eseguire calibrazioni di spostamento dell'immagine.
Configurare la sessione EPU selezionando la configurazione della sessione della pagina EPU e quindi selezionando nuova sessione o nuova dalle preferenze. Dopo aver selezionato la nuova sessione, apparirà un popup che fornisce un'opzione per utilizzare le impostazioni precedenti. Le impostazioni verranno caricate automaticamente dalla sessione EPU precedente a quella corrente.
In alternativa, selezionare nuovo dalle preferenze e selezionare un file con le preferenze salvate per precaricare queste informazioni nell'EPU corrente. Inserisci il nome della sessione con qualcosa di informativo. In tipo, selezionare manuale.
Per la modalità di acquisizione, selezionare il centraggio accurato del foro o l'acquisizione più rapida se la raccolta di spostamento dell'immagine libera da aberrazione è disponibile e desiderata. Seleziona il formato immagine desiderato, quindi seleziona la cartella di archiviazione e EPU creerà una directory con il nome della sessione. Selezionate la griglia appropriata in base alla quale viene utilizzata la spaziatura dei fori della griglia e premete applica (Apply).
Selezionare un quadrato della griglia iniziale e impostare un modello di acquisizione. Vai alla selezione quadrata. Se tutti i quadrati sono verdi, fai clic su Deseleziona tutto in alto a sinistra.
Aprire i riquadri facendo clic con il pulsante destro del mouse e quindi selezionando Apri riquadro. Aggiungere o scegliere un quadrato griglia facendo clic su Seleziona, quindi facendo clic con il pulsante destro del mouse e selezionando Sposta lo stage nel quadrato della griglia. Vai a Selezione fori e premi auto-eucentrico.
Attendere fino a quando non viene scattata un'immagine quadrata della griglia. Se la funzione automatica non riesce, ciò potrebbe essere dovuto al fatto che l'altezza è significativamente disattivata. Può essere regolato manualmente utilizzando lo schermo antinfluenzale con ingrandimento quadrato della griglia.
Per misurare le dimensioni dei fori, spostate e regolate i cerchi gialli in modo che siano sopra i fori con dimensioni e spaziatura corrette. Premere trova fori. Controllare che i fori siano stati trovati correttamente.
In caso contrario, modificate le dimensioni del foro e premete nuovamente Trova fori. Se questo processo fallisce costantemente, considera la possibilità di passare a un numero inferiore o a una dimensione del punto più luminoso all'ingrandimento quadrato della griglia. Utilizzare l'istogramma della qualità del ghiaccio del filtro a destra per regolare la selezione dei fori.
Questo può essere utile per escludere aree con ghiaccio spesso e ghiaccio sottile. Questo sarà ricordato per i futuri quadrati della griglia selezionati durante la sessione. Ottimizzate la selezione dei fori con gli strumenti del menu di selezione in alto.
Ad esempio, fate clic su Rimuovi fori vicino alla barra della griglia. Vai alla definizione del modello e premi acquisisci. Fate clic su Trova (Find) e sul foro centrale (Center Hole).
Modificare il ritardo dopo lo spostamento dello stadio e il ritardo dopo i tempi di spostamento dell'immagine a uno o cinque secondi, quindi, se disponibile, controllare che il valore massimo di spostamento dell'immagine sia quello desiderato. Fai clic su Aggiungi area di acquisizione e fai clic in un punto qualsiasi dell'immagine. Spostare l'area di acquisizione nella posizione desiderata.
Aggiungi l'intervallo di sfocatura in alto a destra. Un tipico elenco di defocus per un progetto di proteina di membrana è negativo da 0,8 a tre micrometri negativo, quindi aggiungere altre aree di acquisizione, disponendole in modo tale che le aree di acquisizione non siano doppiamente esposte con il raggio. Fai clic su Aggiungi area di messa a fuoco automatica e fai clic in un punto qualsiasi dell'immagine.
Spostate l'area di messa a fuoco automatica sul carbonio che circonda un foro. La pratica standard è quella di mettere a fuoco automaticamente dopo la centratura quando si utilizza AFIS o ogni cinque a 15 micrometri a seconda della variazione di altezza Z attraverso il quadrato. Fare clic su Aggiungi area di misurazione della deriva.
Misurazione della deriva eseguita una volta per quadrato di griglia con una soglia impostata di 0,05 nanometri al secondo come impostazione standard. L'area di misurazione della deriva può sovrapporsi direttamente all'area di messa a fuoco automatica. Assicurati che né la deriva né l'area di messa a fuoco automatica si sovrappongano a un'area di acquisizione.
Torna alla selezione quadrata e seleziona i quadrati per l'acquisizione sulla griglia. Utilizzare il numero di aree di acquisizione e il tasso di acquisizione dati previsto per prevedere quante aree di acquisizione sono necessarie. Quando tutti i quadrati desiderati sono selezionati, premere Prepara tutti i quadrati.
Una volta raccolto ogni quadrato, naviga tra i quadrati della griglia e perfeziona i fori usando il pennello di selezione. Spostatevi in una posizione dello stage sopra il campione e utilizzate le funzioni automatiche per impostare l'altezza eucentrica. Eseguire allineamenti al microscopio utilizzando il software del microscopio come descritto in precedenza e nel testo.
Eseguire l'allineamento senza coma all'interno delle funzioni automatiche prima di reinserire e centrare l'apertura dell'obiettivo e correggere l'astigmatismo dell'obiettivo con EPU. Assicurarsi che entrambi gli allineamenti convergano su valori adatti. Prima di iniziare l'acquisizione automatica, assicurarsi che la turbopompa del caricatore automatico sia spenta e che l'apertura dell'obiettivo sia inserita, se necessario.
Nell'acquisizione automatizzata, premere start run per avviare l'acquisizione automatica dei dati. Utilizzando questo protocollo, le griglie rotte o asciutte possono essere vagliate e scartate nella fase dell'atlante. Un gradiente di ghiaccio è osservato attraverso la maggior parte delle griglie.
Durante lo screening, una distribuzione ideale delle particelle viene monodispersa con una gamma di orientamenti delle particelle visibili. Se il ghiaccio è troppo sottile, può sciogliersi quando illuminato con il fascio di elettroni, causando un movimento eccessivo nella micrografia. Questo è più comunemente osservato quando c'è detersivo nel tampone.
Il ghiaccio deve essere vitreo, quindi le aree della griglia in cui la maggior parte delle immagini mostrano ghiaccio cristallino sono state escluse. È stato incluso un riepilogo grafico dei dati per valutare la qualità delle micrografie e decidere se sono necessarie modifiche alla raccolta dei dati. I selettori di particelle come crYOLO funzionano sufficientemente bene per un primo passaggio dei dati, consentendo la progressione verso la media di classe 2D.
Le classi che mostrano i dettagli della struttura secondaria dovrebbero essere scelte per l'analisi 3D mentre le particelle spazzatura dovrebbero essere scartate. Un sottoinsieme di particelle può essere utilizzato per generare un modello iniziale per la classificazione e il perfezionamento 3D. Nel caso di RagAB, il set di dati conteneva tre conformisti distinti che possono essere separati durante la classificazione 3D.
È importante ricordare che il successo nell'acquisizione dei dati e nelle successive fasi di analisi delle immagini dipende dall'ottenimento e dall'identificazione di griglie ben ottimizzate durante la fase di screening. Una volta ottenuta una mappa di densità EM 3D, può essere ulteriormente interpretata attraverso l'adattamento e la raffinazione di un modello proteico o la costruzione di un modello atomico de novo. L'analisi crio-EM a singola particella consente la determinazione strutturata di molti bersagli che in precedenza non erano possibili.
In particolare, questi flussi di lavoro sono stati recentemente utilizzati per risolvere le strutture delle macromolecole correlate a COVID-19.
