Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del traffico proteico sulla traslocazione nucleare e citoplasmatica nel sistema all'interno del quale l'imaging luminoso non è disponibile. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere applicata come protocollo generale per lo studio del movimento temporale delle proteine senza coinvolgere l'imaging della luce. Da 20 a 24 ore prima del seme dell'infezione da virus 5 volte 10 alle 4 cellule di esplosione del polmone embrionale umano o della fibra HEL per pozzo su uno scivolo sfalsato di quattro ben 11 millimetri e un mezzo di crescita per l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al cinque%.
È importante scuotere accuratamente lo scivolo per garantire una distribuzione uniforme delle cellule, facendo attenzione a evitare di versare il mezzo di coltura. Il giorno dopo, sostituire i supernatanti in modo che le colture confluenti dal 70 all'80% con Medium 199, contenenti 410 unità di formatura della placca per cellula, e posizionare lo scivolo a 37 gradi Celsius con tremori, per un'ora. Al termine dell'incubazione, sostituire i supernaganti con un mezzo di crescita fresco e riportare le cellule nell'incubatrice per l'appropriato periodo di infezione sperimentale.
Per la colorazione immunofluorescente delle cellule infettate da virus, lavare rapidamente le cellule tre volte con PBS. Seguito da un'incubazione da otto a dieci minuti in 200 microlitri di paraformaldeide al quattro per cento in PBS per pozzo. Alla fine della fissazione, lavare le cellule tre volte con 200 microlitri di PBS per lavaggio e permeabilizzare le cellule con 100 microlitri dello 0,2% di tensioattivo non ionico per pozzo per cinque o dieci minuti.
Lavare le cellule permeabilizzate tre volte in PBS come dimostrato e aggiungere 200 microlitri di tampone di blocco a ciascun pozzo per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere la concentrazione appropriata dell'anticorpo primario di interesse per ogni pozzo per un'incubazione a temperatura ambiente di due ore. Alla fine dell'incubazione, rimuovere qualsiasi anticorpo primario non legato con tre lavaggi di dieci minuti in tampone di blocco fresco e aggiungere un anticorpo secondario appropriato a ciascun pozzo per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente, protetta dalla luce.
Al termine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte in un tampone di blocco come dimostrato, seguito da un lavaggio in PBS e aggiungere una goccia di mezzo di montaggio antifade integrato con DAPI ad ogni pozzo. Quindi posizionare un coperchio scivolare sopra lo scivolo e sigillare la pendenza del coperchio con smalto trasparente. L'applicazione di una pressione delicata durante il montaggio dello slittamento del coperchio rimuoverà qualsiasi mezzo di montaggio in eccesso, contribuendo a garantire l'acquisizione di immagini di alta qualità.
Per l'imaging confocale delle cellule infette etichettate, selezionare l'anticorpo secondario appropriato e le lunghezze d'onda DAPI e impostare il formato dell'immagine su 1.024 per 1.024 pixel con una linea media di otto. Quindi immagine ciascuno bene sulla diapositiva a quattro pozzi sotto l'obiettivo 100x. Per contare un gran numero di celle, ottenere da cinque a dieci immagini da campi consecutivi nello stesso pozzo sotto l'obiettivo 40x.
Per analizzare la distribuzione nucleare e citoplasmatica di ICP0, aprire il progetto nel software applicativo confocale e selezionare un'immagine. Aprire la scheda Quantità e selezionare Ordina aree di interesse dal menu Strumenti. Selezionate Disegna linea (Draw Line) e disegnate una linea longitudinale attraverso la cella da analizzare.
Apparirà un istogramma che mostra l'intensità della fluorescenza lungo la linea sia per la proteina di interesse, sia per il DAPI. In base alla colorazione di fondo, impostare una soglia costante per l'intensità della proteina di interesse per l'analisi della distribuzione subcellulare della proteina in ogni esperimento. Se il segnale proteico, in media, è al di sotto della soglia nella regione nucleare, ma è al di sopra della soglia oltre il limite DAPI, categorizzare il segnale proteico come situato prevalentemente all'interno del citoplasma.
Se il segnale proteico è al di sopra della soglia in tutto il nucleo, e oltre il limite del segnale DAPI, raggruppare il segnale proteico come nucleo più localizzazione citoplasmatica. Se il segnale proteico è al di sopra della soglia nel nucleo, ma in media è al di sotto della soglia al di fuori del limite del gruppo di segnali DAPI il segnale proteico come localizzazione nucleare. Infine, tabulare più di 200 cellule infette da ogni campione in diversi punti di tempo di infezione e tracciare i dati in un grafico a barre per illustrare il movimento della proteina di interesse nel tempo.
Come dimostrato, questo metodo facilita l'analisi della traslocazione da nucleare a citoplasmatica delle proteine di interesse. Ad esempio, la proteina cellulare infetta zero o la distribuzione subcellulare ICP0 cambia man mano che un'infezione virale progredisce. Per comprendere gli elementi necessari per il traffico di ICP0 durante l'infezione, i movimenti ICP0 possono essere monitorati in cellule infettate da Wild Type e Mutant Type Herpes Simplex Virus 1 in diverse fasi di infezione, consentendo la valutazione della distribuzione subcellulare di ICP0 in diversi punti di infezione.
È importante ricordare di utilizzare colture monostrato in modo che i virioni abbiano uguale accesso alle cellule e di normalizzare la molteplicità dell'infezione secondo il titolo del virus in modo che la progressione dell'infezione sia paragonabile tra e all'interno dei virus. Dopo ogni sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nei campi della biologia e della virologia cellulare per esplorare il movimento proteico studiando le localizzazioni subcellulari temporali delle proteine di interesse all'interno di una popolazione cellulare.
