We thank Dr. Antonio Virgilio&#160;Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.

1. picco di emissione e Cross-talk Determinazione (vedi anche figura 2) <ol><li> Al fine di determinare i picchi di emissione e la quantità di cross-talk tra il donatore (cumarina derivato V450) e accettore (fluoresceina) coloranti, eseguire scansioni spettrali di cellule marcate con entrambi i fluorofori individuali a 405 nm di eccitazione. </li><li> Determinare un bandwidth 10 nm entro il picco di ogni colorante che verrà utilizzato per i canali donatore e accettore (455-465 nm qui e 525-535 nm). Tracciare l&#39;intensità normalizzata sulla lunghezza d&#39;onda e calcolare la percentuale media di diafonia del colorante donatore nel canale accettore e viceversa (figura 2). </li></ol> 2. Preparazione di Y. enterocolitica ceppi per Cell Culture infezione <ol><li> Utilizzare i seguenti ceppi: WA-314 PMK-ovuli (WA-314 trasformato con i plasmidi PMK-bla 17 e PMK-ovuli 17, rispettivamente) e WA-314ΔYopE PMK-bla (WA-314ΔYopE trasformato con il plasmide PMK-bla 17) </li><li> Almeno due giorni prima l&#39;infezione striscia Y. enterocolitica ceppi WA-314 PMK-ovuli, WA-314 PMK-bla e WA-314ΔE PMK-BLA da crio scorte su piastre LB-agar contenenti antibiotici necessari (kanamicina per WA-314 PMK-bla e WA-314 PMK-ovuli , kanamicina e tetraciclina per WA-314ΔE PMK-bla) e crescere O / N a 27 ° C. Successivamente mantenere le piastre fino a una settimana a 4 ° C. </li><li> Un giorno prima dell&#39;infezione inoculare 3 ml di LB-mezzo contenente antibiotici richiesti con una colonia dei rispettivi ceppi e incubare O / N a 27 ° C in un agitatore a 180 rpm. </li><li> Il giorno di infezione inoculare 2 ml della / coltura O N in 40 ml di LB fresco-mezzo senza antibiotici e incubare per 90 min a 37 ° C in un agitatore a 180 rpm per indurre l&#39;espressione del sistema di secrezione di tipo III. </li><li> Trasferire le culture in un tubo adatto e mantenere le culture in ghiaccio oa 4 ° CD `ora in poi. Centrifugare le colture per 10 min a 5000 xg e 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet batterico in 2-3 ml di PBS freddo ghiaccio. Diluire la sospensione batterica ad una concentrazione di 8 x 10 8 UFC / ml utilizzando uno spettrofotometro. Determinare la corrispondente densità ottica individualmente. Mantenere questa sospensione in ghiaccio fino infettare le cellule HeLa. </li></ol> 3. Cellule placcatura HeLa <ol><li> Un giorno prima seme infezione 1,5 x 10 4 cellule HeLa in DMEM contenente 200 microlitri di siero 10% inattivato al calore fetale bovino (FCS) in pozzetti di una piastra da 96 pozzetti e coltivate in un incubatore CO 2 5% a 37 ° C. Seed tre pozzi per ogni ceppo (tre diversi tempi di incubazione). </li></ol> 4. L&#39;infezione di cellule HeLa e caricamento con CCF4 <ol><li> Infect cellule HeLa aggiungendo 3,5 ml di sospensione batterica al mezzo e mescolare pipettando delicatamente il mezzo due volte. Consentire ai batteri di sedimento sulle cellule ad una MOI (frazione di infezione) di circa 100 batteri per cellula. Per un corso di tempo iniziare infezioni a -90 min, -60 e -30 min min e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% fino 0 min per raggiungere un punto finale comune. </li><li> Quando l&#39;incubazione è terminata, aspirare accuratamente il medium senza rimuovere le cellule HeLa e aggiungere 50 ml di PBS contenente 20 mg / ml di cloramfenicolo per fermare espressione di effettori e probenecid 2,5 mm per ridurre l&#39;esportazione di CCF4. </li><li> A questo punto trasferire la piastra a 96 pozzetti in fase di microscopio e definire punti idonei per una successiva analisi in ciascun pozzetto. Terminate questa fase entro 10 minuti (per i dettagli dell&#39;acquisizione vedere paragrafo 5.1). </li><li> Per bene, aggiungere 70 ml di soluzione di CCF4 / AM carico (soluzione 0,24 ml A, 1,2 ml soluzione B, 18,56 ml soluzione C (soluzione A, B, e C fornite entro CCF4 kit / AM carico) e 50 ml di PBS (contenenti 20 ug / ml di cloramfenicolo e probenecid 2,5 mM) usando un multi pipette e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. D&#39;ora in lavoro senza interruzioni. </li><li> Aspirare la soluzione di carico e aggiungere 100 ml di PBS contenente 20 mg / ml cloramfenicolo e probenecid 2,5 mm con una pipetta a più. Poi il trasferimento rapido della piastra 96 ​​bene nella fase di microscopio e iniziare l&#39;acquisizione entro 10 minuti dalla aspirazione della soluzione di carico. </li></ol> 5. Laser Scanning Microscopy e analisi dei dati <ol><li> Acquisizione di immagini <ol><li> Impostare le condizioni di imaging in modo da massimizzare il numero totale di fotoni e minimizzare fototossicità, photobleaching e cross-eccitazione. <ol><li> In un moderno microscopio confocale a scansione laser, usare un numerico alto obiettivo 20X apertura ad immersione, aprire il rilevatore foro stenopeico di 2,5 unità Airy (ad esempio, a livello di sezionamento ottico), scegliere alta sensibilità GaAsP Rivelatori canali donatore e accettore attivi contemporaneamente, profondità 8 bit , ~ 750 nm dimensione dei pixel, 3 volte telaio media e excite con il 10% di un diodo laser 405 nm. </li><li> Per assicurare una corretta quantificazione impostare il guadagno del rivelatore di entrambi i canali sullo stesso valore e per evitare eventuali pixel saturi. Nota: Qui, i guadagni sono stati fissati al 150%. </li></ol></li><li> Assicurare immersione continua diffondendo mezzo di immersione al fondo dei pozzetti, per esempio con una siringa da 1 ml, ed evitare l&#39;intrappolamento di bolle d&#39;aria. </li><li> Attivare la luce trasmessa e trovare un campo rappresentativo di vista in ogni pozzetto. Utilizzare una fase automatico tarato correttamente e marcare la posizione nel software. </li><li> Dopo la rimozione della piastra per la colorazione (vedere paragrafo 4.3), reinserire la piastra e aggiungere un peso sopra per evitare spostamenti focale. Rivedere le posizioni salvate con la modalità di scansione laser e regolare il fuoco e posizione laterale correttamente. </li><li> Impostare il lasso di tempo di 2 minuti, la durata di 2 ore e iniziare l&#39;acquisizione. </li></ol></li><li> Quantificazione Immagine (esempi sarà dato per Bitplane Softwsono tali da Imaris) <ol><li> Importare il set di dati in un software che permette di calcoli aritmetici di matrici di pixel. A tale scopo, trascinando il file di origine che contiene sia il donatore e il canale accettore sull&#39;icona del software. </li><li> Sottrarre il fondo in entrambi i canali con lo stesso offset. Per fare questo, fare clic su Menu e quindi fare clic su Immagine&gt; produzione&gt; Baseline sottrazione. Selezionare un canale e immettere il valore di base. </li><li> Correggere lo sfiato-through del canale donatore (Ch1) nel canale accettore (Ch2) con il predeterminato correzione del fattore f (vedi 1.1), creando un nuovo canale: Ch2 &#39;= Ch2 - Ch1 * f NOTA: A spurgo attraverso del accettore nel canale donatore non era rilevabile rispetto al livello di rumore. <ol><li> Fare clic su Menu&gt; Elaborazione immagini&gt; Canale Aritmetica e inserire abs (CH2- (ch1 * 0.33)). Successivamente eliminare Canale 2 facendo clic su Menu&gt; Modifica&gt; Elimina Canali. Assicurarsi che ilspurgo attraverso il canale accettore corretto rimane come il nuovo canale 2. Opzionale: Modificare il colore del canale dal grigio al colore originale andando su Menu&gt; Proprietà Modifica&gt; Immagine. Selezionare Channel 4&gt; mappata colore&gt; colore di base e modificarlo, ad esempio,, verde. </li></ol></li><li> Creare un nuovo canale con la seguente operazione per determinare il coefficiente relativo FRET: Ch3 = Ch2 &#39;/ (Ch1 Ch2 +&#39;) <ol><li> Vai a Menu&gt; Elaborazione immagini&gt; Canale Aritmetica e inserire ch2 ./ (ch1 + ch2) </li></ol></li><li> Per una corretta visualizzazione del canale FRET in un&#39;immagine a 8 bit, creare un quarto canale: Ch4 = 255 * Ch3 <ol><li> Vai a Menu&gt; Elaborazione immagini&gt; Canale Aritmetica e immettere 255 * ch3. Cambiare il colore del canale andando su Menu&gt; Proprietà Modifica&gt; Immagine. Selezionare Channel 4&gt; mappata File Table colori&gt; Colore&gt; Jet. </li></ol></li><li> Applicare un filtro mediano 3x3 ai canali CH3 e CH4 that ridurrà il rumore nelle immagini. Per fare questo, fare clic su Menu&gt; Elaborazione immagini&gt; Smoothing&gt; Filtro mediano. Selezionare entrambi i canali e applicare un formato del filtro &quot;3x3x1&quot;. </li><li> Per la quantificazione dei segnali cellulari, rilevare le cellule in Ch4 impostando correttamente l&#39;offset e filtrare le strutture in base alla dimensione di escludere troppo piccole strutture. <ol><li> Selezionare il Surpass Visualizza e fare clic sull&#39;icona &quot;Aggiungi nuove superfici&quot;. Definire i parametri dell&#39;algoritmo di rilevamento nella finestra di superficie. Per l&#39;elaborazione più veloce, attivare la due caselle di controllo &quot;Segmento solo una regione di interesse&quot; e &quot;Processo intera immagine finalmente&quot;. Definire la regione di interesse, modificando le sue dimensioni. </li><li> Selezionare Channel 4 come canale sorgente e impostare la soglia da Thresholding&gt; Sfondo Sottrazione (Contrasto Locale) e impostare un diametro di 10 micron. Impostare la soglia minima intensità manualmente a 0 e la soglia massima al massimo intensity. Filtrare le strutture per area e impostare il valore minimo per esempio, 187 μm². Finire la rilevazione della superficie. </li></ol></li><li> Estrarre i valori medi per intensità di fluorescenza del donatore (Ch1) e il coefficiente relativo FRET (Ch3) e loro deviazioni standard nell&#39;entità cellulare. Per fare questo, andare alle proprietà di superficie. Modificare l&#39;aspetto delle strutture selezionando Surfaces Style / Qualità&gt; Surface. Selezionare tutte le strutture facendo clic sulla scheda filtri. Unificare le strutture rilevate andando a processo di selezione&gt; Unify. Esportare le statistiche di superficie in MS Excel facendo clic sulla scheda statistica&gt; Esporta tutte le statistiche su file. </li><li> Tracciare questi valori nel tempo. Identificare l&#39;intervallo 10 min di pendenza massima di aumento della fluorescenza canale donatore per ogni condizione come un parametro ragionevole per rappresentare la quantità di effettore traslocato. Calcolare la pendenza come m = Δ intensità di fluorescenza del donatore / tempo Δ (min). </li></ol></li&gt; </ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Siamo qui applicato con successo un saggio basato TEM-1 beta-lattamasi giornalista per l&#39;analisi quantitativa dei effettori traslocazione di Y. enterocolitica. Molte diverse varianti di questa tecnica sensibile, specifico e relativamente semplice sono state descritte in letteratura. In questo studio microscopia a scansione laser è stato condotto per il rilevamento più sensibile e preciso dei segnali di fluorescenza. Specificamente la correzione per diafonia tra i coloranti donatore e accettore e ...

III sistemi di secrezione di tipo sono macchine proteina-export specializzata utilizzati da diversi generi di batteri gram-negativi per fornire direttamente le proteine ​​effettrici batteri codificate all&#39;interno delle cellule bersaglio eucariotiche. Mentre il meccanismo secretorio stessa è altamente conservata, insiemi specializzati di proteine ​​effettrici sono evoluti tra le diverse specie batteriche per manipolare percorsi di segnalazione cellulare e facilitare specifiche strategie di virulenza batterica 1. In caso di Yersinia, fino a sette proteine ​​effettrici, i cosiddetti (proteine ​​esterne Yersinia) YOPS, sono traslocato al contatto della cellula ospite e agire insieme per sovvertire le risposte delle cellule immunitarie come la fagocitosi e la produzione di citochine, vale a dire, per permettere la sopravvivenza extracellulare dei batteri 2-4. Il processo di traslocazione è strettamente controllata in diverse fasi 5. E &#39;stabilito che l&#39;attivazione primaria del T3SS è innescata dal suo contatto con il ce bersaglioll 6. Tuttavia, il meccanismo preciso di questa iniziazione deve ancora essere chiarito. In Yersinia un secondo livello di cosiddetta messa a punto di traslocazione si ottiene up- o down-regolare l&#39;attività delle proteine ​​cellulari Rho GTP-binding Rac1 o RhoA. L&#39;attivazione di Rac1 ad esempio invasina o citotossico necrotizzante fattore Y (CNF-Y) porta ad un aumento traslocazione 7-9, mentre la funzione del GAP traslocato YopE (GTPasi attivando proteina) down-regola l&#39;attività Rac1 e diminuisce di conseguenza traslocazione da un tipo di feedback negativo Meccanismo di 10,11. Metodi validi e precisi sono il presupposto per indagare come traslocazione è regolata durante l&#39;interazione cellula ospite Yersinia. Molti sistemi differenti sono stati utilizzati per questo scopo, ciascuno con vantaggi e svantaggi specifici. Alcuni approcci si basano su lisi delle cellule infette, ma non i batteri da diversi detergenti seguita da western blot. The svantaggio comune di questi metodi è che la lisi batterica minore ma potenzialmente inevitabile contamina il lisato cellulare con batteri associati proteine ​​effettrici. Tuttavia, il trattamento di cellule con proteinasi K per degradare proteine ​​effettrici extracellulari e successivo utilizzo di digitonina per lisi selettiva delle cellule eucariotiche sono state proposte per minimizzare questo problema 12. È importante sottolineare che questi test cruciale dipendono anticorpi anti-effector alta qualità, che non sono per lo più disponibili in commercio. I tentativi di utilizzare fusioni traduzionali delle proteine ​​effettrici e proteine ​​fluorescenti come la GFP per monitorare traslocazione non hanno avuto successo probabilmente a causa della struttura terziaria delle proteine ​​globulari fluorescenti e l&#39;incapacità dell&#39;apparato di secrezione a svolgersi prima secrezione 13. Tuttavia, diverse etichette giornalista diversi, come il cya (calmodulina-dipendente ciclasi) dominio del tossina della pertosse Bordetella cyclolysin 14 o Flashtag sono stati utilizzati con successo per analizzare traslocazione. Nel primo saggio di attività enzimatica di cya viene utilizzato per amplificare il segnale della proteina di fusione intracellulare, mentre il tag Flash, un tag brevissimo tetracysteine ​​(4Cys) motivo, permette per l&#39;etichettatura con il colorante Flash biarsenical senza disturbare il processo della secrezione 15. L&#39;approccio applicato qui è stato riportato per la prima volta da Charpentier et al. E si basa sulla conversione intracellulare del Förster Resonance Energy Transfer (FRET) dye CCF4 da traslocati effettore TEM-1 beta-lattamasi fusioni 16 (Figura 1A). CCF4 / AM è un composto cellulare permeanti in cui un derivato cumarina (donatore) e un residuo fluoresceina (accettore) sono collegati da un nucleo cefalosporina. All&#39;entrata passivo nella cellula eucariotica, il non fluorescente esterificati composto CCF4 / AM viene elaborato dalle esterasi cellulari per il CCF4 carica e fluorescente e quindi intrappolatoall&#39;interno della cellula. Eccitazione della porzione cumarina a 405 nm risultati in FRET alla frazione fluoresceina, che emette un segnale di fluorescenza verde a 530 nm. Dopo la scissione del nucleo cefalosporina dal FRET beta-lattamasi è interrotto e l&#39;eccitazione della porzione cumarina porta a blu fluorescenza at460 nm. Differenti applicazioni di questo metodo sono stati descritti in letteratura evidenziando la sua versatilità. Il metodo consente di analizzare traslocazione in vitro e in vivo anche, ad esempio, la tecnica è stata utilizzata in un modello di infezione mouse per individuare le popolazioni leucocitarie mirati per traslocazione in vivo 17-19. Lettura dei segnali può essere condotta utilizzando lettori di piastre, FACS o microscopia a fluorescenza. Da notare, il metodo prevede anche la possibilità di monitorare traslocazione in tempo reale mediante microscopia live-cellulare durante il processo di infezione 20,21. Qui microscopia a scansione laser a fluorescenza è stato applicato per readout di segnali di fluorescenza in quanto fornisce massima sensibilità e precisione. In particolare, la capacità di regolare la finestra di emissione con precisione nanometrica in combinazione con rivelatori ad alta sensibili facilita ottimizzato rivelazione a fluorescenza e minimizzato cross-talk. Inoltre questa configurazione microscopia può essere adattato per il monitoraggio in tempo reale di traslocazione e potenzialmente consente per l&#39;analisi simultanea di interazione ospite-patogeno a livello cellulare. In questo studio i tassi di traslocazione di un Y. enterocolitica ceppo selvatico e una delezione mutante YopE esibendo un fenotipo hypertranslocator 10,11 sono stati analizzati in modo esemplare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1068">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">LB-Agar</td>
			<td style="width:209px;">Roth</td>
			<td>X969.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (black, clear bottom)</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>31966-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8761-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K1095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4895</td>
			<td>Used for peak emission and cross-talk determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560469</td>
			<td>Used for peak emission and cross-talk determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol W immersion oil&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>Refractive index = 1.3339 @ 23 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 7.6 software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Plugins included ImarisXT and MeasurementPro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab compiler runtime</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 5</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of yersinia enterocolitica effector translocation into host cells using beta-lactamase effector fusions

Molti batteri gram-negativi, tra cui patogeno Yersinia spp. Impiegano tipo III sistemi di secrezione di traslocare le proteine ​​effettrici all&#39;interno delle cellule bersaglio eucariotiche. All&#39;interno della cellula ospite proteine ​​effettrici manipolare funzioni cellulari a beneficio dei batteri. Per meglio comprendere il controllo di tipo III secrezione durante l&#39;interazione cellula ospite, dosaggi precisi e sensibile per misurare la traslocazione sono obbligatori. Abbiamo qui descriviamo l&#39;applicazione di un saggio basato sulla fusione di un frammento di proteina effettore Yersinia enterocolitica (Yersinia proteina esterna; YopE). Con TEM-1 beta-lattamasi di analisi quantitativa di traslocazione Il test si basa sulla scissione di una cella permeante FRET dye (CCF4 / AM) da traslocata fusione di beta-lattamasi. Dopo la scissione del nucleo cefalosporine CCF4 dalla beta-lattamasi, FRET da cumarina a fluoresceina viene interrotto e l&#39;eccitazione della porzione cumarina porta a blu emissione di fluorescenza.Differenti applicazioni di questo metodo sono stati descritti in letteratura evidenziando la sua versatilità. Il metodo consente di analizzare traslocazione in vitro e in vivo anche, ad esempio, in un modello di topo. Rilevazione dei segnali di fluorescenza può essere eseguita utilizzando lettori di piastre, analisi FACS o microscopia a fluorescenza. Nella configurazione descritta qui, in vitro traslocazione di fusioni effettrici in cellule HeLa da diversi mutanti Yersinia è monitorato mediante microscopia a scansione laser. Registrazione conversione intracellulare del reporter FRET dalla beta-lattamasi effettori fusione in tempo reale fornisce risultati quantitativi affidabili. Siamo qui Mostriamo dati esemplificativi, dimostrando una maggiore traslocazione da un Y. enterocolitica YopE mutante rispetto al ceppo selvatico.

Per dimostrare la capacità del metodo descritto per analizzare quantitativamente effettrici traslocazione in cellule bersaglio, sono stati studiati due ceppi Yersinia con differenti cinetiche traslocazione: Y. enterocolitica ceppo selvatico WA-314 (sierogruppo O8, l&#39;ospitare il plasmide di virulenza pYVO8 22) e la sua derivata WA-314ΔYopE (WA-314 ospitare pYVO8ΔYopE 23). Lavoro precedente ha mostrato che Y. mutanti enterocolitica privi funzionale mostra Yo...

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Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analisi di<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector traslocazione in cellule ospiti Utilizzando beta-lattamasi Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

analysis-yersinia-enterocolitica-effector-translocation-into-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

8.5K Views.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf. Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

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RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

Lo screening RNAi per fattori di accoglienza che partecipano Vaccinia Infezione da virus utilizzando Drosophila Celle

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1. These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon targets within the eukaryotic cytosol. Some AB toxins travel by vesicle carriers from the cell surface to the endoplasmic reticulum (ER) before entering the cytosol2-4. In the ER, the catalytic A chain dissociates from the rest of the toxin and moves through a protein-conducting channel to reach its cytosolic target5. The translocated, cytosolic A chain is difficult to detect because toxin trafficking to the ER is an extremely inefficient process: most internalized toxin is routed to the lysosomes for degradation, so only a small fraction of surface-bound toxin reaches the Golgi apparatus and ER6-12.

To monitor toxin translocation from the ER to the cytosol in cultured cells, we combined a subcellular fractionation protocol with the highly sensitive detection method of surface plasmon resonance (SPR)13-15. The plasma membrane of toxin-treated cells is selectively permeabilized with digitonin, allowing collection of a cytosolic fraction which is subsequently perfused over an SPR sensor coated with an anti-toxin A chain antibody. The antibody-coated sensor can capture and detect pg/mL quantities of cytosolic toxin. With this protocol, it is possible to follow the kinetics of toxin entry into the cytosol and to characterize inhibitory effects on the translocation event. The concentration of cytosolic toxin can also be calculated from a standard curve generated with known quantities of A chain standards that have been perfused over the sensor. Our method represents a rapid, sensitive, and quantitative detection system that does not require radiolabeling or other modifications to the target toxin.

In this report, we describe how surface plasmon resonance is used to detect toxin entry into the host cytosol. This highly sensitive method can provide quantitative data on the amount of cytosolic toxin, and it can be applied to a range of toxins.

Rilevamento di Traslocazione tossina nel citosol Host Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

In vitro per valutare l&#39;impatto di immunoregolatorio Pathways su HIV-specifica CD4 T effettrici delle cellule di funzione

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alto</sup&gt; T Cells in topi immunodeficienti

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Applicazione di lungo termine colta interferone-γ Enzyme Linked immunospot Assay per la valutazione effettori e memoria delle cellule T risposte a Bovino

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Applicando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per esaminare Effector Translocation efficienza da<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Svelare la funzione di un batterica Effector da un non-coltivabili fitopatogeni Utilizzando un lievito schermo doppio ibrido

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable dry eye animal model to test novel therapeutics to treat autoimmune dry eye conditions. This protocol describes a chronic autoimmune dry eye rat model. Lewis rats were immunized with an emulsion containing lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund&#39;s adjuvant. A second immunization with the same antigens in incomplete Freund&#39;s adjuvant was administered two weeks later. These immunizations were administered subcutaneously at the base of the tail. To boost the immune response at the ocular surface and lacrimal glands, lacrimal gland extract and ovalbumin were injected into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands 6 weeks after the first immunization. The rats developed dry eye features, including reduced tear production, decreased tear stability, and increased corneal damage. Immune profiling by flow cytometry showed a preponderance of CD3+ effector memory T cells in the eyeball.

This report describes a method to induce chronic experimental autoimmune dry eye in Lewis rats through immunization with an emulsion of rat lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund's adjuvant, followed by the injection of lacrimal gland extract and ovalbumin into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands six weeks later.

Un modello di ratto di occhi seccari autoimmuni cronici con un aumento delle cellule T di memoria di Effector in tessuto Eyeball

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Un metodo per valutare le funzioni effettrici Fc-mediata indotte dagli anticorpi specifici di Hemagglutinin di riossidazione

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.