Questo lavoro è stato sostenuto da FWO-Vlaanderen, il progetto IOF IOF10 / stARTT / 027 e Università di Gand Special Research Grant BOF12 / GOA / 014.

Nota: La seguente protocollo trasfezione e co-immunoprecipitazione è stabilito per un formato piatto 9 centimetri Petri. Altri formati sono possibili anche dopo il ridimensionamento del protocollo. 1. Semina del rene embrionale umano (HEK) Cellule 293T <ol><li> Seme della cellule HEK293T un giorno prima trasfezione in 1,2 x 10 6 cellule per 9 centimetri piatto Petri in 12 ml di mezzo modificato Eagle di Dulbecco (DMEM) supplementato con siero fetale di vitello al 10%, 2 mM L-glutammina, 0,4 mM Na-piruvato, 0,1 mM aminoacidi non essenziali, 100 U / ml di penicillina e 0,1 mg / ml di streptomicina. </li><li> Crescere le cellule 16 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Ispezionare visivamente la morfologia e la vitalità delle cellule con un microscopio ottico invertito prima trasfezione. Le cellule devono essere sub-confluenti per una ottimale efficienza trasfezione. </li></ol> 2. calcio-fosfato Trasfezione delle cellule HEK293T Note: Uso 0.5-1 mg di pCAXL-NP o vuoto plasmide pCAXL in combinazione con 1-3 mg di pCAXL-MX1 per 9 centimetri piatto. Utilizzare una pari quantità di DNA plasmidico totale in tutti i campioni; regolare con vuoto plasmide, se necessario. <ol><li> Preparare i seguenti buffer di trasfezione: <ol><li> Preparare Tris-EDTA (TE) con concentrazioni di 1,0 mm Tris-HCl pH 8,0 e 0,1 mM EDTA pH 8.0. </li><li> Preparare BS / HEPES con concentrazioni di 25 mM HEPES (5,96 g / L, 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic), 274 mM NaCl (16 g / L), KCl 10 mM (0,74 g / L), 1.5 mM NaHPO 4 · 12H 2 O (0,5 g / L) e destrosio mM 11,1 (2 g / L). Regolare il pH a 7,05. </li><li> Preparare CaCl 2 / HEPES con concentrazioni di 1,25 M CaCl 2 · 2H 2 O (183,8 g / L) e 125 mM HEPES (29.79 g / L). Regolare il pH a 7,05 con NaOH. </li></ol></li><li> Riscaldare i buffer di transfezione a 37 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare i campioni plasmide diluendo il DNA plasmide in 600 ml di TE.Preparare queste miscele in pozzetti di una piastra da 6 pozzetti. </li><li> Aggiungere 150 ml di CaCl 2 / HEPES in modo saggio goccia ai campioni plasmide e mescolare pipettando 3 volte su e giù. </li><li> Preparare la soluzione trasfezione goccia saggio aggiungendo la soluzione plasmide (TE + DNA + CaCl 2 / HEPES; 750 ml) a 750 ml di buffer di BS / HEPES forniti in un 6-pozzetti fresco. Distribuire la soluzione plasmide uniformemente sul BS buffer di completo benessere contenente / HEPES. </li><li> Agitare la soluzione trasfezione su un agitatore per 90 secondi a 1.000 RPM. </li><li> Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere la soluzione trasfezione (1,5 ml) gocciolamento alle cellule. Utilizzare una micropipetta P1000 a gocciolare la soluzione trasfezione sulle cellule. Disperdere il composto sulla completa 9 centimetri piastra di Petri e scuotere la piastra molto delicatamente. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 6 ore. Quindi rimuovere il supporto per aspirazione e sostituire immediatamente with 12 ml fresco medio, pre-riscaldata. Aggiungere delicatamente il mezzo fresco alle cellule per evitare il distacco delle cellule. Per questo, tenere la punta della pipetta contro il lato del pozzo e delicatamente spingere fuori il mezzo. </li><li> Incubare le cellule per un ulteriore 16 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol> 3. Co-immunoprecipitazione Nota: Eseguire la co-immunoprecipitazione 24 ore dopo la trasfezione. <ol><li> Preparazione del tampone di lisi basso sale e tampone di lavaggio di sale. <ol><li> Preparare una soluzione madre di 2 M N-etilmaleimmide (NEM), pesando la quantità di NEM e sciogliere in etanolo assoluto. Preparare la soluzione di riserva NEM fresco prima dell&#39;uso. ATTENZIONE: NEM è molto tossico, preparare e utilizzare questa soluzione madre in una cappa aspirante. </li><li> Preparare basso tampone di lisi sale a concentrazioni di 50 mm Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 1% NP40 e un cocktail inibitore della proteasi (sciogliere 1 tavolot in tampone di lisi 50 ml). Aggiungere NEM ad una concentrazione finale di 25 mM (cioè, diluire 1:80). Tenere sul ghiaccio dopo aver aggiunto gli inibitori della proteasi e NEM. Nota: aggiungere sempre gli inibitori della proteasi e NEM momento, poco prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare un sale tampone di elevata lavaggio a concentrazioni di 50 mm Tris-HCl pH 8, NaCl 500 mm, 5 EDTA mm e 1% NP40. Si noti che il tampone di lavaggio di sale non contiene NEM. </li></ol></li><li> Preparazione dei lisati cellulari. <ol><li> Rimuovere il supporto e lavare le cellule con 2 ml di ghiaccio freddo fosfato salina tamponata (PBS). Aggiungere molto delicatamente il tampone di lavaggio, come cellule HEK293T staccano facilmente. </li><li> Rimuovere la PBS e aggiungere 600 ml di ghiaccio freddo tampone di bassa lisi sale per 9 centimetri piastra di Petri. </li><li> Incubare le piastre per 20 minuti in ghiaccio. Assicurarsi che le piastre sono tenuti orizzontali, per assicurare una copertura completa della superficie della piastra con tampone di lisi. Agitare delicatamente le piastre ogni 5 min. </li><li> Raccogliere il lisato cellulare in una microcentrifuga da 1,5 mlprovetta e centrifugare per 3 min a 4 ° C e 16.000 xg a pellet frazione insolubile. </li><li> Trasferire la frazione solubile, cioè il lisato cellulare ad un nuovo 1,5 ml provetta e tenere in ghiaccio. Continuare immediatamente con il protocollo di co-immunoprecipitazione, per impedire la dissociazione delle proteine ​​interagenti. Eseguire le seguenti operazioni per quanto possibile su ghiaccio oppure a 4 ° C per limitare l&#39;attività proteolitica nei lisati. </li></ol></li><li> Generazione di immuno-complessi. Nota: In questo passaggio, la proteina di interesse è vincolata dalla anticorpi appropriati. Per studiare l&#39;interazione NP-MX1, utilizzare un anti-NP anticorpo monoclonale mouse. <ol><li> Per ogni campione, miscelare 135 ml di lisato con 2 ml di anticorpo monoclonale anti-NP e 113 ml di tampone di lisi sale basso (volume totale di 250 microlitri). Conservare il lisato rimasto a -20 ° C per ulteriori analisi, come western blotting, per documentare i livelli di espressione del Intera ipotizzatopartner ction nelle cellule transfettate. Nota: In alternativa, misurare la concentrazione di proteine ​​del lisato (ad esempio con reagente di Bradford) e usare una quantità fissa di proteine ​​totali, per esempio, 400 mg, per ciascun lisato. </li><li> Incubare la miscela anticorpi lisato per 3 ore su una ruota che gira a 4 ° C. Questo passaggio può essere esteso ad una notte di incubazione. </li></ol></li><li> Preparazione della proteina G perline. Nota: Le perle di proteine ​​G sono spediti e conservati in etanolo al 20% per la conservazione. Il tallone-slurry normalmente consiste di 50% perle e perline questi devono essere lavati prima di essere utilizzati per immunoprecipitare i complessi immuni. <ol><li> Usare 50 ml di perline, cioè 100 ml di bead-liquami, per ogni campione. Lavare la quantità di perline necessari per tutti i campioni del test co-immunoprecipitazione in un tubo. Tagliare la punta di una punta di pipetta 1 ml per facilitare pipettato la bead-sospensione. </li><li> Centrifugare la proteina G bead-liquami a 8.000 xge 4 ° C per 30 sec. Rimuovere la soluzione di etanolo ed aggiungere un volume uguale di tampone di lisi basso sale. Centrifugare la proteina G tallone-slurry a 8.000 xg e 4 ° C per 30 sec e rimuovere il surnatante delicatamente. Ripetere questa operazione di lavaggio per 3 volte. Nota: Il buffer bassa lisi sale usato per lavare le perline non deve contenere inibitori della proteasi o NEM. </li><li> Stimare il volume di proteine ​​G perline e aggiungere un uguale volume di tampone bassa lisi di sale per fare un nuovo 50% bead-sospensione in tampone di lisi basso sale. </li><li> Per ciascun campione, trasferire 100 ul di tallone-slurry in una nuova provetta da 1,5 ml e memorizzare in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. Attenzione per risospendere il tallone-slurry prima di dividere, come queste perle sedimentano rapidamente al fondo della provetta. </li></ol></li><li> Immunoprecipitazione dei complessi immuni da proteine ​​G perline e la loro eluizione. <ol><li> Prima di utilizzare le proteine ​​G perline per immunoprecipitazione, centrifuga tutte le provette 30 sec a 8000 xg e 4 ° C everificare mediante ispezione visiva che c&#39;è una quantità uguale di perline presente in tutti i campioni. Se necessario regolare la quantità di perline in alcuni dei campioni e centrifugare di nuovo. Scartare il surnatante. Fare attenzione a non disturbare le proteine ​​G perline pellet. </li><li> Centrifugare brevemente i complessi immuni (es., Lisati con anticorpi, 250 microlitri) per 30 secondi a 8000 xg e 4 ° C per raccogliere il campione completa sul fondo della provetta. Trasferire i complessi immuni alla proteina G perline (50 microlitri). </li><li> Incubare 60 min su una ruota che gira a 4 ° C. Non incubare questi complessi immunitari più di 75 minuti con le perline per ridurre legame aspecifico di proteine ​​alle proteine ​​G perline. </li><li> Centrifugare le proteine ​​G (con perle legate complessi immuni) per 30 sec a 8000 xg e 4 ° C e rimuovere il surnatante. Fare attenzione a non disturbare le proteine ​​G perline pellet. Opzionale: memorizzare questo supernatanti a 4 ° C o -20 ° C per una successiva analisi,ad esempio, per stimare la quantità di proteina non legata. </li><li> Lavare le proteine ​​G perline per circa 5 minuti con 900 ml di tampone di lisi di sale. Assicurarsi che le perle sono completamente risospese nel tampone di lavaggio per il lavaggio ottimale. Centrifugare le proteine ​​G perline per 30 sec a 8000 xg e 4 ° C e scartare il surnatante. Ripetere questa operazione di lavaggio 4 volte. Fare attenzione a non disturbare le perline proteine ​​G pellet per evitare la perdita di materiale immunoprecipitato. </li><li> Dopo l&#39;ultima fase di lavaggio, aggiungere 50 ml di tampone campione 2x Laemmli ai talloni, riscaldare la sospensione per 10 min a 95 ° C per eluire i (co) proteine ​​immunoprecipitate. <ol><li> Preparare 10 ml di tampone Laemmli 6x con 1 g di sodio dodecil solfato, 3,5 ml di glicerolo, 3,5 ml di 1 M Tris-HCl pH 6,8 e 420 ml di β-mercaptoetanolo. Regolare ad un volume totale di 10 ml aggiungendo acqua distillata. Diluire 3 volte in acqua distillata per ottenere tampone 2x Laemmli. ATTENZIONE: &amp;# 946; -mercaptoethanol è tossico, preparare e usare tampone Laemmli in una cappa aspirante. </li></ol></li><li> Dopo il riscaldamento, centrifugare le proteine ​​G perline per 30 sec a 8000 xg e conservare i campioni a 4 ° C (a breve termine) o -20 ° C (a lungo termine). </li></ol></li></ol> 4. Analizzare il (co) immunoprecipitati Proteine <ol><li> Visualizzare le proteine ​​presenti nel lisato cellulare e eluato della co-immunoprecipitazione mediante SDS-PAGE e Western blotting 20 21,22. Caricare Tipicamente metà eluato Laemmli su gel. Fare attenzione a non disturbare le perline G proteine ​​pellet quando il prelievo di campioni per il gel di carico. MX1 ed espressione NP sono stati rivelati con un anti-MX1 e anticorpi-NP contro, rispettivamente, 14. Le bande sono state rilevate con chemiluminescenza a base di HRP ed uno sviluppatore pellicola X-ray. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Studiare l&#39;interazione tra le proteine ​​antivirali e ai loro obiettivi virale è molto importante per comprendere i dettagli del meccanismo antivirale di queste proteine. Questo può dare nuove intuizioni come i virus ei loro ospiti co-evoluti e sarà la base per lo sviluppo di nuove strategie antivirali. Il protocollo di co-immunoprecipitazione ottimizzata qui descritto consente di studiare l&#39;interazione tra la proteina del mouse MX1 suo bersaglio virale, la proteina influenza NP. L&#39;aspetto più import...

Resistenza Myxovirus (Mx) proteine ​​sono una parte importante della difesa immunitaria innata contro i patogeni virali. Queste proteine ​​sono grandi GTPases Dynamin simili che sono indotti da tipo I e tipo III interferoni. I corrispondenti geni Mx sono presenti in quasi tutti i vertebrati in una o più copie e loro prodotti genici inibiscono un&#39;ampia gamma di virus, compresi Orthomyxoviridae (ad es., Virus dell&#39;influenza), Rhabdoviridae (ad es., Virus della stomatite vescicolare), Bunyaviridae (es. , virus crosse la) e Retroviridae (ad esempio, il virus dell&#39;immunodeficienza umana-1) 1-4. Non è chiaro come queste proteine ​​riconoscono una così ampia gamma di virus, senza alcuna sequenza primaria apparente condiviso motivi in ​​questi virus. Analizzando l&#39;interazione delle proteine ​​Mx con i loro obiettivi virali, potenzialmente coinvolge complessi di ordine superiore con altri fattori della cellula ospite, aiuterà a comprendere i meccanismi molecolari tCappello si sono evoluti nella corsa agli armamenti tra virus e loro ospiti. L&#39;interazione tra le proteine ​​di mammiferi Mx e target virali è stato studiato più ampiamente per MxA umana. MxA umana può inibire la replicazione di molti virus, tra cui il ortomixovirus influenza A e virus Thogoto. MxA lega complessi ribonucleoproteici virus Thogoto (vRNPs), impedendo così il loro ingresso nucleare, che si traduce nel blocco di infezione 5. Questa interazione tra MxA e Thogoto vRNPs virus è stata dimostrata con il co-sedimentazione e co-immunoprecipitazione esperimenti 6-9. Come proteine ​​Mx ostacolano virus dell&#39;influenza A è meno chiaro. Uno dei problemi principali è che non è semplice dimostrare una interazione tra una proteina Mx e un prodotto genico influenza. Un rapporto ha dimostrato un&#39;interazione tra MxA umana e la proteina NP in influenza A virus cellule infettate 10. Questa interazione può essere visualizzato solo dal co-immunoprecipitation se le cellule erano stati trattati con le ditiobis reticolanti reagenti (succinimidil propionato) prima lisi, suggerendo che l&#39;interazione è transitorio e / o debole. Studi più recenti hanno dimostrato che la sensibilità Mx differenziale di diversi ceppi di influenza A è determinata dall&#39;origine della proteina NP 11,12. In linea con questo, i virus influenzali A possono sfuggire in parte dal controllo Mx mutando residui specifici nella proteina NP 13. Questo suggerisce che l&#39;obiettivo principale del virus dell&#39;influenza per host MX è la proteina NP, probabilmente NP assemblato in complessi vRNP. Tuttavia, nessuno di questi studi più recenti hanno dimostrato una interazione tra influenza NP o vRNPs e sia umana MxA o il mouse MX1. Recentemente abbiamo mostrato, per la prima volta, una interazione tra l&#39;influenza NP e la proteina Mx1 mouse con un protocollo ottimizzato co-immunoprecipitazione 14, che è qui descritto in dettaglio. In generale, i co-mmunoprecipitation è uno degli approcci biochimici più frequentemente utilizzati per indagare le interazioni proteina-proteina. Questa tecnica è spesso preferito su tecniche alternative, ad esempio, due ibridi di lievito, in quanto consente di studiare le interazioni proteina-proteina nel loro ambiente naturale. Co-immunoprecipitazione può essere eseguita su proteine ​​espresse endogenamente se sono disponibili anticorpi contro le proteine ​​di interesse. In alternativa, le proteine ​​di interesse possono essere espressi nella cellula attraverso trasfezione o infezione e un tag di affinità possono essere utilizzati. Oltre ai vantaggi sopra menzionati, il protocollo di co-immunoprecipitazione descritto consente il rilevamento di interazioni deboli e / o transitori proteine. Il componente principale di questo protocollo ottimizzato è l&#39;aggiunta di N-etilmaleimmide (NEM) nel tampone di lisi cellulare. NEM è un reagente alchilante che reagisce con i gruppi tiolici liberi come presente in cisteine, a pH 6,5-7,5, per formare una stabile tio-estere(Figura 1). Al più alto pH, NEM può anche reagire con gruppi amminici o subire l&#39;idrolisi 15. NEM è in genere utilizzato per bloccare gruppi tiolo gratuito, al fine di prevenire la formazione di legami disolfuro o inibire l&#39;attività enzimatica. Ad esempio, NEM è spesso usato per bloccare enzimi desumoylating, che sono cisteina proteasi. Nel protocollo co-immunoprecipitazione descritto, NEM è stato inizialmente incluso nel tampone di lisi perché era stato riferito che la sumoilazione delle proteine ​​influenza può influenzare l&#39;interazione tra proteine ​​virali 16. Inaspettatamente, l&#39;aggiunta di NEM rivelata chiave per documentare l&#39;interazione tra influenza NP e mouse Mx1 mediante co-immunoprecipitazione. Non è chiaro perché l&#39;aggiunta di NEM è cruciale per rilevare l&#39;interazione NP-MX1. Forse l&#39;interazione è troppo transitoria e / o debole. NEM potrebbe stabilizzare l&#39;interazione, ad esempio, conservando una specifica conformazione MX1 una proteina virale o anche un terzo compo sconosciutanente. Tale effetto stabilizzante di NEM è stato osservato in precedenza, ad esempio, per l&#39;interazione tra la ribonucleotide reduttasi M1 e la sua gemcitabina inibitore (F2dC) 17. MX1 e NP entrambi contengono più residui di cisteina che potrebbero essere modificati da NEM. Ad esempio, un recente studio condotto da Rennie et al. Hanno dimostrato che un stalkless MxA variante contiene tre residui di solventi cisteina esposti che possono essere modificate da iodoacetamide. Mutando questi residui di serine non ha influenzato l&#39;attività enzimatica di MxA, ma impedisce l&#39;aggregazione disolfuro-mediata 18. Poiché questi cisteine ​​sono conservati in MX1, questo suggerisce che le cisteine ​​analoghe in MX1 possono essere modificati da NEM e come tale influenza la sua conformazione e solubilità. Inoltre, NEM potrebbe anche influenzare l&#39;attività di GTPasi Mx1, che è essenziale per l&#39;attività anti-influenzale di MX1, stabilizzando così l&#39;interazione tra MX1 e NP. Tuttavia, un effetto diretto di NEM sul GTPase actività di Mx1 è improbabile, come NEM è necessario anche per rilevare l&#39;interazione tra l&#39;influenza NP e GTPase mutanti inattivi della proteina Mx1 14. Chiaramente, sono necessarie ulteriori ricerche per chiarire l&#39;effetto del NEM sull&#39;interazione NP-MX1. In sintesi, il protocollo di co-immunoprecipitazione descritto consente di studiare l&#39;interazione tra la proteina Mx1 antivirale e il suo bersaglio virale, la proteina influenza NP. Questo protocollo può essere utilizzato anche per studiare altre interazioni deboli o transitori che dipendono dalla stabilizzazione specifiche conformazioni proteiche. Interazione proteina-proteina che dipendono conformazioni specifiche sono state descritte in precedenza, ad esempio, per le proteine ​​leganti il calcio come calmodulina 19. Infine, il ruolo benefico di NEM potrebbe essere utilizzato anche in altri metodi che rilevano interazioni proteina-proteina, come saggi co-sedimentazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-3876</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-30212</td>
			<td>also known as NP40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 873 580 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NP monoclonal antibody</td>
			<td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td>
			<td>NR-4282</td>
			<td>ascites blend of clones A1 and A3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RNP polyclonal serum</td>
			<td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td>
			<td>NR-3133</td>
			<td>directed against A/Scotland/840/74 (H3N2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4FF</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0618-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperfilm ECL 18 x 24 cm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9068-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation of the mouse mx1 protein with the influenza a virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

N-etilmaleimmide è un composto organico che può essere utilizzato per modificare irreversibilmente gruppi tiolici liberi, ad esempio per inibire proteasi cisteina (Figura 1). La proteina antivirale Mx1 inibisce la replicazione del virus influenzale A interagendo con la nucleoproteina virale. Il protocollo di co-immunoprecipitazione ottimizzato qui descritto permette di studiare questa interazione NP-MX1. HEK293T cellule sono state trasfettate con vettori di espres...

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Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-immunoprecipitazione della proteina mouse Mx1 con il virus nucleoproteina Influenza A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.6K Views.  VIB. This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Generazione di influenza da virus ricombinante del DNA plasmidi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utilizzando Imaging Bioluminescent per Indagare il sinergismo tra Streptococcus pneumoniae E Influenza A virus in topi neonati

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purificazione per affinità di Complessi virus influenzali ribonucleoproteina dalla cromatina delle cellule infettate

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Influenza Virus Propagazione in embrionate di pollo Uova

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Panni nasale per l&#39;influenza A rilevazione antivirus e isolamento da Suina

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Un miniaturizzato Glycan microarray test per la valutazione avidità e Specificità del virus influenzale A emoagglutinine

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.