Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concedere R01 AI073783 a K. Teter. Ringraziamo il Dott. Shane Massey per l&#39;assistenza nello sviluppo del protocollo di frazionamento subcellulare e Helen Burress per la lettura critica del manoscritto.

1. Preparazione del digitonina <ol><li> Aggiungere 500 ml di etanolo al 100% di una provetta e collocarla in un blocco di calore a 80 ° C per 10 min. </li><li> Sciogliere 2,5 mg di digitonina in 250 ml di etanolo riscaldato per produrre una soluzione madre 1% del digitonina. </li><li> Per generare una soluzione di lavoro del 0,04% digitonina, aggiungere 40 ml di soluzione di riserva digitonina a 960 ml di HCN tampone (50 Hepes mM pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM N-ethylmaleimide, e un inibitore della proteasi cocktail). </li></ol> 2. Intossicazione cellulare e permeabilizzazione Il nostro test traslocazione può essere applicato a una serie di tossine e linee cellulari. Di seguito, forniamo un protocollo dettagliato per la rilevazione di tossina colerica (CT). Una panoramica della procedura è prevista in Figura 1. <ol><li> Cellule HeLa vengono seminate nel 6 pozzetti contenenti 1 ml di DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino e antibiotici antimicoticiper raggiungere 1x10 6 cellule / pozzetto dopo una notte di incubazione a 37 ° C. Per generare abbastanza tossina citosolico per il rilevamento riproducibile, pozzi triplice copia sono necessari per ogni condizione. </li><li> A seguito di una notte di incubazione, sostituire il terreno di coltura con 1 ml di DMEM contenente 100 ng / mL di ganglioside GM1. Questo aumenta il numero di siti di legame per il CT, in quanto il GM1 recettore di CT sarà intercalare nella membrana plasmatica delle cellule esposte ad una soluzione di GM1. </li><li> Dopo una incubazione di 1 ora a 37 ° C, togliere il GM1 contenenti medie e lavare le cellule due volte con DMEM. Allora, posto le cellule a 4 ° C per 30 minuti in 1 ml di DMEM contenente 1 mg / mL di CT. </li><li> Rimuovere la tossina mezzo contenente, lavare le cellule due volte con DMEM, e incubare le cellule in 1 ml di DMEM a 37 ° C per l&#39;intervallo di tempo desiderato (s). </li><li> Alla fine di ogni periodo di caccia, lavare le cellule con PBS e incubare ciascun pozzetto con 250 microlitri di 0.5 mM EDTA in PBS. Lasciate che le cellule sedere per 10<html> minuti a temperatura ambiente e poi togliere dal 6 pozzetti di triturazione vigoroso con un p1000 Pipetman. Dopo un pozzetto di cellule sono stati raccolti, si combinano con il secondo e poi terzo pozzo dalla stessa condizione. Raschiatori cellulare può essere utilizzato anche per raccogliere le cellule. </li><li> Posizionare la sospensione combinato di cellule dai tre pozzi replicare (750 microlitri di volume totale) in una provetta sola, e spin in una microcentrifuga da tavolo per 5 min a 5.000 x g. Pellet cellulari di dimensioni più o meno equivalente deve essere ottenuta per tutte le condizioni. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri della soluzione del 0,04% di lavoro digitonina. Posizionare la sospensione cellulare in ghiaccio per 10 min. </li><li> Spin le cellule digitonina-permeabilizzate a 16.000 xg per 10 minuti in una microcentrifuga da tavolo. Trasferire il citosol frazione contenente benzina supernatante in una provetta fresco, e mantenere l&#39;organulo frazione contenente benzina pellet. </li></ol>titolo &quot;&gt; 3. Preparazione dei campioni <ol><li> Frazioni surnatante citosol contenenti sono diluiti in tampone HCN ad un volume finale di 1 ml. Volumi di campione di almeno 1 mL sono necessarie per garantire l&#39;aria viene estratta dal ciclo campione di 500 microlitri prima dell&#39;iniezione. </li><li> Organello contenenti frazioni di pellet sono risospesi in 1 ml di HCN tampone contenente 1% Triton X-100. Aggiunta di detersivo è necessario per rilasciare il membrana rivestita pool di tossina. </li><li> Standard di tossine a concentrazioni di 100, 10, 1, e 0,1 ng / mL sono preparato in tampone HCN. </li><li> Paralleli di frazioni citosoliche e organelli sono preparati per un esperimento di controllo per confermare la fedeltà della procedura di frazionamento. Frazioni generato come descritto nella Sezione 2 sono risospesi in 20 ml di tampone campione 4x (frazione citosolica) o 120 ml di 1x tampone campione (frazione organello). Volumi equivalenti di ogni frazione sono risolti con sodio dodecil elettroforesi su gel di poliacrilamide solfato e sondato by Western blot per dimostrare il partizionamento di una proteina citosolica nella frazione surnatante e solubile, la proteina ER residente nella frazione pellet 16-19. </li></ol> 4. SPR scivolo preparazione <ol><li> La Reichert SR7000 SPR rifrattometro viene usato per gli esperimenti SPR. </li><li> Impostare un dorato vetrino con un monostrato auto-assemblato nello strumento SPR. Per attivare il sensore di scorrimento, profumato un (v: v) 1:1 soluzione di 0,4 M EDC SSN e 0,1 M sul vetrino per 10 minuti ad un flusso di 41 microlitri / min. Tutti perfusione successive utilizzeranno la stessa portata. </li><li> Per rimuovere l&#39;EDC: buffer di attivazione del Servizio Sanitario Nazionale, lavare la piastra per 5 minuti con PBS contenente 0,05% di Tween 20 (PBST). La piastra contiene ora pastoie ammide reattiva a causa uncapping dal EDC: soluzione NHS. </li><li> Profumato anti-CTA anticorpi sopra la diapositiva sensore attivato a una diluizione di 1:20.000 in 20 mM acetato di sodio (pH 5,5) per 15 minuti. Un calo iniziale nel rifrazione index unità (RIU), si vedrà per effetto della variazione del pH. Questo sarà seguito da un aumento della RIU come l&#39;anticorpo viene catturato dalla amide-reattiva pastoie sul vetrino del sensore. </li><li> Rimuovere l&#39;anticorpo non legato dal vetrino del sensore con un lavaggio PBST 5 minuti. Il segnale prodotto dal RIU anticorpi catturata verrà plateau e stabilizzare, fornendo un nuovo segnale di base. </li><li> Profumato etanolammina 1 M (pH 8,5) sopra il vetrino del sensore per 5 min. Questo tappi e rende inattivi eventuali attacchi non legato lasciato sul vetrino del sensore. </li></ol> 5. SPR analisi dei campioni <ol><li> Per stabilire una lettura di base, PBST perfusione negli legate agli anticorpi sensore per 5 min. </li><li> Perfusione un campione sperimentale o standard tossina sopra il sensore per 300 sec. Rimuovere il ligando dal buffer e PBST profumato sul sensore per altri 200 sec. </li><li> Dopo ogni perfusione, tossina legato viene rimosso dal sensore da un lavaggio 100 sec con PBST a pH 5.0. Ciò restituirà il segnaledi lettura di base iniziale, permettendo così un altro campione da elaborare sul sensore stesso. </li><li> Prima di caricare un nuovo campione, spingere una piccola quantità di aria attraverso il ciclo di campionamento per espellere eventuali residui di liquido dal campione precedente. Utilizzando la procedura descritta in 5,2-5,4, dobbiamo correre fino a 12 campioni su una diapositiva senza sostanziale perdita del segnale di base. </li><li> L&#39;analisi dei dati è effettuata con il software 2 Scrubber, Igor e il software viene utilizzato per la preparazione figura. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati Tossina della pertosse (PT) è una tossina AB che si muove dalla superficie cellulare al pronto soccorso prima della sua Una catena (PTS1) entra nel citosol 3, 12. Come mostrato nella Figura 2, il nostro SPR-saggio basato su traslocazione in grado di rilevare PTS1 nel citosol delle cellule CHO intossicato. Nessun segnale è stato generato dal citosol di cellule unintoxicated, che ha confermato l&#39;anticorpo anti-PTS1 non cross-reagiscono con un componente del citosol ospitante. Ilfrazione citosolica intossicati dalle cellule in presenza di brefeldin A (BFA) non è riuscito a produrre un segnale positivo. BfA tossina impedisce di trasporto al sito di traslocazione ER 6-8, 12, 20-25 e, quindi, una catena di consegna al citosol. Alla fine di ogni esecuzione, la tossina legata è spogliato dalla diapositiva sensore. Questo ha permesso di campioni multipli di essere proiettato su un vetrino singolo sensore e quindi fornito un confronto diretto tra i risultati ottenuti con differenti condizioni sperimentali. CT è un altro AB-tipo, ER-translocating tossina 4. In Figura 3A, CTA1 è stato rilevato nella frazione citosolica da CT-trattate cellule HeLa. Questo ha sottolineato che la nostra metodologia funziona con più tipi di cellule e può essere applicato a qualsiasi tossina per il quale un anticorpo anti-A catena è disponibile. Nessun segnale è stato rilevato quando la frazione citosolica dal CT cellule trattate è stato perfuso su un sensore SPR rivestiti con un anticorpo anti-CTB (Fig. 3B), dimostrando così che la CTA1subunità, ma non la cellula vincolante CTB pentamero entra nel citosol. Figura 3C mostra il segnale dalla frazione organello è fuori scala rispetto al segnale più debole dalla frazione citosolica. Ciò era coerente con la nota inefficienza del CT di trasporto al sito di traslocazione ER 6, 7, che a sua volta limita la quantità di tossina che può raggiungere il citosol. Inoltre, la frazione organello contiene holotoxin CT e ER-CTA1 localizzata, in modo che il segnale risultante SPR per la frazione organello è gonfiato dalla massa aggiuntiva del holotoxin associati CTB pentamero. Quindi, non è pratico per tracciare i dati provenienti dalle frazioni di organello e citosolica sul sensorgram stesso. Il nostro test in grado di monitorare il tempo-dipendente accumulo di traslocato, tossina citosolica (Fig. 4). Le cellule sono state esposte a CT a 4 ° C, una temperatura che permette di tossina legandosi alla membrana plasmatica, ma impedisce l&#39;interiorizzazione della cellula associato tossina. Dopo il removal di tossina non legata, le cellule sono state riscaldate a 37 ° C. Sia il trasporto della tossina al pronto soccorso e A traslocazione catena al citosol può avvenire a questa temperatura. Non tossina è stata rilevata nel citosol 15 minuti dopo il riscaldamento a 37 ° C. Questo riflette l&#39;intervallo di tempo necessario per (i) il traffico holotoxin al pronto soccorso, (ii) A / dissociazione subunità B al pronto soccorso, e (iii) Una catena di esportazione al citosol. Un pool minori di tossina citosolico è stata rilevata dopo 30 minuti a 37 ° C, e le quantità progressivamente crescenti di tossina citosolico sono stati individuati dopo il 45 e 60 minuti inseguimento. Livelli ancora maggiori di tossina citosolico sono stati individuati dopo un intervallo di 5 ore inseguimento 17, dimostrando così un continuo, a lungo termine di consegna delle cellule associate tossina alla citosol ospitante. Il nostro test può anche rilevare l&#39;inibizione della traslocazione di tossine al citosol (Fig. 5). Cellule trattate con il 10% dimetilsolfossido (DMSO), un chaperone chimico che impedisce il Disord termicoEring del isolate CTA1 subunità (T. Banerjee e K. Teter, osservazioni non pubblicate), esposto bassi livelli di CTA1 citosolico rispetto alle cellule controllo non trattato. Svolgimento della tossina Una catena è un prerequisito per traslocazione del citosol 16-18, in modo che il DMSO indotta stabilizzazione del CTA1 di conseguenza impedito il suo movimento dal pronto soccorso al citosol. Il tasso di associazione costante (k a) calcolato da esperimenti di SPR è direttamente proporzionale alla concentrazione di ligando nel buffer di perfusione 14, 15, 26. Così, è possibile determinare la concentrazione di tossina citosolica da un grafico che traccia la K a valori per le norme tossina in funzione della concentrazione di tossine. Questa procedura è stata utilizzata per quantificare il DMSO indotta blocco di traslocazione di tossine presentato in Figura 5: la curva standard generata da concentrazioni note di tossina è stato utilizzato per calcolare un citosolico CTA1 concenione di 0,3 ng / mL per cellule non trattate e 0,1 ng / mL per DMSO cellule trattate (Fig. 6). L&#39;inibizione della CTA1 svolgimento da parte di DMSO così generato una riduzione di 3 volte al pronto soccorso a citosol traslocazione di CTA1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig1.jpg" /> Figura 1. Protocollo panoramica. (A) Le cellule vengono incubate con la tossina AB a 4 ° C, una temperatura che permette di tossina legame alla superficie cellulare, ma impedisce endocitosi tossina. La subunità A e B della tossina sono rappresentati da cerchi rossi e blu, rispettivamente. (B) tossina non legato viene rimosso dal mezzo, e le cellule vengono riscaldati a 37 ° C al fine di promuovere il trasporto endocitosi e retrograda del holotoxin al pronto soccorso. Holotoxin dissociazione si verifica al Pronto Soccorso, che permette la isolato Una catena per entrare nel citosol passando attraverso una proteina-canale di conduzione (s) nella membrana ER. (C) Le cellule vengono trattate con digitonina per permeabilize selettivamente il plasmamembrana. (D) centrifugazione è usata per dividere le celle in parte frazioni citosoliche e organelli. Il citosol è spremuto fuori della cellula attraverso la digitonina generati pori e si trova nel surnatante. Il intatto, legata alla membrana organelli si trovano nella frazione di pellet. (E) Per rilevare la piscina traslocato Una catena di tossina nel citosol di accoglienza, la frazione surnatante è perfuso su un sensore SPR rivestiti con un anticorpo anti-A catena. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig2.jpg" /> Figura 2. Rilevamento di PTS1 traslocazione nel citoplasma ospite. Cellule CHO sono stati marcati con impulsi a 4 ° C per 30 minuti con 1 mg / mL di PT. Le cellule sono state poi inseguito per 3 ore a 37 ° C in terreno privo di tossine che non contengono le aggiunte (ubriaco) o BfA 5 mcg / ml (+ BfA intossicati). Permeabilizzazione della membrana plasmatica con digitonina è stata usata per estratti cellulari in partizione separata organello e citosolica fractions. Un sensore SPR rivestiti con un anticorpo anti-PTS1 è stato utilizzato per rilevare la piscina citosolico di PTS1 da cellule non trattate o trattate con BfA. PTS1 standard sono stati perfusi sul sensore come controlli positivi, mentre la frazione citosolica dalle cellule unintoxicated è stato perfuso sopra la diapositiva sensore come controllo negativo. Alla fine di ogni esecuzione, legato campione è stato spogliato dalla diapositiva sensore. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig3.jpg" /> Figura 3. Rilevamento di CTA1 traslocazione nel citoplasma ospite. Cellule HeLa impulso marcato a 4 ° C con 1 mg / mL di CT sono stati inseguiti per 2 ore a 37 ° C in terreno privo di tossine che non contengono le aggiunte (ubriaco) o BfA 5 mcg / ml (+ BfA intossicati). Permeabilizzazione della membrana plasmatica con digitonina è stata usata per estratti cellulari in partizione separata organello e frazioni citosoliche. (A) Le frazioni citosoliche sono stati perfusi su un sensore SPR rivestiti con un anticorpo anti-CTA. Notoquantità di CTA sono stati utilizzati come controlli positivi, mentre il citosol dalle cellule unintoxicated è stato utilizzato come controllo negativo. (B) La frazione citosolica intossicati dalle cellule in assenza di BfA è stato perfuso su un sensore SPR rivestiti con un anticorpo anti-CTB. A purificata CTB pentamero era perfuso sopra la diapositiva come controllo positivo. (C) La frazione organello è stato solubilizzato con 1% Triton X-100 prima di perfusione nel corso di un sensore SPR rivestiti con un anticorpo anti-CTA. Ai fini comparativi, la frazione citosolica (1 ml di volume finale) dall&#39;estratto stessa cella e uno standard CTA sono stati perfusi sul sensore. Per tutti i pannelli, campione legato è stata spogliata dal sensore alla fine di ogni esecuzione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig4.jpg" /> Figura 4. Cinetica di CTA1 ingresso nel citosol. Cellule HeLa impulso marcato a 4 ° C con 1 mg / mL di CT sono stati inseguiti per 15, 30, 45 o 60 min a 37 ° C in tossina-libero Medium. Per rilevare la piscina traslocato di tossina, frazioni citosoliche da digitonina-permeabilizzate cellule sono state perfusi su un sensore SPR rivestiti con un anticorpo anti-CTA. Standard CTA sono stati perfusi sul sensore pure. Alla fine di ogni esecuzione, legato campione è stato spogliato dalla diapositiva sensore. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig5.jpg" /> Figura 5. Inibizione della traslocazione CTA1 da DMSO. Cellule HeLa impulso marcato a 4 ° C con 1 mg / mL di CT sono stati inseguiti per 2 ore a 37 ° C in terreno privo di tossine che non contengono le aggiunte (ubriaco) o 10% di DMSO (+ DMSO intossicati). Per rilevare la piscina traslocato di tossina, frazioni citosoliche da digitonina-permeabilizzate cellule sono state perfusi su un sensore SPR rivestiti con un anticorpo anti-CTA. Standard CTA (100, 10, 1, e 0,1 ng / mL) sono stati perfusi sul sensore come controlli positivi, solo l&#39;1 e 0,1 ng / mL standard sono mostrate per scopi di scala. Il citosol da unintoxicatecelle d è stato utilizzato come controllo negativo. Alla fine di ogni esecuzione, legato campione è stato spogliato dalla diapositiva sensore. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig6.jpg" /> Figura 6. Calcolo del citosolico CTA1. K uno standard di valori per il CTA di figura 5 sono state tracciate in funzione della concentrazione di tossine. La curva risultante standard è stato utilizzato per determinare, sulla base dei valori di k uno dei campioni sperimentali di figura 5, la concentrazione di CTA1 citosolico in cellule non trattate e trattate con DMSO. Standard di tossina si presentano come cerchi pieni, il citosol non trattata si presenta come una piazza aperta, e il DMSO trattati citosol si presenta come un cerchio aperto. Le medie ± gamme di due esperimenti indipendenti sono mostrati.

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Confronto con metodologia esistente Il nostro SPR-saggio basato su traslocazione rappresenta un metodo rapido, sensibile e quantitativa per rilevare la consegna tossina nel citosol ospitante. La tecnica non richiede radiomarcatura o altre modifiche alla tossina, e può essere applicato a qualsiasi tossina per i quali un anti-tossina A anticorpi catena è disponibile. Gli attuali metodi di monitorare il passaggio della tossina nel citosol anche contare su un protocollo di frazionamento subcellu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Digitonina </td><td> Sigma </td><td> D141 </td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> Siero bovino fetale </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Ganglioside GM1 </td><td> Sigma </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> Sigma </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> Lista </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N-Hydroxysuccinimide) </td><td> Perforare </td><td> 24500 </td></tr><tr><td> EDC (1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22981 </td></tr><tr><td> Etanolammina </td><td> Sigma </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> Anticorpi anti-CTA </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-80747 </td></tr><tr><td> Anticorpi anti-CTB </td><td> Calbiochem </td><td> 227040 </td></tr><tr><td> Anticorpi anti-PTS1 </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-57639 </td></tr><tr><td> Rifrattometro </td><td> Reichert </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR Sensore di diapositive </td><td> Reichert </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> Pompa siringa </td><td> Cole Palmer </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance

Tossine AB consistono in un subunità enzimatica A e una cellula vincolante subunità B 1. Queste tossine vengono secreti nel milieu extracellulare, ma agiscono su bersagli all&#39;interno del citoplasma degli eucarioti. Alcuni viaggi AB tossine da parte dei vettori delle vescicole dalla superficie cellulare verso il reticolo endoplasmatico (ER) prima di entrare nel citosol 2-4. Al pronto soccorso, la dissocia catalitico Una catena dal resto della tossina e si muove attraverso una proteina conduttore canale per raggiungere il suo obiettivo citosolico 5. Il traslocato, citosolica Una catena è difficile da rilevare perché il traffico di tossina al pronto soccorso è un processo estremamente inefficiente: la tossina più interiorizzato viene indirizzato ai lisosomi per la degradazione, in modo che solo una piccola frazione di superficie è legato tossina raggiunge l&#39;apparato di Golgi e ER 6 -12. Per monitorare traslocazione di tossine dal ER al citosol in cellule in coltura, abbiamo combinato un protocollo con il frazionamento subcellulare highly metodo di rilevazione sensibile di risonanza di plasmoni superficiali (SPR) 13-15. La membrana plasmatica delle cellule trattate con tossina è selettivamente permeabilizzate con digitonina, permettendo la raccolta di una frazione citosolica che viene successivamente perfuso su un sensore SPR rivestito con un anti-tossina A anticorpi a catena. L&#39;anticorpo-rivestito sensore in grado di catturare e rilevare pg / mL quantità di tossina citosolico. Con questo protocollo, è possibile seguire la cinetica di entrata tossina nel citosol e caratterizzare effetti inibitori sulla manifestazione traslocazione. La concentrazione della tossina citosolica può anche essere calcolato da una curva standard generata con quantità note di una catena che gli standard sono stati irrorati sul sensore. Il nostro metodo rappresenta un rapido, sistema di rilevamento sensibile e quantitativa che non richiede radiomarcatura o altre modifiche alla tossina di destinazione.

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Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

In questo rapporto, descriviamo come risonanza plasmonica di superficie viene utilizzato per rilevare ingresso tossina nel citosol ospitante. Questo metodo molto sensibile in grado di fornire dati quantitativi sulla quantità di tossina citosolica, e può essere applicata ad una gamma di tossine.

Rilevamento di Traslocazione tossina nel citosol Host Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

detection-toxin-translocation-into-host-cytosol-surface-plasmon

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K Views.  University of Central Florida. In questo rapporto, descriviamo come risonanza plasmonica di superficie viene utilizzato per rilevare ingresso tossina nel citosol ospitante. Questo metodo molto sensibile in grado di fornire dati quantitativi sulla quantità di tossina citosolica, e può essere applicata ad una gamma di tossine.

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Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Il rilevamento del virus infettivo da Campo-zanzare raccolte mediante test coltura cellulare Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

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Immunologia e infezioni

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

Rilevamento di aspergillosi polmonare in pazienti con neoplasie ematologiche maligne utilizzando la tecnologia a flusso laterale

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analisi di<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector traslocazione in cellule ospiti Utilizzando beta-lattamasi Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Applicando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per esaminare Effector Translocation efficienza da<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

rilevamento di<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variante superficie glicoproteina da magnetico cellulare Attivato Ordinamento e citometria a flusso

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

Protocolli per Indagare la distribuzione Host-tessuti, trasmissione-mode, e Effetto sul Fitness ospite di un Densovirus in cotone bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Rilevamento della colonizzazione di Escherichia Coli enteroemorragica in murino Host di sistema Non invasivo In Vivo bioluminescenza

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.

Analisi temporale della traslocazione nucleare--citoplasmico di Herpes Simplex Virus 1 proteina mediante microscopia confocale immunofluorescente

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...