Questi metodi possono essere utilizzati per determinare fattori che influenzano l'invasione dei trofoblasti che possono fornire informazioni sui principali esiti ostetrici avversi. Il vantaggio di questa tecnica è che fornisce un'analisi visiva e quantitativa di diversi fattori che possono influenzare l'invasione dei trofoblasti tra cui la proliferazione e la migrazione. Per iniziare il test dei graffi, seminare il numero appropriato di cellule in una piastra da 24 po 'per ottenere il 100% di confluenza in 48 ore.
Il giorno dopo, cambia i supporti in mezzi liberi rosso fenolo integrati con FBS rimosso dal carbone inattivato dal calore. Il giorno del graffio, aggiungere il trattamento desiderato al supporto in ogni bene per pretrattare le cellule per 30 minuti. Per creare ferite uniformi, posizionare punte sterili di pipetta da 10 microliter sui perni dello strumento di creazione delle ferite.
Abbassare le punte nella prima fila di pozzi e spostare la piastra lungo la pista del produttore della ferita fino a quando le punte delle pipette raggiungono l'altro lato del pozzo. Quindi spostare la piastra di nuovo nella posizione di partenza per garantire una ferita costante attraverso il diametro del pozzo. Abbassare le punte nella riga successiva dei pozzi e ripetere fino a quando tutti i pozzi non sono graffiati.
Verificare che il graffio copra la larghezza del pozzo osservando la piastra al microscopio. Successivamente, aspirare attentamente il supporto e lavare delicatamente le cellule con 1x PBS due volte. Dopo un lavaggio finale, aggiungere il fenolo integrato rosso libero spogliato o basso fbs media con un trattamento desiderato.
Quindi, posizionare la piastra con i pozzi graffiati in un imager automatico timelapse alloggiato in un incubatore che contiene 37 gradi Celsius di temperatura e 5% di anidride carbonica all'atmosfera di umidità del 95%. Immagini le cellule a intervalli regolari in base alle esigenze per consentire alle cellule di completare la guarigione delle ferite. Per iniziare il test di invasione, seminare il numero appropriato di cellule in piastre a sei pozzi in un'incubatrice che mantiene la temperatura di 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica all'atmosfera di umidità del 95%.
Consentire alle celle di raggiungere il 90% di confluenza in 48 ore. Il giorno dopo, cambia i supporti in mezzi liberi rosso fenolo integrati con FBS rimosso dal carbone inattivato dal calore. Mettere una fiala di 10 milligrammi per millilitro matrice extracellulare in un frigorifero sul ghiaccio e lasciare scongelare durante la notte.
Il giorno dopo, utilizzare punte di pipetta refrigerate per diluire 10 milligrammi per millilitro della matrice extracellulare con il mezzo privo di siero rosso fenolo a una concentrazione finale di cinque milligrammi per millilitro. Quindi aggiungere 100 millilitri della matrice extracellulare diluita agli inserti refrigerati che sono stati posizionati nella piastra refrigerata da 24 porri. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per consentire alla matrice di indurirsi.
Per predire le cellule per il test di invasione, lavare le cellule con un millilitro di 1x PBS. Quindi aspirare il PBS e aggiungere 500 microlitri di 1x Trypsin EDTA ad ogni pozzo. Posizionare la piastra a sei pozzi nell'incubatore che mantiene la temperatura di 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica all'atmosfera di umidità del 95% fino a quando tutte le cellule non si sono staccate dal fondo della piastra.
Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere 500 microlitri del supporto privo di siero rosso fenolo ad ogni pozzo delle cellule tripsicinate. Quindi trasferire 1.000 microlitri di cellule staccate su un tubo di microcentrifugo e girare verso il basso per cinque minuti a 400 volte g a quattro gradi Celsius. Successivamente, aspirare il supporto e rimossare le cellule nel supporto privo di siero rosso fenolo.
Contare le celle utilizzando un contatore di celle automatizzato e regolare il volume della sospensione cellulare per una concentrazione finale di 0,5 milioni di cellule per millilitro. Aggiungere 600 microlitri del supporto di crescita completo ad ogni pozzo della piastra da 24 pozza e posizionarlo in esso. Quindi aggiungere 200 microlitri di celle sopra ogni inserto di cella pre-rivestito per un totale di 0,1 milioni di celle.
Posizionare la piastra di 24 pozzi nell'incubatore che mantiene la temperatura di 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica all'atmosfera di umidità del 95% per 24 ore. Dopo l'incubazione notturna, aspirare il supporto rimanente dalle camere superiore e inferiore senza disturbare la matrice extracellulare. Quindi rimuovere con cura la matrice extracellulare e le cellule non invase dalla parte superiore degli inserti con un batuffolo di cotone.
Lavare ogni inserto tre volte aggiungendo 1x PBS alle camere superiore e inferiore del pozzo. Aspirare PBS dopo ogni lavaggio. Per fissare le celle attaccate agli inserti, posizionare gli inserti in metanolo freddo al 100% a quattro gradi Celsius per 30 minuti.
Lavare gli inserti tre volte con 1x PBS e rimuovere PBS dopo il lavaggio finale. Macchiare le cellule attaccate agli inserti con 0,2% di viola cristallo nel 20%etanolo per 10 minuti. Risciacquare con acqua deionizzata tre volte e aspirare acqua deionizzata dopo il lavaggio finale.
Inserti ad aria secca a temperatura ambiente per un'ora. Infine, utilizzando forcep e una lama di rasoio, tagliare con cura la membrana inferiore dell'inserto e montarla su uno scivolo di vetro con il lato inferiore rivolto verso l'alto. Utilizzando un microscopio a luce con un obiettivo 20X, ottenere almeno quattro immagini uniche delle cellule invase per campione.
Per iniziare il test di proliferazione, utilizzare un contatore di celle automatizzato per contare le cellule tripsinziate dal pallone. Cellule di semi in piastre a sei pozzi ad una densità di 0,2 milioni di cellule per pozzo nei mezzi di crescita standard. Quindi posizionare le cellule nell'incubatore che mantiene una temperatura di 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica al 95% di atmosfera di umidità per quattro ore o fino a quando le cellule non hanno aderito.
Successivamente, cambiare il supporto in supporti senza fenolo rosso integrato con fbs spogliato di carbone inattivato dal calore e trattamento desiderato. Posizionare la piastra a sei pozzi nell'incubatore che mantiene la temperatura di 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica all'atmosfera di umidità del 95%. Quindi sostituire il supporto con il supporto fresco integrato con il trattamento desiderato ogni 48 ore.
Dopo 24, 48 o 72 ore di trattamento, lavare le cellule con un millilitro di 1x PBS e aggiungere 500 microlitri di Trypsin EDTA ad ogni pozzo. Posizionare una piastra di sei po 'nell'incubatrice fino a quando le cellule non si sono staccate dalla piastra. Una volta che le cellule si sono staccate dalla piastra, aggiungere 500 microlitri del supporto libero rosso fenolo integrato per disattivare la tripina.
Infine aggiungere cinque microlitri delle cellule tripsicinate a cinque microlitri di Trypan Blue in un tubo separato e mescolare mediante pipettazione. Utilizzare un contatore di celle automatico per contare le celle di ogni pozzo in duplicato. Cigno del primo trimestre umano immortalato.
71 cellule sono state trattate per zero, otto e 18 ore con veicolo 1x PBS o 100 micromolare del desametasone glucocorticoide sintetico nel saggio scratch. Misurazione della dimensione della ferita e della densità della ferita in Swan. 71 e le cellule HTR-8/SVneo trattate con veicolo o 100 dex nanomolare hanno mostrato che il trattamento con dex riduceva il tasso di chiusura della ferita indicando che i glucocorticoidi potevano inibire la migrazione cellulare.
A seguito del saggio di invasione, il trattamento con glucocorticoide ha ridotto l'invasività cellulare, come dimostrato da una riduzione del 15% del numero di Cigni invasi. 71 e cellule HTR-8/SVneo trattate con 100 dex nanomolare per 24 ore rispetto alle cellule trattate con veicolo. A seguito del test di proliferazione cellulare, il trattamento con glucocorticoidi ha ridotto la proliferazione cellulare come indicato da meno Cigno.
71 e cellule HTR-8/SVneo trattate con 100 dex nanomolare rispetto alle cellule trattate con veicolo. I metodi per valutare la morte cellulare potrebbero essere usati in combinazione con questa procedura per determinare se l'apoptosi o la necrosi contribuiscono alle funzioni del trofoblasto alterato. Abbiamo adottato in modo univoco l'uso di tecniche standard abitualmente utilizzate nella biologia del cancro per lo studio della funzione del trofoblasto.
Non ci sono pericoli associati a questi metodi. L'unica precauzione che gli spettatori dovrebbero prendere è usare una tecnica sterile per la coltura tissutale.
