Diese Methoden können verwendet werden, um Faktoren zu bestimmen, die Trophoblast Invasion beeinflussen, die Einblick in wichtige negative geburtshilfliche Ergebnisse bieten können. Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie eine visuelle und quantitative Analyse mehrerer Faktoren bietet, die die Trophoblasteninvasion beeinflussen können, einschließlich Proliferation und Migration. Um den Kratztest zu beginnen, säen Sie die entsprechende Anzahl von Zellen in eine 24-Well-Platte, um 100% Zusammenfluss in 48 Stunden zu erreichen.
Am nächsten Tag, ändern Sie die Medien auf phenolrote freie Medien mit Wärme inaktivierte Kohle dextran entfernt FBS ergänzt. Am Tag des Kratzers, fügen Sie die gewünschte Behandlung zu den Medien in jedem Brunnen, um die Zellen für 30 Minuten zu pziehen. Um gleichmäßige Wunden zu erzeugen, legen Sie sterile 10 Mikroliter Pipettenspitzen auf die Stifte des Wundmacherwerkzeugs.
Senken Sie die Spitzen in die erste Reihe der Brunnen und bewegen Sie die Platte entlang der Spur des Wundmachers, bis die Pipettenspitzen die andere Seite des Brunnens erreichen. Dann bewegen Sie die Platte zurück in die Ausgangsposition, um eine konstante Wunde über den Durchmesser des Brunnens zu gewährleisten. Senken Sie die Spitzen in die nächste Reihe von Brunnen und wiederholen Sie, bis alle Brunnen zerkratzt sind.
Bestätigen Sie, dass der Kratzer die Breite des Brunnens bedeckt, indem Sie die Platte unter dem Mikroskop beobachten. Als nächstes die Medien vorsichtig ansaugen und die Zellen zweimal mit 1x PBS vorsichtig waschen. Nach einer letzten Wäsche, fügen Sie ergänzt phenolrot frei abgestreift oder niedrige FBS-Medien mit einer gewünschten Behandlung.
Als nächstes legen Sie die Platte mit den zerkratzten Brunnen in einem automatisierten Zeitraffer-Imager in einem Inkubator, der 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit Atmosphäre enthält. Stellen Sie die Zellen in regelmäßigen Abständen nach Bedarf ab, damit die Zellen die Wundheilung abschließen können. Um den Invasionstest zu beginnen, säen Sie die entsprechende Anzahl von Zellen in Sechs-Brunnen-Platten in einem Inkubator, der 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit Atmosphäre hält.
Lassen Sie Zellen 90% Zusammenfluss in 48 Stunden erreichen. Am nächsten Tag, ändern Sie die Medien auf phenolrote freie Medien mit Wärme inaktivierte Kohle dextran entfernt FBS ergänzt. Eine Durchstechflasche mit 10 Milligramm pro Milliliter extrazelluläre Matrix in einen Kühlschrank auf Eis legen und über Nacht auftauen lassen.
Verwenden Sie am Tag danach gekühlte Pipettenspitzen, um 10 Milligramm pro Milliliter der extrazellulären Matrix mit den phenolroten freien Serum-freien Medien auf eine Endkonzentration von fünf Milligramm pro Milliliter zu verdünnen. Dann 100 Milliliter der verdünnten extrazellulären Matrix zu gekühlten Einsätzen hinzufügen, die in die gekühlte 24-Well-Platte gelegt wurden. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, damit die Matrix aushärten kann.
Um Zellen für den Invasionstest vorzubereiten, waschen Sie Zellen mit einem Milliliter 1x PBS. Dann aspirieren Sie die PBS und fügen Sie 500 Mikroliter von 1x Trypsin EDTA zu jedem Brunnen. Legen Sie die Sechs-Brunnen-Platte in den Inkubator, die 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit Atmosphäre hält, bis alle Zellen von der Unterseite der Platte gelöst haben.
Sobald sich die Zellen gelöst haben, fügen Sie 500 Mikroliter des phenolroten freien Serums freien Medien zu jedem Brunnen der trypsinisierten Zellen hinzu. Dann 1.000 Mikroliter freigelöster Zellen in ein Mikrozentrifugenrohr geben und fünf Minuten bei 400 mal g bei vier Grad Celsius nach unten drehen. Als nächstes die Medien ansaugen und die Zellen im phenolroten freien Serumfreie Medium wieder aussetzen.
Zählen Sie Zellen mit einem automatisierten Zellzähler und passen Sie das Volumen der Zellsuspension für eine Endkonzentration von 0,5 Millionen Zellen pro Milliliter an. Fügen Sie 600 Mikroliter des gesamten Wachstumsmediums in jeden Brunnen der 24-Well-Platte und legen Sie den vorbeschichteten Einsatz hinein. Fügen Sie dann 200 Mikroliter Zellen auf jedem vorbeschichteten Zelleinsatz für insgesamt 0,1 Millionen Zellen hinzu.
Legen Sie die 24-Well-Platte in den Inkubator, die 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit Atmosphäre für 24 Stunden hält. Nach der nächtlichen Inkubation die restlichen Medien aus den oberen und unteren Kammern ansaugen, ohne die extrazelluläre Matrix zu stören. Dann entfernen Sie vorsichtig die extrazelluläre Matrix und nicht eingedrungene Zellen aus dem oberen Teil der Einsätze mit einem Wattestäbchen.
Waschen Sie jeden Einsatz dreimal, indem Sie 1x PBS sowohl in die oberen als auch in die unteren Kammern des Brunnens einbauen. PBS nach jeder Wäsche aspirieren. Um die an den Einsätzen befestigten Zellen zu fixieren, legen Sie die Einsätze 30 Minuten lang in 100% eiskaltes Methanol bei vier Grad Celsius.
Waschen Sie Einsätze dreimal mit 1x PBS und entfernen Sie PBS nach der letzten Wäsche. Färben Sie die an den Einsätzen befestigten Zellen 10 Minuten lang mit 0,2% Kristallviolett in 20% Ethanol. Spülen Sie mit entionisiertem Wasser dreimal und aspirieren deionisiertes Wasser nach der letzten Wäsche.
Lufttrockene Einsätze bei Raumtemperatur für eine Stunde. Schließlich mit Zange und eine Rasierklinge, sorgfältig schneiden Sie die untere Membran des Einsatzes und montieren Sie es auf einem Glasschlitten mit der untere Seite nach oben. Mit einem Lichtmikroskop mit einem 20-fachen Objektiv erhalten Sie mindestens vier einzigartige Bilder der eingedrungenen Zellen pro Probe.
Um den Proliferationstest zu beginnen, verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler, um die trypsinisierten Zellen aus dem Kolben zu zählen. Samenzellen in Sechs-Well-Platten mit einer Dichte von 0,2 Millionen Zellen pro Brunnen in Standard-Wachstumsmedien. Dann legen Sie Zellen in den Inkubator, die 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit Atmosphäre für vier Stunden oder bis zellen haftet gehalten.
Als nächstes ändern Sie das Medium auf phenolrote freie Medien, ergänzt mit Wärme inaktivierten Holzkohle Dextran abgestreift FBS und gewünschte Behandlung. Legen Sie die Sechs-Brunnen-Platte in den Inkubator, die 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit Atmosphäre hält. Dann ersetzen Sie die Medien durch die frischen Medien, die alle 48 Stunden mit der gewünschten Behandlung ergänzt werden.
Nach 24, 48 oder 72 Stunden Behandlung, waschen Sie Zellen mit einem Milliliter 1x 1x PBS und fügen Sie 500 Mikroliter Trypsin EDTA zu jedem Brunnen hinzu. Legen Sie eine Sechs-Well-Platte in den Inkubator, bis sich die Zellen von der Platte gelöst haben. Sobald sich die Zellen von der Platte gelöst haben, fügen Sie 500 Mikroliter der ergänzten phenolroten freien Medien hinzu, um Trypsin zu deaktivieren.
Zum Schluss fünf Mikroliter der trypsinisierten Zellen zu fünf Mikroliter trypan Blue in einem separaten Rohr hinzufügen und durch Pipettieren mischen. Verwenden Sie einen automatisierten Zellenzähler, um Zellen aus jedem Brunnen in Duplikat zu zählen. Immortalized menschlichen ersten Trimester trophoblast Schwan.
71 Zellen wurden für null, acht und 18 Stunden mit Fahrzeug 1x PBS oder 100 Mikromolar des synthetischen Glukokortikoiddztoxons im Kratztest behandelt. Messung der Wundgröße und der Wunddichte in Swan. 71 und HTR-8/SVneo-Zellen, die mit Fahrzeug oder 100 nanomolar dex behandelt wurden, zeigten, dass die Dex-Behandlung die Rate des Wundverschlusses reduzierte, was darauf hindeutet, dass Glukokortikoide die Zellmigration hemmen könnten.
Nach dem Invasionstest reduzierte die Glukokortikoid-Behandlung die Zellinvasivität, wie eine 15%ige Verringerung der Zahl der eingedrungenen Schwanen zeigt. 71 und HTR-8/SVneo-Zellen, die 24 Stunden lang mit 100 nanomolarer Dex behandelt wurden, im Vergleich zu Zellen, die mit dem Fahrzeug behandelt wurden. Nach dem Zellproliferationstest reduzierte die Glukokortikoid-Behandlung die Zellproliferation, wie sie durch weniger Swan angezeigt wird.
71 und HTR-8/SVneo-Zellen, die mit 100 nanomolaren Dex behandelt wurden, im Vergleich zu Zellen, die mit Fahrzeug behandelt wurden. Methoden zur Bewertung des Zelltodes könnten in Verbindung mit diesem Verfahren verwendet werden, um festzustellen, ob Apoptose oder Nekrose zu veränderten Trophoblastenfunktionen beitragen. Wir haben den Einsatz von Standardtechniken, die routinemäßig in der Krebsbiologie für die Untersuchung der Trophoblastenfunktion verwendet werden, auf einzigartige Weise übernommen.
Mit diesen Methoden sind keine Gefahren verbunden. Die einzige Vorsichtsmaßnahme, die Der Betrachter treffen sollte, ist die Verwendung steriler Technik für die Gewebekultur.
