Questo protocollo chirurgico utilizza un modello di difetto segmentale fisso esternamente coerente e riproducibile per valutare i meccanismi di guarigione dell'osso e l'uso di potenziali terapie rigenerative. Abbiamo semplificato un intervento chirurgico impegnativo per la creazione e la stabilizzazione di un modello segmentale di difetti ossei accessibile ed economico pur rimanendo appropriati per studi di guarigione longitudinale. Questa tecnica è particolarmente traducibile al trattamento di difetti ossei diafisali traumatici di dimensioni critiche che possono beneficiare della stabilizzazione con fissazione esterna, sebbene il modello richieda ulteriori studi.
Per evitare una frattura durante la perforazione dei perni, utilizzare rotazioni elevate al minuto e una bassa pressione per forare la corteccia laterale, quindi diminuire le rotazioni al minuto per avanzare. Dopo aver preparato l'impalcatura da un kit di innesto osseo del tubo proteico morfogenetico osseo, secondo le istruzioni del produttore, utilizzare forbici sterili e un righello sterile per tagliare la spugna di collagene per adattarsi a un difetto di cinque per tre per tre millimetri. Quindi utilizzare una siringa per distribuire uniformemente la soluzione di proteina morfogenetica ossea-2 sulla superficie della spugna, fino a quando l'intero volume della soluzione non viene assorbito.
Successivamente, radere l'area intorno alla gamba posteriore di un ratto anestetizzato usando la tredicesima costola, la zampa posteriore e le mezze linee dorsali e ventrali come margini, seguita da quattro scrub alternati sequenziali della pelle esposta con garza sterile imbevuta di 10%povidone-iodio e 70% di etanolo. Per indurre il difetto femorale, estendere la gamba rasata attraverso un drappo appiccicoso chiaro fenestrato e coprire la panca chirurgica in asciugamani sterili per creare un campo sterile. Palpare il femore e utilizzare una lama numero 15 per creare un'incisione anterolaterale attraverso la pelle che si estende dalla rotula al trochanter maggiore al femore prossimale.
Incidere con cura la fascia laterale della gamba lungo il setto intermuscolare per separare il muscolo vastus lateralis del quadricipite anterioremente dai tendini del ginocchio posteriormente fino a quando il femore laterale non viene esposto. Mantenendo una lama bisturi numero 15 parallela al contorno della superficie ossea, tagliare delicatamente il muscolo lontano dall'osso sottostante per eseguire un'attenta dissezione circonferenziale dei tessuti molli atraumatica e iniziare sulla superficie laterale, esporre il femore alla sua diafisi media. Utilizzare un ascensore periosteale per sollevare il muscolo dall'osso esposto mentre viene sezionato e procedere intorno all'albero femorale fino a quando da sette a 10 millilitri di diafisi centrale sono stati liberati dai tessuti molli su tutti i lati.
Quindi, posizionare un perno appena a livello dell'epicondile laterale, seguito dal posizionamento di una giga a filo al femore distale laterale, e inserire un filo kirschner con punta filettata di un millimetro. Successivamente, mantenendo la posizione della giga sull'osso, identificare dove il perno più prossimale entrerà nell'osso in base ai fori di giga. Incidere con cura parallelamente alle fibre del tendine gluteo secondo necessità per creare un piccolo spazio nel tessuto per far passare il perno prossimale, riducendo al minimo i danni iatrogeni al tendine.
Forare un k-wire non filettato di un millimetro nello spazio e confrontare l'altezza del perno forato con il perno sciolto per confermare che il perno innestare entrambe le cortici. Mantenere la posizione della giga a contatto con l'osso e praticare due k-wire filettati di un millimetro, uno su entrambi i lati del futuro sito dei difetti, assicurando che i perni innescheranno entrambe le cortici e posizionare il livello della barra del fissatore esterno di un centimetro sopra la pelle. Avvitare saldamente, bloccando la barra in posizione e ritagliare le lunghezze dei perni in eccesso.
Posizionare un piccolo retrattore curvo attorno al femore anteriore e posteriore per proteggere il fascio di tessuti molli, muscoli e neurovascolari circostante e utilizzare una lama oscillante sagittale di circa cinque millimetri e luce, anche pressione, per creare con molta attenzione un difetto segmentale di cinque millimetri attraverso la lama oscillante media. Lavare la ferita con 10 millilitri dello 0,9% di soluzione salina normale dopo aver creato il difetto e somministrare 0,1 millilitri dello 0,25% di bupivacaina con epinefrina alla ferita come analgesico e vasocostrittore. Inserire l'impalcatura della spugna imbevuta di proteina morfogenetica ossea-2 nel difetto e utilizzare una sutura assorbibile 4-0 nel semplice modello interrotto per chiudere il piano muscolare.
Quindi chiudere lo strato cutaneo usando una sutura assorbibile 4-0 in un modello sottocuticolare in esecuzione, quindi incollare la pelle per chiudere eventuali spazi intorno ai perni sporgenti e ottenere immediatamente un'immagine radiografica anteriore-posteriore del femore e quattro e 12 settimane dopo l'intervento chirurgico. Difetti di controllo negativi contenenti solo una spugna di collagene non mostrano alcuna prova di osteogenesi ponte tra i bordi ossei prossimali e distali. Una piccola quantità di nuovo rimodellamento osseo può essere vista direttamente adiacente al bordo del femore tagliato, mentre il difetto stesso mostra una mancanza di materiale osseo, la presenza di cartilagine e un certo ematoma residuo.
I difetti contenenti la spugna imbevuta di proteina morfogenetica ossea-2 dimostrano una significativa guarigione ossea già quattro settimane dopo l'intervento chirurgico, come evidenziato dal ponte indifeso radiopasco attraverso il difetto. Entro 12 settimane, si è formata una nuova deposizione minerale significativa in tutto il difetto. Un nuovo osso periosteale significativo può essere osservato nel indivoro che si estende dal bordo del femore tagliato e le spicule dell'osso tessuto e lamellare si sono sviluppate in tutto il difetto.
Inoltre, la deposizione di cartilagine non è vista. L'imaging tramite In Vivo Imaging System dopo la rimozione del fissatore esterno consente la visualizzazione delle cellule trasfette bioluminescenti all'interno del difetto. Ad esempio, le cellule nella cavità midollare luminescenza dopo la trasfezione con codifica mRNA complessa per Gaussia luciferasi, e potrebbero essere utilizzate per misurare i cambiamenti biologici nell'espressione di un gene o proteina di interesse durante il processo di guarigione.
Il posizionamento dei pin è importante per garantire una fissazione esterna stabile e duratura. I perni devono essere direttamente perpendicolari al femore e paralleli l'uno all'altro, per ridurre al minimo la rottura e l'infezione. Utilizzando questo modello, i meccanismi biologici, come specifiche espressioni proteiche, possono essere monitorati per comprendere meglio la guarigione e diversi biomateriali o terapie dell'impalcatura possono anche essere testati per l'efficacia terapeutica.
Speriamo che questa tecnica consenta ai futuri ricercatori di studiare in modo più efficiente ed efficace la guarigione ortopedica con fissazione esterna in modo che i loro risultati possano essere tradotti in migliori successi clinici. Evitare di inalare gas anestetici, indossare dispositivi di protezione individuale adeguati durante la manipolazione di formalina ed EDTA e fare attenzione quando si maneggiano strumenti chirurgici, in particolare il trapano e la sega ossea oscillante.
