Vorremmo ringraziare tutto il gruppo Maurer presso la Washington University, il cui collettivo ha fatto la conoscenza di questo protocollo possibile. Il finanziamento per questo lavoro è fornito dal National Institute of Mental Health (1R01MH085495).

1. Preparazione del Master Patterned (Figura 1) <ol><li> Centrare il wafer di silicio sulla spin-verniciatore e risciacquare il wafer con acetone durante la fase iniziale dei due cicli programma di centrifuga nella tabella 1. L&#39;acetone evapora durante la seconda fase del programma di centrifuga lasciando un pulito, asciutto wafer. </li><li> Applicare circa 1 ml AZ9245 photoresist / a (di diametro) al wafer e spin-coat con le condizioni descritte nella tabella 1. </li><li> Soft-cuocere il photoresist rivestite di wafer a 110 ° C per 2 m con un alta uniforme cottura. </li><li> Photopattern il substrato utilizzando una diretta-scrittura sistema di fotolitografia o di un sistema allineatore maschera e maschera appropriata. Le maschere possono essere acquistati da un certo numero di fonti commerciali. Inoltre, lucidi stampati con inchiostri UV assorbenti, nastro adesivo ad un piano ottico, possono essere utilizzati per la produzione di modelli con caratteristiche di grandi dimensioni. </li><li> Sviluppare la fantasia in wafer 01:02 400K sviluppatore: semiconduttori acqua deionizzata di grado per 1 m 45 s e scuotendo con cautela. Sciacquare abbondantemente con semiconduttori acqua deionizzata di grado e asciugare con un flusso di azoto (N 2) di gas. Modello di sviluppo può essere controllato utilizzando un microscopio con un filtro UV. Se il modello non è pienamente sviluppato, il wafer possono essere restituiti alla soluzione di sviluppo per più tempo. </li></ol> Nota: Per risultati ottimali, photopatterning deve essere effettuata in un ambiente di camera bianca. 2. Preparazione del PDMS Timbro (Figura 2) <ol><li> Preparare una 10:01 in resina peso: miscela indurente di Sylgard 182 (PDMS) e coprire completamente il master (wafer photopatterned) con la miscela in un piatto di Petri usa e getta. </li><li> De-gas-PDMS coperto master in un essiccatore a vuoto fino a quando non bolle sono visibili e permettono il timbro di curare in un forno a 65 ° C per 1,5 h. Prima di curare, è importante assicurarsi che il master è alla base del piatto in quanto può salire in superficie durante la degassificazione passo. </li><li> Tagliare il PDMS eliminare del maestro e tagliare alla dimensione appropriata. Conservare il timbro in un recipiente coperto (lato caratteristica verso l&#39;alto) per proteggerlo dalla polvere e detriti. </li></ol> 3. Preparazione del substrato di oro Patterned (Figura 3) <ol><li> Preparare 25 millimetri no. 1 coprioggetto di vetro rotondo per la deposizione di metallo trattandoli con plasma di ossigeno per 10 m. Sciacquare due volte con 18,2 MΩ acqua deionizzata seguito da due volte con etanolo, asciugare con un flusso di N 2 gas tra un passo. </li><li> Utilizzando un multi-pocket a fascio elettronico sistema di deposizione, deposito del 50 Å titanio seguita da 150 Å oro. Non sfogare l&#39;evaporatore tra deposizione dello strato di titanio e strato d&#39;oro. In alternativa, oro rivestite coprioggetto possono essere acquistati da una varietà di fornitori, però, è importante che gli strati di metallo sono preparati da evaporazione a fascio elettronico ed evaporazione non termica. Se acquistato da una fonte esterna, substrati d&#39;oro può essere pulito per ossidazione del plasma o &quot;Piranha&quot; (07:03 Conc H 2 SO 4: 30%. H 2 O 2) 11 prima dell&#39;uso. </li></ol> Nota: &quot;Piranha&quot; La soluzione è esplosivo in presenza di composti organici. <ol start="3"><li> Preparare la soluzione di stampaggio, 10 hexadecanethiol mM in etanolo assoluto, e la soluzione di riempimento, 1 mM glicole terminata tiolo in etanolo assoluto. </li><li> Sciacquare il timbro con etanolo e asciugare bene con N 2 gas. Applicare stampaggio soluzione al timbro PDMS goccia a goccia fino a completo rivestimento. Asciugare accuratamente con il timbro N 2 gas. Procedere alla 5a o 5b a seconda dei casi sulla base delle caratteristiche del francobollo PDMS. </li><li><ol class="lalpha"><li> Premere delicatamente il timbro sul substrato d&#39;oro e consentire il monostrato di formare per 15 s. </li><li> Posizionare il substrato di oro in una scatola Petri contenente 18,2 MΩ acqua deionizzata, assicurando il substrato è sommerso. Premere delicatamente il timbro sul substrato d&#39;oro e consentire il monostrato di formare per 15 s. </li></ol></li><li> Sciacquare il substrato timbrato due volte con etanolo, asciugare con N 2 gas dopo ogni lavaggio e collocare il substrato in una capsula di Petri. </li><li> Coprire il substrato con soluzione di riempimento e sigillare il piatto con parafilm per evitare l&#39;evaporazione. </li><li> Lasciare che il monostrato di fondo per formare al buio per 12-14 h. </li><li> Rimuovere il coprioggetto modellata dalla soluzione riempimento e lavare due volte con etanolo, asciugare con N 2 gas dopo ogni lavaggio. </li></ol> 4. L&#39;applicazione di proteine ​​e cellule al substrato Patterned <ol><li> Posizionare il coprioggetto fantasia in una piccola scatola di Petri o cultura camera di cellulare e coprire con 500 microlitri di 1 ml di fosfato Dulbecco Buffered Saline (DPBS). Il DPBS deve avvolgere completamente il substrato durante l&#39;incubazione delle proteine ​​per garantire la copertura anche delle proteine. </li><li> Aggiungere una soluzione concentrata di proteine ​​al DPBS e mescolare la soluzione da tuboTing parecchie volte. Incubare la miscela proteica con il substrato a 37 ° C per 1 h. Concentrazioni finali per la laminina e fibronectina sono tipicamente 12 mg / ml e 20 mg / ml, rispettivamente. Proteine ​​possono essere etichettati con una ammina colorante fluorescente reattivi per consentire la visualizzazione schema facile. Tuttavia, le proteine ​​etichettate deve essere miscelato 1:1 con proteine ​​senza etichetta l&#39;etichettatura proteina può interferire con l&#39;attività biologica. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, lavare abbondantemente con il substrato DPBS (4-5x) per rimuovere le proteine ​​non legato, avendo cura di non asciugare il substrato o portarlo in aria-acqua. Dopo i primi tre risciacqui, aggiungere circa 500 ml di mezzi di comunicazione completo crescita cellulare per mantenere un substrato umido. </li><li> Sostituire i mezzi di crescita utilizzata per risciacquare il substrato con mezzi freschi. </li><li> Dissociare e contare le cellule per la placcatura sul substrato. In entrambi i casi le cellule dissociate primari, come i neuroni dell&#39;ippocampo, o linee cellulari immortali, come cellule CHO-K1, possono essere utilizzati. </li><li> Piastra di cellule dissociate sul substrato. Tipicamente 30 a 200 cellule / mm 2 sono utilizzati. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Schema generale per la preparazione di un maestro fotolitografia fantasia. In questo processo, un wafer di silicio viene pulito con acetone, rivestito con photoresist, esposti al modello di interesse, e il modello è sviluppato. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Generali schema per la preparazione timbro PDMS. In questo processo, il maestro fantasia è coperta da Sylgard (10:1 resina: indurente), degassati in un essiccatore a vuoto, curato in forno a 60 ° C, e tagliati su misura. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Schema generale per la patterning substrato. In questo processo, substrati di vetro sono rivestite di titanio (50 bis) e oro (150A) utilizzando un evaporatore a fascio di elettroni, modellata da hexadecanethiol microcontatto stampa con un timbro PDMS, riempito con glicole tioli terminato alcano, e ricoperto con le proteine ​​fluorescenza-etichettati. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Patterned master (A) e PDMS bollo (B), preparati con i metodi descritti. Barre di scala sono 100μm. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. SAM Patterned visualizzati con AlexaFluor 647-etichettati fibronectina (A) e CHO-K1 confinamento delle cellule (B). Barre di scala sono 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Patterned laminina seminato con E18 topo neuroni dell&#39;ippocampo a 4 giorni in vitro. AlexaFluor 350-coniugato anti-laminina anticorpale è utilizzato per la visualizzazione schema (A) e la E18 topo neuroni dell&#39;ippocampo sono colorati con MitoTracker Rosso 580 (B). Barre di scala sono 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Figura 7. Potenziali insidie ​​per la preparazione del substrato fantasia visualizzati da AlexaFluor 647-coniugato fibronectina adsorbimento. (A) porta insufficiente miscelazione delle proteine ​​irregolari. (B) l&#39;applicazione non uniforme della pressione durante stampaggio porta al trasferimento parziale Patten. (C) Una pressione eccessiva durante stampaggio può portare a timbro collasso. (D) Esposizione della superficie modellata all&#39;interfaccia aria acqua durante il risciacquo può provocare delle proteine ​​sfondo. Barre di scala sono 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig8.jpg" alt="Figura 8"/> Figura 8. Patterning sommersi in grado di produrre modelli con caratteristiche di piccole dimensioni che sono difficili da stampare stampa microcontact convenzionale in aria. Immagini (A) e (B) mostrano diverse regioni dello stesso modello, stampato con lo stesso timbro PDMS in aria (A) o acqua deionizzata (B). 10μm a livello di linee di sostegno che circondano il modello (aggiunto per aiutare a prevenire il collasso di bollo) si vedono in (A), tuttavia, le caratteristiche di punti inferiore come mostrato in (B) non si vedono. Questo dimostra che la stampa in aria funziona bene per le grandi caratteristiche, ma la stampa in acqua può essere necessario per i modelli con caratteristiche più piccoli. Barre di scala sono 20 micron. <table border="1"><tbody><tr><td> Ciclo </td><td> Tasso di accelerazione (giri / s) </td><td> Velocità finale (rpm) </td><td> Tempo (s) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 500 </td><td> 1000 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3800 </td><td> 3800 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> Tabella 1.Due cicli programma di centrifuga utilizzata per creare un rivestimento di 4,5 micron di spessore AZ9245 su un wafer di silicio. Per preparare i francobolli PDMS per la formazione di fantasia substrati, un master in photoresist è il primo fabbricato (Figure 1 e 4A). Il master è l&#39;inverso del timbro e viene creato utilizzando una diretta-scrittura o di un sistema di litografia allineatore maschera. Quando un photoresist positivo, come AZ9245, è utilizzato per la produzione di master, la resistenza rivestita wafer viene esposto alla luce con lo stesso modello che apparirà sul supporto finale. Mentre non è sempre possibile, è stato segnalato che il rapporto di aspetto ideale (dimensione caratteristica di resistere spessore) per i maestri timbro PDMS è di 1:2. 13 Abbiamo trovato che proporzioni di 1:40 sono possibili, a seconda della natura del pattern. AZ9245 wafer di silicio ricoperto nelle condizioni descritte qui dare photoresist con uno spessore nominale di 4,5 micron. Abbiamo scoperto che questo spessore di AZ9245 può essere utilizzata per produrre maestri PDMS con caratteristiche che vanno da&gt; 100 micron a 2 micron. Francobolli PDMS sono espressi da Sylgard 182 (o Sylgard 184) con il maestro fabbricato da photoresist (Figura 2). Maestri photoresist può essere utilizzato più volte per creare molte copie dello stesso stampo. Dopo l&#39;indurimento il PDMS, francobolli vengono rimossi dal master utilizzando una lametta e il timbro risultante può essere visualizzato al microscopio mettendo caratteristica lato timbro su un vetrino di vetro (Figura 4B) Una corretta risultati stampaggio in un forte, chiaro modello di proteine ​​che possono essere visualizzati mediante l&#39;applicazione di proteina fluorescente (figure 3 e 5). In alternativa, immunoistochimica può essere utilizzato per visualizzare il modello di proteina dopo la fissazione delle cellule (Figura 6). La crescita delle cellule è ben limitato alla proteina modello per entrambe le linee cellulari immortalizzate e cellule primarie (figure 5 e 6). Mentre questa tecnica è facilmente padronanza, molti problemi comuni possono sorgere. L&#39;applicazione di proteine ​​senza mescolare sufficiente della soluzione proteica concentrata nel DPBS può portare a pattern proteico irregolare (Figura 7A). Stampaggio improprio può portare a trasferire modello di crollo parziale o timbro (Figura 7B-C). Inoltre, esponendo il substrato disegni contenenti proteine ​​adsorbite all&#39;aria possono disturbare il monostrato che causano resistenza diminuita in background (Fig. 7D). Patterns comprende numerose caratteristiche molto piccolo (&lt;5 micron) e proporzioni elevate richiedono spesso l&#39;uso della stampa microcontatto sommerso. In questa procedura acqua (3.5b) è usato come barriera per impedire hexadecanethiol da depositare sul substrato al di fuori del modello (Figura 8) 14.

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Am. Chem. Soc. , 9576-9577 (1995).</li><li>Mrksich, M., Dike, L., Tien, J., Ingber, D., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver.">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental Cell Research. , 305-313 (1997).</li><li>Prime, K. L., Whitesides, G. 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A., Martinez, E., Samitier, J., Errachid, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submerged+microcontact+printing+(S&#x03BC;CP):+An+unconventional+printing+technique+of+thiols+using+high+aspect+ratio,+elastomeric+stamps.">Submerged microcontact printing (S&#x03BC;CP): An unconventional printing technique of thiols using high aspect ratio, elastomeric stamps.</a> Langmuir. , 12060-12063 (2005).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+microcontact+printing+as+a+microlithographic+technique.">Extending microcontact printing as a microlithographic technique.</a> Langmuir. , 2059-2067 (1997).</li><li>Biasco, A., Pisignano, D., Krebs, B., Pompa, P. 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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Un certo numero di problemi possono insorgere nella produzione litografica del master utilizzato per la creazione timbro PDMS. Sottoesposizione di resistere rivestite risultati wafer nei modelli confusa e indistinta e sovraesposizione del resistere rivestite risultati wafer di caratteristiche ingrandita o mancanti. In generale, i maestri con dimensioni caratteristiche di grandi dimensioni (&gt; 10 micron) sono relativamente facili da sviluppare e modello, mentre i maestri con le più piccole caratteristiche possono rich...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Wafer di silicio </td><td> Wafer Reclaim Servizi </td><td></td><td> 2 pollici </td></tr><tr><td> Spin verniciatore / piastra calda </td><td> Brewer Scienza </td><td> Cee 200CB Spin-Bake sistema </td><td></td></tr><tr><td> AZ9245 Fotoresist </td><td> Mays Chemical Company </td><td> 105880034-1160 </td><td></td></tr><tr><td> Diretta-scrittura fotolitografia sistema </td><td> Microtech srl </td><td> LW325 LaserWriter sistema </td><td></td></tr><tr><td> Maschera Aligner </td><td> HTG </td><td> 3HR </td><td></td></tr><tr><td> AZ 400K Developer </td><td> Mays Chemical Company </td><td> 105880018-1160 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 182 Kit silicone elastomero </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 25 millimetri no. 1 coprioggetto di vetro rotondo </td><td> VWR </td><td> 16004-310 </td><td></td></tr><tr><td> Plasma Oxidizer </td><td> Diener </td><td> Femto </td><td></td></tr><tr><td> Titanio pezzi Kamis </td><td> Incorporated </td><td></td><td> 99,95% puro </td></tr><tr><td> Oro pellet </td><td> Kamis Incorporated </td><td></td><td> 99,999% puro </td></tr><tr><td> Evaporatore a fascio elettronico </td><td> Kurt J. Lesker </td><td> PVD 75 film sottile sistema di deposizione </td><td> con fascio elettronico accessorio </td></tr><tr><td> Hexadecanethiol </td><td> Alfa Aesar </td><td> A11362 </td><td></td></tr><tr><td> 1-mercaptoundec-11-il) tetra (etilenglicole) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 674508 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Pharmco-aaper </td><td> 111000200 </td><td> 200 prove, in assoluto </td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> VWR </td><td> 52858-000 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> VWR </td><td> 4500-434 </td><td> Senza calcio e magnesio </td></tr><tr><td> I mouse Laminina </td><td> VWR </td><td> 95036-762 </td><td></td></tr><tr><td> Plasma umano fibronectina </td><td> Invitrogen </td><td> 33016-015 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 647 carbossilico, succinimidile estere </td><td> Invitrogen </td><td> A-20006 </td><td></td></tr><tr><td> MitoTracker Rosso 580 </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 350 carbossilico, estere succinimidile </td><td> Invitrogen </td><td> A-10168 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi anti-laminina </td><td> Fisher Scientific </td><td> AB2034MI </td><td></td></tr></tbody></table>

creating two-dimensional patterned substrates for protein and cell confinement

Stampa microcontact fornisce un metodo rapido e altamente riproducibile per la creazione di ben definite substrati fantasia. 1 Durante la stampa microcontact può essere impiegato per stampare direttamente un gran numero di molecole, tra cui le proteine, DNA 2, 3 e silani, 4 la formazione del sé monostrati-assemblati (SAM) dal tioli alcani a catena lunga in oro fornisce un modo semplice per limitare le proteine ​​e le cellule di specifici modelli contenenti regioni adesivo e resistente. Questo confinamento può essere utilizzato per controllare la morfologia delle cellule ed è utile per l&#39;esame di una serie di domande di proteine ​​e di biologia cellulare. Qui, descriviamo un metodo generale per la creazione di ben definiti i modelli per lo studio delle proteine ​​cellulari 5 Questo processo prevede tre fasi:. La produzione di un maestro di fantasia utilizzando fotolitografia, stampa la creazione di un francobollo PDMS, e microcontatto di un oro- substrato rivestito. Una volta modellato, questi substrati di coltura cellulare sono in grado di confinare le proteine ​​e / o cellule (cellule primarie o linee cellulari) per il modello. L&#39;uso di auto-assemblati chimica monostrato consente un controllo preciso sulla fantasia di proteine ​​/ cella regioni adesive e non adesive regioni; questo non può essere realizzato utilizzando stampaggio diretto delle proteine. Hexadecanethiol, la lunga catena tiolo alcano utilizzato nel passaggio stampa microcontact, produce una superficie idrofoba che assorbe facilmente le proteine ​​dalla soluzione. Il glicol-terminated tiolo, utilizzato per il riempimento non stampate regioni del substrato, crea un monostrato che è resistente a proteine ​​e quindi la crescita delle cellule. 6 Questi monomeri tiolo produrre monostrati strutturate che definire con precisione le regioni del substrato in grado di supportare proteine ​​e la crescita cellulare. Come risultato, questi supporti sono utili per una vasta gamma di applicazioni da studio del comportamento intercellulare 7 alla creazione della microelettronica 8. Mentre altri tipi di chimica monostrato sono stati utilizzati per studi su colture cellulari, compreso il lavoro del nostro gruppo utilizzando trichlorosilanes per creare modelli direttamente su substrati di vetro, 9 monostrati fantasia formato da alcano tioli su oro sono straight-forward per la preparazione. Inoltre, i monomeri utilizzati per la preparazione monostrato sono disponibili in commercio, stabile, e non richiedono la conservazione o la manipolazione in atmosfera inerte. Substrati preparati con fantasia tioli alcano possono essere riciclati e riutilizzati più volte, mantenendo la reclusione cellula 10.

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Monostrati auto-assemblati (SAM) formato da tioli alcani a catena lunga su oro fornire ben definito substrati per la formazione di pattern proteico delle cellule e di confino. Stampa microcontact di hexadecanethiol utilizzando un (PDMS) polidimetilsilossano timbro seguita da riempimento con un glicole-terminated alcano tiolo monomero produce un modello in cui proteine ​​e cellule di assorbire solo alla regione timbrato hexadecanethiol.

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K Views.  Washington University in St. Louis. Monostrati auto-assemblati (SAM) formato da tioli alcani a catena lunga su oro fornire ben definito substrati per la formazione di pattern proteico delle cellule e di confino. Stampa microcontact di hexadecanethiol utilizzando un (PDMS) polidimetilsilossano timbro seguita da riempimento con un glicole-terminated alcano tiolo monomero produce un modello in cui proteine ​​e cellule di assorbire solo alla regione timbrato hexadecanethiol.

Video: Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

Creazione transitori pori della membrana cellulare utilizzando una stampante a getto d&#39;inchiostro standard

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

Ricerca

Bioingegneria

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Patterning cellulare su fotolitograficamente Definito parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrati

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Ordinazione di singole cellule e singola embrioni in 3D confinamento: Un nuovo dispositivo per l&#39;alta Screening contenuti

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Recupero della fluorescenza dopo Fusione di una Droplet misurare la diffusione bidimensionale di un fosfolipide monostrato

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Espansione nanostrutturati Substrati utilizzando la tecnica del punto per Nanotopographical Modulazione di Cell Comportamento

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

Valutazione della proliferazione dei cheratinociti su bi - e tri - dimensionale substrati di collagene di tipo I

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Modellazione della geometria delle colonie di cellule staminali embrionali umane su substrati conformi per controllare la meccanica a livello di tessuto

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Preparazione di proteine che producono cellule sintetiche utilizzando estratti batterici cell free, liposomi e trasferimento di emulsione

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

Analisi spaziotemporale bidimensionale automatizzata di sonde FRET mobili a singola molecola

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine e cellule