Data l'ampia gamma di brevi sequenze peptidiche, questo metodo può essere esteso a molti altri progetti di nanoparticelle. La modifica peptidica può rendere il sistema adatto a scopi diagnostici. L'incapsulamento del platino anti-cancro in farmaci con agente stabilizzante biodegradabile a bassa tossicità è altamente rilevante per le applicazioni farmaceutiche.
Gli studi preliminari in vivo con cancro alle ovaie sono promettenti e saranno ulteriormente studiati. Per iniziare, sospendere 50 milligrammi di cisplatino in quattro millilitri di acqua ultra pura a 60 gradi Celsius. Aggiungere la soluzione di nitrato d'argento per quanto riguarda la goccia alla soluzione di cisplatino e mescolare la miscela a 300-400 giri/min per due ore a 60 gradi Celsius al buio.
Successivamente, utilizzare il 10% in peso acido cloridrico per confermare che non ci sono ioni d'argento liberi in soluzione. Se non si forma cloruro d'argento aggiuntivo all'aggiunta di acido cloridrico, centrifugare la miscela a 3.220 volte la gravità per 10 minuti. Decantare il supernatante e filtrarlo attraverso un filtro siringa da 0,2 micrometri.
Quindi, testare il filtrato per il platino applicando da due a tre gocce a 10 due cristalli di cloruro. Il platino è presente se la sospensione diventa marrone scuro o arancione. Successivamente, aggiungere 13,3 milligrammi di idrossido di sodio in un millilitro d'acqua in sospensione di 94,2 milligrammi di acido oleico in tre millilitri di acqua a 60 gradi Celsius.
Mescolare la miscela per due ore a 60 gradi Celsius. Quindi, spegnere il fuoco e continuare a mescolare a temperatura ambiente per 16-24 ore per ottenere il prodotto grezzo come precipitante oleoso giallo-marrone. Centrifugare la miscela di reazione a 3.220 volte la gravità per 10 minuti e rimuovere il supernatante.
Asciugare i prodotti su un evaporatore rotativo a 25 gradi Celsius. Sospendere il prodotto grezzo in cinque millilitri di acetonitrile vortice e recuperando il prodotto mediante centrifugazione. Ripetere questo processo di lavaggio almeno altre due tre volte per ottenere il coniugato puro di acido oleico platino II come solido giallo pallido.
In primo luogo, immergere 5,7 grammi di resina Wang funzionalizzata A L-fenilalanina protetta da Fmoc in 25 millilitri di dimetilformamide per un'ora. Quindi, immergere la resina in 15 millilitri di piperidina al 20% in DMF per cinque minuti mentre si trema a 80 giri/min per de-proteggere l'ammina. Scolare la resina e ripetere la deprotezione per 20 minuti.
Lavare la resina con DMF e alcol isopropile in seguito. Una volta confermata la deprotezione, aggiungere L-tirosina TBTU e DIPEA protetti da Fmoc e agitare la miscela per 16-24 ore per eseguire l'accoppiamento. Lavare la resina con DMF e alcol isopropile.
Eseguire il test Kaiser e continuare con la protezione e il lavaggio come descritto in precedenza. Coppia e de-proteggere Fmoc protetto lisina allo stesso modo. Lavare la resina con DMF, IPA, metanolo, diclorometano e etere dietile in seguito.
Mettere da parte un grammo di resina portante KYF per la modifica FITC. Immergere la resina rimanente in acido trifluoroacetico al 95%. 2,5% di triisopropilsilano e 2,5% di acqua per tre ore per scindere il tripeptide dalla resina.
Precipitare il peptide grezzo con etere dietile raffreddato a 20 gradi Celsius. Lavare il precipitato tre volte con centrifugazione in porzioni da 30 a 40 millilitri di etere dietile freddo e asciugarlo sotto vuoto. Quindi, mescolare il grammo rimanente di resina KYF con 120,1 milligrammi di acido 6-acetoesanoico in 30 millilitri di DMF con TBTU e DIPEA.
Agitare la miscela per 16-24 ore a temperatura ambiente per ottenere il tripeptide modificato azide. Quindi, combinare 253 milligrammi di questa resina con 3,78 milligrammi di rame solido(I)ioduro 71,9 milligrammi di propargil florisean e 2,24 milligrammi di DIPEA. Lasciare reagire la miscela tremando per 24 ore.
Quindi, lavare accuratamente la resina portante KYF modificata FITC. Scindere il KYF modificato FITC dalla resina e purificarlo allo stesso modo del tripeptide non modificato. Per iniziare a preparare la nanoemoulsione, sciogliere 10 milligrammi dell'acido oleico platino II coniugato in 1,5 millilitri di IPA.
Disegna questa soluzione in una siringa da 5 millilitri, attacca un ago calibro 20 e monta la siringa su una pompa per siringhe sopra l'area di reazione. Impostare la pompa della siringa su 0,1 millilitri al minuto. Per una nanoemulsione con KYF modificato FITC, sciogliere un milligrammo di KYF modificato FITC e un milligrammo di KYF non modificato in 20 millilitri di acqua.
Per una nanoemulsione con KYF non modificato, sciogliere invece due milligrammi di KYF in 20 millilitri di acqua. Riscaldare la soluzione KYF modificata o non modificata FITC a 37 gradi Celsius. Assicurarsi che la soluzione KYF si mescola a circa 400 giri/min e che la siringa sia allineata alla soluzione.
Quindi, avviare la pompa della siringa per iniziare ad aggiungere l'acido oleico platino due coniugati goccia saggio. Una volta aggiunto il coniugato, ridurre la velocità di agitazione a 150 giri/min e lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente. Continuare a mescolarlo per 16-24 ore.
Quindi, concentrare la nanoemulzione in un'unità filtrante centrifuga da 10.000 Dalton. Lavare la nanoemulsione in un'unità filtrante centrifuga tre volte con quattro porzioni milliliter di acqua ultrapura. E poi conservarlo come una soluzione acquosa a quattro gradi Celsius.
Il prodotto finale è opalescente per le nanoparticelle KYF e fluorescente per nanoparticelle modificate fitc. Le goccioline in una nanoemulsione preparata con KYF non modificato erano sferiche, ben disperse e di dimensioni relativamente uniformi. Basati su immagini di microscopia elettronica a trasmissione, i nuclei avevano un diametro di circa 107 nanometri.
La nanoemulsione modificata dal FITC, che appare qui in verde, potrebbe entrare nelle cellule di varie linee cellulari tumorali ovariane. Mentre il diametro idrodinamico di entrambe le formulazioni è aumentato durante quattro mesi di stoccaggio in acqua, le dimensioni complessive sono state preservate. Inoltre, dopo una giornata di incubazione nel siero bovino fetale non è stata osservata alcuna opsonizzazione dell'emulsione.
Il rilascio di platino dall'emulsione è stato più lento a pH 7.4 con solo il 20,8% del platino rilasciato dopo quattro ore. Il rilascio di platino accelerò con la diminuzione del pH. La nanoemulsione rivestita di KYF contenente platino ha ridotto la vitalità di queste linee cellulari tumorali ovariane in misura molto maggiore di quella raggiunta dal carboplatino, l'analogo clinicamente rilevante.
La nanoemulsione ha anche mostrato una riduzione di vitalità paragonabile o maggiore rispetto alla cisplatino in cinque delle sei linee cellulari. La nanoemulsione rivestita di KYF ha costantemente indotto una riduzione di vitalità paragonabile o maggiore rispetto al solo coniugato di platino II dell'acido oleico. Questo è un metodo semplice ed efficiente per incapsulare le terapie idrofobiche all'interno dell'impalcatura della nanoparticella di base tripeptide.
I peptidi corti sono biodegradabili e hanno una bassa tossicità, che è significativa per la medicina e la biotecnologia. Eseguire questa procedura sotto la cappa dei fumi per evitare l'esposizione a solventi organici. L'acido oleico di platino e le nanoemulsioni di platino KYF hanno proprietà anti-cancro e quindi devono essere maneggiate con particolare cura.
Questo metodo è semplice in termini di bassa attività filabilator e attrezzature, tuttavia si basa sulla corretta applicazione della strategia di sintesi e dei concetti chimici sottostanti. Il nostro metodo può essere esteso per fornire altre piccole molecole di farmaci. Il nucleo della nanoparticella è costituito da acido oleico e quindi è adatto per l'incapsulamento di agenti idrofobici.
