Questo protocollo descrive la raccolta di dati massivi dal microarray legante proteina-DNA per la primasi, un enzima che si lega transitoriamente a specifiche sequenze di DNA e a sua volta catalizza la formazione di primer di RNA. Questo video coprirà come la tecnologia microarray può aiutare a ridefinire i siti di riconoscimento delle sequenze primase e come un approccio ad alta produttività può completare la biochimica classica. Questa tecnica combina due approcci: il microarray legante il DNA primase e il test dell'attività primase.
Il microarray fornisce dati massicci di legame primase alle sequenze di DNA, dove come saggio biochimico fornisce informazioni sulla formazione del primer dell'RNA da parte del primase del DNA. L'attività enzimatica testata dipende dall'intuizione dell'esperimento del microarray e dalla sua minore produttività nella sua natura. Viene sondato il legame tra l'efficienza del legame, la selezione della sequenza del DNA e l'attività dell'enzima.
L'identificazione della determinanza della sequenza mediante microarray, ci permette di trarre conclusioni accurate basate su dati massicci del microarray. Questo approccio è stato utilizzato finora per descrivere sequenze di legame del DNA di fattori di trascrizione. I fattori di trascrizione sono proteine statiche che si legano strettamente al DNA.
A dimostrare la procedura sarà Stefan Ilic. Per iniziare questa procedura, pre bagnare lo scivolo di microarray posizionandolo in un barattolo di coplin contenente lo 0,01%Triton-X 100. E ruotando su un rotatore da laboratorio, aggiungere 125 giri/min per cinque minuti.
Pipettare la soluzione di blocco in una scatola di plastica. Quindi rimuovere la diapositiva del microarray dal barattolo di coplin. Utilizzare una salvietta fine per guidare il lato non DNA e i bordi dello scivolo.
Posizionare lentamente il microarray nella scatola di plastica. Incubare a temperatura ambiente per un'ora con scuotimenti lenti. Successivamente, lavare la diapositiva una volta con 0,01%Tween-20 in PBS.
Su un rotatore di laboratorio a 125 giri/min per cinque minuti. Rimuovere tween-20 e sciacquare la diapositiva una volta con 0,01%Triton-X 100 in PBS su un rotatore di laboratorio a 125 giri/min per due minuti. Quindi trasferire rapidamente la diapositiva in un barattolo di coplin contenente PBS.
Innanzitutto, assemblate la camera PMB come delineato nel protocollo di testo. Posizionare la diapositiva nello spazio designato. Usa le pinzette per spingerlo verso il basso e a sinistra.
Posizionare la guarnizione in silicio sopra, assicurandosi che sia ben allineata con la parte inferiore della camera PBM. Quindi chiudere la camera e stringere le viti in diagonale. Pipettare la miscela di legame proteico in ogni pozzo della guarnizione.
Quindi, incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Per iniziare, pipetta 0,05%Tween-20 in PBS nella camera PBM per lavare brevemente il vetrino. Utilizzando un aspiratore sottovuoto, rimuovere la soluzione dai pozzi della camera facendo attenzione a non toccare le macchie di DNA.
Ripetere questa ripetizione, lavare brevemente la diapositiva con PBS. E utilizzare il vuoto per rimuovere la soluzione dai pozzi della camera facendo attenzione a non toccare le macchie di DNA. Quindi, aggiungere Alexa 488 coniugato anti-His Antibody ad ogni pozzo della camera PBM.
Incubare al buio a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, lavare brevemente lo scivolo all'interno della camera PBM aggiungendo alcune gocce dello 0,05% Tween-20 in PBS in ogni pozzo. E utilizzare l'aspiratore di vuoto per rimuovere la soluzione dai pozzi della camera, facendo attenzione a non toccare le macchie di DNA.
Smontare la camera PBM e rimuovere la diapositiva. Risciacquare le diapositive due volte nello 0,05%Tween-20 in PBS, con ogni risciacquo della durata di tre minuti. Quindi, sciacquare le diapositive due volte in PBS, con ogni risciacquo della durata di tre minuti ciascuno.
E una volta in doppia acqua distillata per tre minuti. Asciugare gli scivoli con aria compressa. E conservarli in una scatola di diapositive scura fino a quando non sono pronti per la scansione.
Quando è pronto, utilizzare uno scanner microarray per scansionare il chip con un'eccitazione di 495 nanometri e un'emissione di 19 nanometri. E raccogliere l'intensità mediana della fluorescenza. In questo studio la profilazione del primase a velocità effettiva pi greco viene utilizzata per mappare i siti di legame primase, compresi quelli difficili se non impossibili da osservare usando strumenti classici.
È importante sottolineare che la profilazione primase della velocità effettiva pi greco consente la rivisitazione della comprensione tradizionale dei siti di associazione primase. In particolare la profilazione del primase a produttività pi greco rivela specificità vincolanti oltre alle sequenze di riconoscimento 5'GTC3', che portano a cambiamenti nelle attività funzionali del primase del DNA T7. Vale a dire, vengono identificati due gruppi di sequenze.
Forti sequenze di DNA leganti che contenevano TG nei fianchi e deboli sequenze di DNA leganti che contenevano AG nei fianchi. Non è stato rilevato alcun legame primase con modelli di DNA che mancavano 5'GTC3' all'interno delle loro sequenze. I siti di riconoscimento del DNA primase che contengono caratteristiche specifiche come i fianchi ricchi di TG, aumentano il legame del DNA primase fino a 10 volte.
Sorprendentemente, aumentano anche la lunghezza dell'RNA appena formato. È importante sottolineare che la profilazione del primase ad alta produttività ci consente di osservare e quantificare la variabilità nella lunghezza del primer in relazione alla sequenza del modello di DNA. Quando si esegue questa procedura, le fasi di lavaggio dovrebbero essere sottili.
E i buffer dovrebbero contenere componenti che hanno registrato il primase sul DNA. Anche una soglia di inutili eventi di legame è determinata biochimicamente. Pertanto l'analisi del microarray è insufficiente.
Metodi come una risonanza plasmatica superficiale e test di spostamento del gel possono determinare l'affinità di legame del primase per selezionare le sequenze di DNA. Il mio laboratorio implementa modelli di previsione dell'apprendimento automatico per rilevare determinanti della sequenza primase che producono primer produttivi che possono essere estesi dalla DNA polimerasi. Nell'era dei big data, implementazione di metodi statistici per analizzare i big data, la tecnica aiuterà sicuramente a caratterizzare meglio specifiche sequenze di DNA e collegare il riconoscimento della sequenza all'attività del primase.
Chiunque lavori con radiazioni dovrebbe avere una conoscenza approfondita delle normative e dei rischi associati all'uso delle radiazioni ionizzanti. Dovrebbe seguire una formazione e dovrebbe lavorare con attrezzature di sicurezza.
