Questo progetto è stato di supporto in parte dalla Johns Hopkins University, Ufficio del prevosto tramite il gateway Science Initiative e Qiagen Inc.

Introduzione: Una singola colonia batterica dovrebbe essere utilizzata per inoculare un appropriato brodo di coltura che viene incubata per una notte. Un pellet batterico viene quindi elaborato per purificare il DNA genomico usando un kit di isolamento genomico disponibile in commercio. Il DNA genomico purificato deve avere un rapporto di 260/280 (nm)&gt; 1.8 per assicurare che il campione sia esente da contaminazione proteica. La quantità di DNA genomico richiesto per la generazione del modello pirosequenziamento è 10-20 ng. A. Amplificazione del Template (PyroMark PCR Handbook; <a href="http://www.qiagen.com/handbooks" target="_blank">www.qiagen.com / manuali</a> 1) Impostazione della reazione di PCR Nota: Una mano di fondo deve essere biotinilato alla sua estremità 5 &#39;, e si raccomanda che sia HPLC purificato per la preparazione del modello. Si consiglia l&#39;PyroMark Assay Software Design 2.0 per PCR e SEprogettazione Primer sequenza che sono ottimizzati per il sequenziamento di breve lettura, tuttavia, Primer-BLAST ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome</a> ) da NCBI può anche essere utilizzato per la progettazione primer. <ol><li> Scongelare tutte le soluzioni necessari (elencati nella Tabella 1) e mescolare ogni accuratamente. Impostare la reazione in base alla tabella 1. Tutto il lavoro può essere fatto a temperatura ambiente. </li></ol> Nota: La PCR Master Mix contiene MgCl 2 per una concentrazione finale di 1,5 mM, che fornisce risultati soddisfacenti nella maggior parte dei casi. Se un maggiore Mg 2 + è richiesta concentrazione, fino a 3,5 ml di 25 mM MgCl2 può essere aggiunto a una reazione. <ol start="2"><li> Mescolare bene la miscela di reazione pipettando gentilmente su e giù, poi Versare volumi appropriati in provette PCR. </li><li> Aggiungi tEmPLate DNA per ogni provetta PCR. Si consiglia di 10 ng di DNA genomico. </li><li> Programmare il termociclatore secondo la Tabella 2. Una presa finale a 4 ° C è raccomandato per convenienza. Se si utilizza un termociclatore senza coperchio riscaldato, reazioni di sovrapposizione con 100 ml di olio minerale. </li><li> Mettere le provette PCR nel termociclatore e avviare il programma di ciclismo. </li></ol> B. Vacuum Workstation protocollo Immobilizzare i prodotti di PCR biotinilato <ol><li> Fare un master mix secondo la Figura 4. </li></ol> Nota: Prima di pipettaggio, agitare delicatamente la bottiglia di streptavidina perline rivestite Sepharose per garantire una sospensione omogenea. <ol start="2"><li> A seconda del volume del prodotto di PCR utilizzato, dispensare 60-75 microlitri master mix in ciascun pozzetto di una piastra per PCR per ottenere un volume totale di 80 microlitri per pozzetto. </li><li> Aggiungere 5-20 ml di prodotto PCR biotinilato a ciascun pozzetto. </li><li> Sigillare i pozzetti con la striscia di caps e agitare la piastra PCR a 1.400 rpm per 5-10 minuti a temperatura ambiente (15-25 ° C) con un agitatore orbitale. </li></ol> Denaturazione del DNA e l&#39;aggiunta di sequenziamento Primer <ol><li> Diluire i primer di sequenziamento a 0.3 mM tampone con ricottura e dispensare 25 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra di reazione. Posizionare la piastra sulla workstation. </li><li> Riempire gli abbeveratoi workstation secondo il diagramma di Figura 5. </li><li> Accendere la pompa del vuoto, e assicurarsi che l&#39;interruttore sullo strumento vuoto è impostato su (Figura 6). Lavare le sonde filtro con acqua ad elevata purezza (Milli-Q 18,2 MW x cm o equivalente) in depressione 5 (Figura 5). Riempire la vasca con acqua ad alta purezza fresco da utilizzare nel passaggio 12. </li><li> Lavorare velocemente, posizionare la piastra di PCR con perline sulla workstation. Assicurarsi che entrambi i piatti sono lo stesso orientamento di quando sono stati caricati i campioni. </li><li> Con il vacuostato ON, abbassare il vuotoutensile nei pozzetti della piastra PCR per 20 secondi o finché tutto volume è stato aspirato. Le perle vengono catturati dallo strumento vuoto (Figura 7). </li><li> Con il vuoto ancora ON, lavare lo strumento con il 70% di etanolo (attraverso 1) per 20 secondi o fino a che tutto il volume è stato aspirato. </li><li> Con vuoto ON, lavare lo strumento con la soluzione di denaturazione (trogolo 2) per 20 secondi o fino a che tutto il volume è stato aspirato. </li></ol> Nota: La soluzione di denaturazione contiene idrossido di sodio, che è un occhio e irritante per la pelle. Indossare sempre un camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi. <ol start="8"><li> Con vuoto ON, lavare lo strumento con tampone di lavaggio (depressione 3) per 20 secondi o fino a che tutto il volume è stato aspirato. </li><li> Con vuoto ON, sollevare lo strumento vuoto per oltre 90 ° in verticale per 5 secondi, per consentire a tutti di liquido di defluire fuori dello strumento vuoto. Spegnere la pompa e allineare lo strumento di vuoto con la piastra di reazione. Abbassare l&#39;attrezzo di vuoto nelpozzi e scuotere delicatamente da un lato all&#39;altro per liberare le perline nei pozzetti contenenti Primer di sequenziamento. </li><li> Per pulire lo strumento vuoto, agitare le sonde filtro in acqua ad alta purezza (depressione 4) per 10 sec. </li><li> Spegnere il vuoto e lavare lo strumento con acqua ad alta purezza (depressione 5) per 20 secondi o fino a che tutto il volume è stato aspirato. </li><li> Sollevare lo strumento vuoto per oltre 90 ° C verticale per 5 secondi, quindi passare l&#39;aspirapolvere OFF e memorizzare nella posizione &quot;parcheggio&quot;. </li></ol> Ricottura Primer di sequenziamento di filamenti di DNA <ol><li> Posizionare la piastra di reazione in un supporto piatto preriscaldato. </li><li> Riscaldare la piastra su una piastra riscaldante a 80 ° C per 2 min. </li><li> Rimuovere la piastra dal supporto e posto sul bancone a raffreddare a temperatura ambiente per 5 min. </li></ol> Pyromark Q24 Funzionamento Nota: Accendere l&#39;apparecchio con l&#39;interruttore di alimentazione che si trova sopra il cavo di alimentazione. Stellatup può richiedere fino a 1 min. <ol><li> Riempire una cartuccia seguendo le istruzioni fornite nella PyroMark Oro Q24 Reagenti Manuale 2. Per determinare i volumi necessari, impostare un file di correre nel software dello strumento, e sotto il menu Strumenti selezionare Pre Informazioni Run </li><li> Se lo strumento è già acceso, assicurarsi che non sta eseguendo una corsa e quindi aprire il coperchio. Un segnale acustico viene emesso se il coperchio è aperto, quando non è sicuro di farlo. </li><li> Aprire la porta della cartuccia e inserire la cartuccia con l&#39;etichetta rivolta in avanti (Figura 8). Assicurarsi che la cartuccia sia inserita correttamente (una linea dovrebbe essere visibile nella parte anteriore) e chiudere il cancello. </li><li> Aprire il telaio piastra-holding e posizionare la piastra con i campioni all&#39;interno dello strumento. </li><li> Chiudere il telaio reggipiatti e il coperchio dello strumento (Figura 9). </li></ol> Avvio di una corsa <ol><li> Inserire la chiavetta USB con il file di esecuziones creato con il software dello strumento alla porta USB sulla parte anteriore dello strumento. </li><li> Selezionare &quot;Esegui&quot; nel menu principale e premere &quot;OK&quot;. </li><li> Utilizzare le frecce di scorrimento per selezionare il file di esecuzione desiderato e premere &quot;Seleziona&quot;. </li></ol> Nota: Lo strumento inizia la dispensazione reagenti durante tutta la pressione preimpostata e livelli di temperatura raggiunti (l&#39;operazione potrebbe richiedere alcuni minuti). Durante una corsa, lo schermo dello strumento visualizza la pyrogram del ben selezionati in tempo reale. Utilizzare le frecce di scorrimento per visualizzare l&#39;pyrogram di altri pozzi. Completamento di una corsa <ol><li> Quando lo strumento conferma che la corsa è finita e il file di esecuzione è stato salvato sulla chiavetta USB, premere &quot;Chiudi&quot;. </li><li> Rimuovere la chiavetta USB. Se è stata rimossa prima che finito la corsa, inserire la chiavetta USB. Selezionare &quot;Amministrazione&quot; e poi &quot;Copy viene eseguito non salvati&quot;. </li><li> Eseguire il file può essere aperto e analizzato con il software dello strumento e confrontatoa una libreria di microbi conosciuti utilizzando il software Identifire. </li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark PCR Handbook. , (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark Q24 User Manual. , (2012).</li><li>Elahi, E., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+a+tool+for+DNA+sequencing+analysis.">Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis.</a> Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).</li><li>Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+and+accurate+detection+platform+for+single+nucleotide+polymorphisms.">Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms.</a> Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).</li><li>Langaee, T., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+analyses+by+pyrosequencing.">Genetic variation analyses by pyrosequencing.</a> Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).</li><li>Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+pyrosequencing+reads+suffice+for+accurate+microbial+community+analysis.">Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis.</a> Nucleic Acids Res. 35 (18), e120 (2007).</li><li>Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+Pyrosequencing+for+microbiology:+From+genes+to+genomes.">The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes.</a> J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).</li><li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+microbial+diversity+from+454+pyrosequencing+data.">Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data.</a> Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).</li><li>Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+DNA+sequencing+using+detection+of+pyrophosphate+release.">Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.</a> Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).</li><li>King, C., Scott-Horton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+A+simple+method+for+accurate+genotyping.">Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping.</a> J. Vis. Exp. (11), e630 (2008).</li><li>Rothberg, J. W., Heinz, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-Mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., Fehr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li></ol>

Produzione e libero accesso a questo articolo è sponsorizzato da Qiagen. Autori Ahmed, Durocher, Jessen e Vardi sono dipendenti di Qiagen Inc. che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Sono stati commercializzati diversi nuovi metodi di sequenziamento di nuova generazione. Tre dei metodi più usati sono ioni semiconduttori sequenziamento, di singola molecola tempo reale sequenziamento, e sequenziamento per sintesi (SBS). 3-11 Ciascuno di questi metodi dipende sequenziamento per sintesi ma impiegano piattaforme innovative per la rilevazione dei nucleotidi incorporati. In ione semiconduttori sequenziamento, un singolo filamento di DNA serve come modello per il filamento sequenziamento. Polimerasi e 12 nucleotidi vengono aggiunti sequenzialmente come nella pyrosequencing. Quando viene aggiunto un nucleotide al filamento di DNA crescente, uno ione idrogeno viene rilasciato. Lo ione idrogeno viene rilevata da un sensore basato transistor ad effetto di campo. Molecola singola tempo reale sequenziamento dipende dalla modalità di guida d&#39;onda zero (ZMW). 13 La ZMW è una piccola struttura dove una singola molecola polimerasi è attaccata al fondo del pozzo. Viene illuminato in modo tale che un floreprofumo molecola può essere rilevato. Ogni nucleotide è etichettato con una molecola fluorescente. Come un nucleotide fluorescente con tag è incorporato, un rivelatore identifica il nucleotide. Quando è aggiunto il seguente nucleotide, la molecola fluorescente viene scissa. 14 Sequenziamento per sintesi (SBS) utilizza un metodo unico per amplificare il DNA bersaglio tale che i gruppi di sequenze uniche sono generati. 15 singoli modelli stranded sono generati e quindi il filamento complementare è sintetizzato. Ciascun nucleotide è etichettato con una molecola fluorescente e dopo ogni aggiunta di base la fluorescenza la base aggiunta è registrato.

Pyrosequencing è un metodo rapido e preciso per gli acidi nucleici di sequenza che si basa sul principio di &quot;sequenziamento per sintesi&quot;. &quot;Sequencing per sintesi&quot; comporta l&#39;uso di un singolo filamento stampo di DNA per sintetizzare il filamento complementare una base alla volta, e rilevando la base incorporata (A, T, G, o C) ad ogni passo per rilevamento di un segnale chemiluminescente. La reazione pirosequenziamento comprende DNA stampo, dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA polimerasi, ATP sulfurilasi, luciferina, luciferasi, e apyrase. La reazione di sintesi è iniziata con l&#39;aggiunta di uno dei quattro dNTP e DNA polimerasi al DNA stampo singolo filamento biotinilato. DNA polimerasi incorpora il dNTP complementare sulla dima, con il successivo rilascio di pirofosfato (Figura 1). ATP sulfurilasi converte proporzionalmente il pirofosfato di ATP. ATP agisce come un catalizzatore per la conversione luciferasi-mediata di luciferina ad oxyluciferin, chegenera luce (Figura 2). L&#39;intensità della luce è proporzionale al numero di nucleotidi incorporati e determina se è presente sul filamento stampo in sequenza (Figura 3) uno o più specifici di dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP o). Ogni dNTP non incorporata è degradata dalla apyrase prima dell&#39;aggiunta del successivo dNTP per la continuazione della reazione di sintesi. Questa &quot;sequenziamento mediante sintesi&quot; reazione viene ripetuto con aggiunta di ciascuno dei quattro dNTP finché la sequenza di DNA del template DNA a singolo filamento è determinata. Per visualizzare un&#39;animazione della reazione pyrosequencing <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405movie1.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere film</a> .

<table border=1>
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark PCR Master Mix, 2x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoralLoad Concentrate, 10x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Q-Solution, 5x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2, 25 mM</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase-Free Water</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>129112</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978776 or 978777</td>
 <td>Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 &mu;M.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyromark Gold Q24 Reagents</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>970802</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-purity water (Milli-Q 18.2 M&Omega; x cm or equivalent)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>17-5113-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Annealing Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Denaturation Solution</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Wash Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001514</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Cartridge</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979202</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q96 HS Tip Holder Box</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979105</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Vacuum Workstation</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Plate Holder</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9022273</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Orbital shaker</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-675-297</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heat block</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-718Q</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

pyrosequencing for microbial identification and characterization

Pyrosequencing è una tecnica versatile che facilita microbica sequenziamento del genoma che può essere utilizzato per identificare le specie batteriche, discriminare ceppi batterici e rilevare mutazioni genetiche che conferiscono resistenza agli agenti antimicrobici. I vantaggi di pyrosequencing per applicazioni di microbiologia includono rapido e affidabile high-throughput screening e l&#39;identificazione accurata di microbi e mutazioni del genoma microbici. Pyrosequencing comporta sequenziamento del DNA sintetizzando il filamento complementare un&#39;unica base alla volta, mentre la determinazione dell&#39;essere nucleotidica specifica incorporati durante la reazione di sintesi. La reazione avviene in immobilizzata singolo filamento DNA stampo dove vengono aggiunti sequenzialmente le quattro deoxyribonucleotides (dNTP) e le dNTP non incorporati sono degradati enzimaticamente prima dell&#39;aggiunta del successivo dNTP alla reazione di sintesi. Individuazione della base specifica incorporato nel modello viene monitorata da generazione di chemilumsegnali inescent. L&#39;ordine dei dNTP che producono i segnali chemiluminescenti determina la sequenza di DNA del modello. La capacità sequenziamento tempo reale di tecnologia pyrosequencing consente una rapida identificazione microbica in un singolo test. Inoltre, lo strumento pyrosequencing, in grado di analizzare la piena diversità genetica di anti-resistenza ai farmaci antimicrobici, compresi tipizzazione di SNPs, mutazioni puntiformi, inserzioni e delezioni, nonché la quantificazione delle copie multiple del gene che possono verificarsi in una certa resistenza antimicrobica modelli.

I risultati di una tipica corsa pyrosequencing utilizzando il software mostra la posizione dei primer forward e reverse utilizzati per la generazione amplicone, e il primer sequenziamento utilizzato per la reazione pyrosequencing all&#39;interno della sequenza conservata ribosomiale 16S (Figura 10). La sequenza ipervariabile tra il primer siti permette di identificazione batterica di un gran numero di specie batteriche utilizzando il primer di sequenziamento conservata (5&#39;-TACATGCAAGTCGA). Come controllo qualità interno, la sequenza di DNA della regione bracketing variabile può essere controllato per assicurare che la regione di DNA corretta è stata analizzata . Il software pirosequenziamento permette la comparazione e l&#39;allineamento della sequenza generata da un database interno di sequenze ribosomali batteriche di identificazione batterica. Inoltre, una sequenza può essere analizzato per determinare mutazioni che conferiscono resistenza agli antibiotici. Per esempio, l&#39;analisi di mutazioni nei geni 23S ribosomiale Helicobpylori tere dimostra due modelli di mutazione (GAA o AGA) che conferiscono resistenza agli antibiotici (Figura 11). Analisi di isolati multipli dello stesso paziente può essere contemporaneamente analizzati per monitorare la comparsa di resistenza ai farmaci nel tempo per aiutare nelle indagini epidemiologiche microbiche focolai di resistenza ai farmaci. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig1.jpg" /> Figura 1. Biotinilato prodotto della PCR è utilizzato come modello per incorporare dNTPs dalla DNA polimerasi, che porta alla generazione di pirofosfato (PPi). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig2.jpg" /> Figura 2. ATP sulfurilasi converte proporzionalmente pirofosfato di ATP. ATP agisce come un catalizzatore per la conversione luciferasi-mediata di luciferina ad oxyluciferin, che genera luce che è proproporzionale alla quantità di ATP. La luce viene registrato come picco sulla traccia pyrogram e indica l&#39;incorporazione di nucleotidi. I dNTPs non incorporati sono degradati da apyrase prima di aggiungere il successivo dNTP per la continuazione della sintesi. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig3.jpg" /> Figura 3. L&#39;intensità della luce generata indica se è stata costituita una o più specifiche di dNTP (dATP, dTTP, dGTP, o dCTP) sul filamento stampo in modo sequenziale. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig4.jpg" /> Figura 4. Diagramma di flusso per la preparazione della Master Mix per immobilizzare il prodotto di PCR biotinilato. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig5.jpg" /> ge = &quot;always&quot;&gt; Figura 5. PyroMark postazione di lavoro, con la piastra PCR, piastra PyroMark, e sedi di valle. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig6.jpg" /> Figura 6. Posizioni dell&#39;interruttore di vuoto posizioni ON e OFF. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig7.jpg" /> Figura 7. Strumento di vuoto. Corretta gestione dello strumento vuoto. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig8.jpg" /> Figura 8. Cancello cartuccia aperta con cartuccia in posizione. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig9.jpg" /> Figura 9. Cartuccia inserita correttamente con cancello chiuso. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig10.jpg" /> La figura 10. Pirosequenziamento risultati di identificazione batterica based. Primer PCR sono progettati per regioni conservate del DNA stampo, e il primer di sequenziamento è posizionato immediatamente a monte di una sequenza di DNA che identifica ipervariabile ben caratterizzato all&#39;interno amplicone (in blu). <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig11.jpg"/> Figura 11. Rilevamento di antibiotico resistenza in Helicobacter pylori mediante pyrosequencing. Analisi di mutazioni nei geni 23S che conferiscono resistenza antibatterica in Helicobacter pylori contenente GAA o sequenze di AGA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405fig11large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <table border="1"><tbody><tr> &lt;td&gt; Componente </td><td> Volume per reazione </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> Pyro PCR Master Mix, 2x </td><td> 12,5 ml </td><td> 1x </td></tr><tr><td> CoralLoad Concentrato, 10x </td><td> 2,5 microlitri </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 25 mM di MgCl2 (opzionale) </td><td> Variabile </td><td> ≥ 1.5 mM </td></tr><tr><td> Q-Solution, 5x (opzionale) </td><td> 5 microlitri </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Primer A / B Primer </td><td> Variabile / Variabile </td><td> 0.2 μM/0.2 mM </td></tr><tr><td> Acqua RNase-free </td><td> Variabile </td><td> - </td></tr><tr><td> Volume totale (dopo l&#39;aggiunta di DNA stampo) </td><td> 25 pl </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. PCR miscela di reazione. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td></td><td> Ulteriori commenti </td></tr><tr><td> Iniziale fase di attivazione PCR </td><td> 15 min </td><td> 95 ° C </td><td> HotStartTaq DNA polimerasi è attivato </td></tr><tr><td> 3 step ciclismo: denaturazione </td><td> 30 sec </td><td> 94 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Ricottura </td><td> 30 sec </td><td> 60 ° C 56 ° C </td><td> Per il DNA genomico Per bisolfito DNA convertito </td></tr><tr><td> Estensione </td><td> 30 sec </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Numero di cicli </td><td> 45 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Estensione finale </td><td> 10 min </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 2. PCR Specifiche ciclabili.

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Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing è una tecnica versatile che facilita microbica sequenziamento del genoma che può essere utilizzato per identificare le specie batteriche, discriminare ceppi batterici, e rilevare mutazioni genetiche che conferiscono resistenza agli agenti antimicrobici. In questo video, verrà dimostrata la procedura per la generazione microbica amplicone, amplicone pyrosequencing, e l&#39;analisi di sequenza del DNA.

Pyrosequencing per identificazione microbica e caratterizzazione

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

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46.9K Views.  Johns Hopkins University. Pyrosequencing è una tecnica versatile che facilita microbica sequenziamento del genoma che può essere utilizzato per identificare le specie batteriche, discriminare ceppi batterici, e rilevare mutazioni genetiche che conferiscono resistenza agli agenti antimicrobici. In questo video, verrà dimostrata la procedura per la generazione microbica amplicone, amplicone pyrosequencing, e l'analisi di sequenza del DNA.

Video: Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Comunità microbica in natura e laboratorio - Intervista

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Biology of Microbial Communities  - Interview

Biologia delle comunità microbiche - Intervista

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pirosequenziamento: un metodo semplice per genotipizzazione accurata

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identificazione e caratterizzazione di glicosilazione delle proteine ​​con specifiche endo-e exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

L&#39;uso di chemostati in Biologia microbica Sistemi

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

L&#39;isolamento di regioni genomiche specifici e l&#39;identificazione di molecole da Associated enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in understanding the gene regulation and spatiotemporal expression patterns of target genes. On the other hand, it is also critical to establish promoter evaluation tools and genetic transformation techniques that are fast, efficient, and reproducible. In this study, we investigated the spatiotemporal expression pattern of the rhizobial symbiosis-specific nodule inception (NIN) promoter of Phaseolus vulgaris in the transgenic hairy roots. Using plant genome databases and analysis tools we identified, isolated, and cloned the P. vulgaris NIN promoter in a transcriptional fusion to the chimeric reporter &#946;-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Further, this protocol describes a rapid and versatile system of genetic transformation in the P. vulgaris using Agrobacterium rhizogenes induced hairy roots. This system generates &#8805;2 cm hairy roots at 10 to 12 days after transformation. Next, we assessed the spatiotemporal expression of NIN promoter in Rhizobium inoculated hairy roots at periodic intervals of post-inoculation. Our results depicted by GUS activity show that the NIN promoter was active during the process of nodulation. Together, the present protocol demonstrates how to identify, isolate, clone, and characterize a plant promoter in the common bean hairy roots. Moreover, this protocol is easy to use in non-specialized laboratories.

Promoter expression analyses are crucial to improving the understanding of gene regulation and the spatiotemporal expression of target genes. Herein we present a protocol to identify, isolate, and clone a plant promoter. Further, we describe the characterization of the nodule-specific promoter in the common bean hairy roots.

Analisi del promotore di pianta: Identificazione e caratterizzazione di radice nodulo specifico promotore nel fagiolo comune

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

Identificazione, isolamento e caratterizzazione di progenitori fibro-adipogeni (FAPs) e progenitori miogeni (MP) nel muscolo scheletrico nel ratto

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as regulators of various biological processes. Notably, emerging evidence demonstrates that host circRNAs can be differentially expressed (DE) upon infection with&#160;pathogens (e.g., influenza and coronaviruses), suggesting a role for circRNAs in regulating host innate immune responses. However, investigations on the role of circRNAs during pathogenic infections are limited by the knowledge and skills required to carry out the necessary bioinformatic analysis to identify DE circRNAs from RNA sequencing (RNA-seq) data. Bioinformatics prediction and identification of circRNAs is crucial before any verification, and functional studies using costly and time-consuming wet-lab techniques. To solve this issue, a step-by-step protocol of in silico prediction and characterization of circRNAs using RNA-seq data is provided in this manuscript. The protocol can be divided into four steps: 1) Prediction and quantification of DE circRNAs via the CIRIquant pipeline; 2) Annotation via circBase and characterization of DE circRNAs; 3) CircRNA-miRNA interaction prediction through Circr pipeline; 4) functional enrichment analysis of circRNA parental genes using Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). This pipeline will be useful in driving future in vitro and in vivo research to further unravel the role of circRNAs in host-pathogen interactions.

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

The protocol submitted here explains the complete in silico pipeline needed to predict and functionally characterize circRNAs from RNA-sequencing transcriptome data studying host-pathogen interactions.

In zona Silico Identificazione e caratterizzazione di circRNA durante le interazioni ospite-patogeno

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as ...