La microscopia a fogli di luce reticolare è una potente tecnologia di imaging, ma pochi laboratori al mondo sono in grado di usarla. Questo protocollo fornisce una panoramica dettagliata di come utilizzare il microscopio a fogli di luce reticolare disponibile in commercio. È un sistema estremamente potente in grado di imaging quadridimensionale di singole cellule o embrioni che consente il tracciamento in tempo reale delle molecole.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che può immagini tridimensionale singole cellule o organi vivi con alta risoluzione spaziotemporale e sbiancamento fotografico minimo. Il modello reticolare della lastra luminosa ci consente di campioni di immagini ad alta velocità e ottenere video in tempo reale di cellule e organi viventi tridimensionali con dettagli molecolari che altre tecniche non possono ottenere. Questo primo protocollo video che mostra come per noi microscopia a foglio luminoso reticolare per l'immagine di una singola cella quadridimensionale.
Questa è una tecnica molto complicata a causa dell'allineamento e della preparazione del campione. E crediamo che la dimostrazione visiva migliorerà l'accessibilità permettendo a più scienziati di immaginiamo molte molecole, cellule e organi diversi in biologia. Per iniziare questa procedura, incubare cinque coverlips rotonde millimetri con 0,1% poli-L-lisina a temperatura ambiente per 10 minuti.
Aspirare il liquido e lasciare asciugare naturalmente l'aria dei copripavimenti. Aggiungere quindi tre millilitri di gradiente di densità a un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere con cura le cellule per quanto riguarda la caduta sul bordo del tubo.
Centrifuga a 930 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, rimuovere con cura il sottile strato intermedio di celle tra il supporto completo e il reagente gradiente di densità assicurandosi di mettere ogni tipo di cella in un tubo conico separato. Centrifugare a 300 volte g per cinque minuti per lavare le cellule.
Scartare il supernatante e aggiungere cinque millilitri di RPMI ai tubi delle cellule T e CH27. Ripetere il lavaggio con RPMI fresco fino a quando non sono stati eseguiti tre lavaggi totali. Quindi, rimescolare le cellule in ogni tubo con un millilitro di RPMI completo e contare le cellule con un emocitometro.
Resuspend un milione di cellule che presentano antigeni in 500 microlitri di RPMI completo e aggiungere 10 MCC micromolare. Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per tre ore. Successivamente, rimospendì un milione di cellule T in 500 microlitri di RPMI completo.
Aggiungere due microgrammi di anti-TCR beta Alexa 488 etichettato FAB e incubare a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Quindi, centrifuga entrambe le cellule a 300 volte g per cinque minuti e scarta il supernatante. Aggiungere 500 microlitri di RPMI completo e ripetere la centrifuga per lavare le cellule.
Ripetere il lavaggio con RPMI fresco fino a quando non sono stati eseguiti tre lavaggi totali scartando il supernatante dopo ogni lavaggio. Successivamente, resuspend entrambi i tipi di cellule in 500 microlitri di supporti di imaging. In primo luogo, aggiungere 10 millilitri di acqua e 30 microlitri di fluoresceina al bagno LLSM.
Premete Home immagine per spostare l'oggetto nella posizione dell'immagine e guardate un singolo motivo a fascio laser di Bessel. Allineare il raggio laser utilizzando la guida e la regione di interesse preimpostata per rendere il fascio un modello sottile bilanciato in tutte le direzioni. Il fascio dovrebbe anche apparire focalizzato nella fotocamera del finder.
Utilizzare i due regolatori di inclinazione dello specchio, il micrometro di messa a fuoco superiore e il colore obiettivo per regolare il fascio. Successivamente, lavare il bagno e gli obiettivi con almeno 200 millilitri di acqua per rimuovere completamente qualsiasi fluoresceina. Per visualizzare le perline fluorescenti standard, attivare il dithering impostando su tre nella casella intervallo Xgalvo e premere Live per visualizzare il campo corrente.
Regola manualmente lo specchio di inclinazione, il colore obiettivo e il micrometro di messa a fuoco per i valori grigi più alti. Quindi, regola se necessario per ottenere modelli adeguati per le modalità di acquisizione della scansione obiettiva, Z galvo, Z plus e sample scan. Successivamente, premere Esegui in modalità di scansione di esempio per raccogliere la funzione di diffusione del punto di esempio per la de-skewing e la de-convoluzione.
Modificare i laser in tre modalità colore e premere di nuovo Esegui. Per iniziare, aggiungere 100.000 cellule anti-presentazione al coverslip circolare preparato di cinque millimetri di diametro e consentire loro di depositarsi per 10 minuti. Ungere il portacampioni e aggiungere il coverslip al lato della cella verso l'alto.
Aggiungere quindi una goccia di supporti di imaging sul retro del coverslip. Avvitare il portacampioni sul Piezo e premere Image Home. Trova una cella di presentazione dell'antigene su immagine e assicurati che l'LLSM e il software di imaging funzionino correttamente.
Premere Live per visualizzare l'immagine corrente. Spostarsi lungo Z per trovare il coverslip e le celle. Trovare il centro di una cella che presenta l'antigene muovendosi nella direzione Z, quindi premere Interrompi per mettere in pausa il laser.
Controllare il 3D e inserire le impostazioni desiderate. Premere Centro e quindi Esegui per raccogliere i dati. Abbassare lo stadio alla posizione di carico e aggiungere 50 microlitri di celle A e mezzi di imaging per quanto riguarda la goccia direttamente sopra il coverslip.
È meglio lasciare una forma di goccia all'estremità della punta della pipetta e quindi toccare la punta al liquido del bagno. Sollevare nuovamente il palco facendo clic su Ritorno immagine. Inizia l'imaging.
Assicurarsi di impostare la pila Z desiderata e la lunghezza timelapse. Ad esempio, l'immagine 60 Z si impila con una dimensione del passo di 0,4 micrometri e immette 500 tempi. Interrompere la registrazione prima di raggiungere 500 fotogrammi per evitare lo sbiancamento delle foto.
Utilizzare la modalità live per cercare coppie di celle e quando sono state immesse le impostazioni pronte e desiderate, premere Esegui per raccogliere dati. In questo studio, le cellule T 5CC7 del topo primario vengono isolate e preparate e vengono quindi immagini utilizzando un microscopio a foglio luminoso reticolare. Qui sono mostrati il corretto percorso del fascio e l'allineamento del fascio quando viene immaginato con fluoresceina.
La scansione oggettiva dovrebbe mostrare una grande forma a X nelle proiezioni XZ e YZ che sia il più simmetrica possibile. Dovrebbero anche essere regolati per essere il più piccoli possibile di una X. La scansione galvo Z dovrebbe mostrare un ovale in XZ e XY con un singolo punto su entrambi i lati.
Infine, sia la scansione obiettivo Z plus che la scansione del campione dovrebbero mostrare punti che sembrano il più rotondi possibile. Usando questo protocollo, si potevano vedere le dinamiche quadridimensionali dei recettori delle cellule T su una superficie di cellule T. Il vantaggio principale di questo microscopio risiede nella capacità di tracciare le unità superficiali visualizzazionete dei recettori delle cellule T e di ottenere dati quantificati dalle loro dimensioni, movimento, intensità del segnale ed escrementi.
La cosa più importante da ricordare è la qualità del tuo allineamento. La scheda luminosa del reticolo deve essere allineata quotidianamente e non farlo correttamente si tradurrà in un'immagine distorta. Allo stesso modo, la qualità delle FPF raccolte influisce direttamente sulla qualità della devoluzione che alla fine si traduce nella qualità dell'immagine finale.
Uno dei motivi per cui questo metodo è così potente è perché ogni cellula ed etichetta può essere sostituita per visualizzare molti tipi di cellule e molecole. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per rispondere a qualsiasi domanda relativa al tracciamento quadridimensionale delle molecole. Pensiamo che questa tecnica spianerà la strada ai ricercatori per esplorare nuove questioni nel campo del traffico molecolare.
Non è ancora ampiamente utilizzato a causa del complicato sistema, quindi speriamo che questo video jove migliori l'accessibilità alla tecnica. I laser utilizzati sul sistema sono di classe quattro, quindi è necessario prestare assoluta cautela per garantire la sicurezza laser. Si prega di eseguire l'allenamento di sicurezza laser necessario prima di utilizzare questo metodo.
