Il nostro protocollo utilizza l'analisi del controllo delle singole particelle per monitorare la dinamica della posizione e l'orientamento e caratterizza la diffusione delle nanorodi dorate sulle membrane cellulari. Utilizzando questo metodo, è possibile ottenere sia la dinamica traslazionale che la dinamica rotazionale delle nanorodi dorate e la dinamica può essere analizzata in modo completo e presentata. Questo protocollo ha il potenziale per essere utilizzato per lo studio di altri tipi di sistemi biologici complessi.
Inizia bruciando un coverslip di vetro immerso in etanolo sulla fiamma e posizionando il coverslip in un piatto di coltura cellulare da 35 per 10 millimetri contenente due millilitri di mezzo di coltura cellulare senza rosso fenolo. Aggiungere 50 microlitri della sospensione cellulare di interesse sul coverslip e scuotere delicatamente il piatto avanti e indietro e a sinistra e a destra per distribuire uniformemente le cellule. Posizionare il piatto nell'incubatore di coltura cellulare per circa 12 ore fino a quando le cellule raggiungono il 20-40% di confluenza prima di aggiungere 20 microlitri di nanorodi d'oro rivestiti di CTAB al piatto.
Dopo un delicato scuotimento per disperdere uniformemente le nanorodi attraverso il piatto, posizionare il piatto in un'atmosfera umidificata per cinque minuti. Alla fine dell'incubazione, trasferire lentamente 100 microlitri di supernatante dal piatto nella scanalatura di uno scivolo di vetro e posizionare con cura il lato della cella del coverslip verso il basso sulla scanalatura dello scivolo, quindi sigillare il bordo del coverslip con smalto per unghie e lasciare asciugare lo smalto prima di posizionare lo scivolo sullo stadio del microscopio darkfield. Per il tracciamento di singole particelle mediante microscopia a campo scuro, posizionare una goccia di olio sul condensatore a campo scuro dell'olio e ruotare la manopola fino a quando il condensatore non contatta lo scivolo di vetro.
Posizionare una goccia di olio sulla parte superiore del vetro di copertura e ruotare la manopola di messa a fuoco fino a quando l'obiettivo di immersione dell'olio 60X tocca l'olio. Accendere la sorgente luminosa e ruotare leggermente la manopola di messa a fuoco per mettere a fuoco il piano di imaging. Quindi fare clic sull'icona della fotocamera nel software del microscopio per registrare una serie di tempo dell'immagine luminosa di dispersione di esempio utilizzando la fotocamera CMOS a colori e salvare l'immagine in formato TIFF.
Per estrarre una singola traiettoria a lungo termine, aprite l'immagine in ImageJ e fate clic su immagine, digitate e a 8 bit per convertire l'immagine dalla modalità RGB alla modalità a 8 bit. Per regolare il contrasto, fare clic sull'immagine, regolare, confrontare la luminosità e impostare i parametri. Selezionate una particella di destinazione e usate Ctrl X per tagliare lo sfondo della serie temporali.
Fare clic su plugin, tracker particelle classico e tracker particelle per aprire la finestra di rilevamento delle particelle e di collegamento delle particelle e impostare il raggio su sei, il cutoff su zero e il percentile su 0,01%Impostare l'intervallo di collegamento su 10 e lo spostamento su 10 e fare clic su OK per aprire la finestra dei risultati del tracker particelle per visualizzare i risultati. Fate clic su visualizza tutte le traiettorie per ispezionare le traiettorie generate. Se la traiettoria generata dal software e la traiettoria mobile delle nanorodi d'oro sono abbinate, fare clic su Salva report completo per salvare i risultati.
Se la traiettoria generata dal software non corrisponde alla traiettoria in movimento delle nanorodi d'oro, fare clic su ricollegare le particelle per ricollegare le particelle rilevate con diversi parametri di intervallo di collegamento e percentile. Per trovare la coordinata pixel centrale della nanorod d'oro in ogni fotogramma in base alla coordinata XY, usate la coordinata xy. m.
Per delimitare una matrice di tre per tre pixel, estrarre i nove valori di intensità di dispersione dei canali rosso o verde e calcolare un valore medio, utilizzare la rgextraction. m. Quindi usa il polarangle.
m per calcolare gli angoli polari utilizzando il metodo differenziale a doppio canale. Per calcolare i parametri dinamici utilizzando le formule della tabella, eseguire i due script di analisi. Per l'analisi visiva della traiettoria, impostate la coordinata X come X, la coordinata Y come Y e il tempo come Y, quindi fate clic su traccia, dispersione e mappa dei colori, impostate i parametri del grafico e aggiungete la barra dei colori.
Per generare cifre media dell'intervallo di tempo di spostamento quadrato, impostate l'intervallo di tempo come X e lo spostamento quadrato medio come Y.Fate clic su plottaggio, dispersione, analisi, raccordo, raccordo curva non lineare e dialogo aperto e impostate i parametri del grafico. Per l'analisi statistica multi-particella, impostate i parametri dinamici di interesse come Y e click plot e istogram. Fare doppio clic sull'istogramma per impostare la dimensione della divisione o il numero di divisioni e fare clic su Applica.
Quindi aggiungere una colonna e impostare i parametri del grafico. Per un'analisi delle serie temporali, impostate l'ora come X e i parametri delle serie temporali come Y.Click plot, multi-pane e stack. Nella finestra popup selezionare riga e OK. Quindi impostare i parametri per il grafico.
Il massimo plasmonico longitudinale di 40 per 85 nanometri nanodi d'oro rivestiti di CTAB è di circa 650 nanometri e la risonanza trasversale è di 520 nanometri. L'intensità di dispersione delle nanorodi d'oro rivestite in CTAB sulle membrane cellulari U87 dimostra una tipica distribuzione gaussiana con una larghezza stretta coerente con quella delle nanorodi d'oro rivestite in CTAB sul vetro che indicano che le nanorodi d'oro rivestite in CTAB tracciate in questo esperimento sono ben monodisperse. Come illustrato, più di 500 traiettorie di nanorod d'oro rivestite di CTAB possono essere tracciate mediante microscopia a campo scuro e possono essere divise in traiettorie di diffusione a lungo raggio e traiettorie di diffusione confinate.
Il raggio di rotazione di tutte le 500 traiettorie in questa analisi rappresentativa ha mostrato una piccola distribuzione di valore con un raggio medio di rotazione di 0,5 micrometri e lo spostamento massimo è stato più distribuito a piccoli valori. Come dimostrato in questa analisi di spostamento quadratica media media del tempo dell'insieme, le nanorodi d'oro rivestite in CTAB normalmente si diffondono con un alfa di circa uno. La distribuzione della densità del coefficiente di diffusione e dell'alfa ottenuta da tutte le traiettorie, tuttavia, rivela che la dinamica delle nanorodi d'oro mostra una distribuzione eterogenea con movimenti di superdiffusione, browniana e subdiffusione.
Inoltre, l'analisi statistica delle singole particelle e l'analisi dei parametri delle serie temporali possono essere utilizzate per caratterizzare due traiettorie rappresentative confinate e in movimento a lungo termine. È necessario riassumere ed estrarre una singola nuova interpretazione dei dati dalla lettura dell'analisi di tracciamento delle singole particelle in quanto ci sono tipicamente alcuni compromessi difficili da fare.
