Questo protocollo utilizza tutte le principali caratteristiche dell'AFM, non adatta ad altre tecniche a singola molecola. Di conseguenza, siamo in grado di risolvere la struttura del nucleosoma su scala nanometrica. È importante sottolineare che la visualizzazione diretta dei nucleosomi è stata effettuata in condizioni fisiologiche.
Utilizzando la nostra tecnica AFM, abbiamo recentemente rivelato proprietà uniche del nucleosoma centromero che possono svolgere un ruolo sulla funzione dell'intero centromero. Il metodo da dimostrare è attualmente applicato nel nostro laboratorio per indagare l'auto-assemblaggio di proteine associate alla formazione di aggregati amiloidi. Questi aggregati proteici innescano lo sviluppo di malattie devastanti come l'Alzheimer e il Parkinson per citane alcuni.
I semplici metodi di preparazione sono applicabili anche ad altri complessi proteina-DNA, inclusi grandi sistemi come i macchinari di replicazione del DNA. Anche se sono necessarie alcune modifiche. Al fine di caratterizzare le particelle nucleosoma a livello di singola molecola usando la microscopia a forza atomica statica e time-lapse, inizia purificando, assemblando e convalidando i nucleosomi come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento.
Preparare quindi la superficie della mica per l'imaging AFM statico. Per fare questo, prima prepara una soluzione di stock APS da cinquanta millimolari in acqua deionizzata. Conservare un aliquote millilitro di questa soluzione a quattro gradi Celsius, fino a quando non è necessario.
Dalla soluzione stock, preparare una soluzione APS funzionante per la modifica della mica sciogliendo 50 microlitri dello stock APS da 50 micromolare in 15 millilitri di acqua deionizzata distillata. Mescolare la soluzione e quindi riempire una cuvetta con la soluzione. Quindi, tagliare strisce di mica di uno per tre centimetri da fogli di mica di alta qualità.
Controllare che il pezzo si adatti quando posizionato diagonalmente in una cuvetta. Quindi, scindere gli strati della mica fino a quando entrambi i lati non vengono appena scisi e il pezzo è sottile fino a 0,1 millimetri. Posizionare immediatamente il pezzo di mica nella cuvetta riempita APS e incubare la mica per 30 minuti.
Trasferire il pezzo di mica in una cuvetta piena di acqua deionizzata distillata e immergerla per 30 secondi. Quindi, utilizzare l'argon per asciugare completamente entrambi i lati della striscia di mica APS. Applicare il nastro adesivo a doppia faccia su diversi dischi magnetici e posizionarli lateralmente.
Quindi, tagliare il substrato di mica APS a un centimetro per un centimetro quadrati e coprirli in una piastra di Petri pulita. Successivamente, preparare tre diluizioni dei nucleosomi assemblati utilizzando un tampone filtrato da 0,22 micron contenente 10 epes millimolare e quattro cloruri di magnesio millimolare con un PH di 7,5. Per limitare la perdita di nucleosomi, alla bassa concentrazione finale, la diluizione deve essere effettuata una alla volta, immediatamente prima della deposizione sulla mica APS.
Depositare da cinque a 10 microlitri di ogni campione nucleosoma al centro di un pezzo di mica APS e lasciarli incubare per due minuti. Quindi, sciacquare delicatamente il campione con due o tre millilitri di acqua deionizzata distillata per rimuovere i componenti tampone. E asciugare il campione depositato sotto un leggero flusso di argon.
Per iniziare, montare una punta sul supporto della punta della configurazione AFM. Quindi, montare il primo campione sullo stadio AFM, facendo attenzione a non contattare la superficie del campione. Posizionare il laser sopra il sbalzino fino a quando la sua somma è al massimo e regolare i valori di deflessione verticale e laterale vicino allo zero.
Quindi, sintonizzate la sonda AFM per trovare la sua frequenza risonante, regolate l'ampiezza dell'unità e impostate le dimensioni dell'immagine su 100 per 100 nanometri. Una volta impostato, fare clic sul pulsante di innestare per iniziare l'approccio. Una volta completato l'approccio, ottimizzare gradualmente il set point di ampiezza fino a quando la superficie del campione non viene vista chiaramente.
Quindi, aumentare le dimensioni della scansione a un micron di un micron e la risoluzione a 512 per 512 pixel. Infine, fai clic sul pulsante di acquisizione per iniziare l'acquisizione dell'immagine. Utilizzare la colla scanner dell'asta di vetro per attaccare un'asta di vetro allo stadio dello scanner AFM.
Lasciare asciugare questo per un minimo di 10 minuti. Nel frattempo, crea pezzi circolari di mica spessi 0,1 millimetri con un diametro di 1,5 millimetri punzonandoli da un foglio di mica più grande. Utilizzare la colla per aste di vetro mica AFM ad alta velocità per attaccare questo pezzo di mica all'asta di vetro sull'AFM ad alta velocità e lasciare intatto per un minimo di 10 minuti mentre si asciuga.
Quindi, scindere gli strati dalla mica utilizzando un nastro sensibile alla pressione fino a quando non viene visto uno strato ben scigliato sul nastro. Successivamente, diluire un microlitro di 50 millimolare stock di APS in 99 microlitri di acqua deionizzata distillata per fare una soluzione APS da 500 micromolare. Depositare 2,5 microlitri della soluzione sulla superficie della mica appena sciccata e lasciare che la superficiefunizzi per 30 minuti.
Dopo l'incubazione, sciacquare la mica più volte con acqua deionizzata distillata applicando tre risciacqui di microlitri. Rimuovere completamente l'acqua dopo ogni risciacquo posizionando una salvietta non tessuta sul bordo della mica. Dopo il risciacquo finale, posizionare tre microlitri di acqua deionizzata distillata sulla superficie e lasciarlo riposare per un minimo di cinque minuti per rimuovere eventuali APS non specificamente legati.
Quindi, posizionare la sonda nel supporto AFM ad alta velocità e posizionare il supporto sullo stadio AFM con la punta rivolta verso l'alto. Risciacquare il supporto utilizzando 100 microlitri di acqua deionizzata distillata, seguita da due risciacqui da 100 microlitri di tampone di imaging nucleosomio filtrato da 0,22 micron. Con i risciacqui fatti, riempire la camera con 100 microlitri di tampone di imaging nucleosoma, immergendo la punta.
Regolare la posizione a sbalzi fino a quando non viene colpita con il laser. Quindi, sciacquare la mica APS cinque volte con tampone di imaging nucleosoma filtrato, utilizzando quattro microlitri per risciacquo. Diluire un microlitro del materiale di assemblaggio nucleosoma in 250 microlitri di tampone di imaging nucleosoma filtrato per una concentrazione nucleosoma finale di un nanomolare.
Depositare 2,5 microlitri di questa diluizione sulla superficie e lasciarla riposare per due minuti. Risciacquare la superficie due volte con quattro microlitri di tampone di imaging nucleosoma per evitare l'affollamento. Dopo il risciacquo finale, lasciare la superficie coperta da tampone di imaging.
Impostare lo scanner e il campione sopra il supporto della punta in modo che il campione sia a faccia in giù. Per iniziare l'avvicinamento, utilizzare la funzione di avvicinamento automatico con l'ampiezza del set point vicino all'ampiezza di oscillazione libera. Regolate il set point fino a quando la superficie non viene ben tracciata.
Quindi, impostare l'area dell'immagine intorno a 150 per 150 nanometri a 200 per 200 nanometri con una velocità di acquisizione dei dati di circa 300 millisecondi per fotogramma di imaging. Come controllo per l'assemblaggio e la deposizione, i mononucleosomi H3 sono stati preparati e immagini utilizzando AFM statico. Questa immagine fornisce un'istantanea della popolazione nucleosoma come esisteva pochi istanti prima della deposizione confermando che i nucelosomi sono stati assemblati con successo.
Con il successo dell'assemblaggio del controllo H3, i metodi presentati furono successivamente applicati allo studio dei nucleosomi CENP-A. L'imaging AFM statico di questo campione ha rivelato che il suo assemblaggio è stato un successo. Dalle immagini AFM statiche, il numero di altezza e di svolta dei mononucleosomi potrebbe essere caratterizzato.
Sia l'angolo tra i bracci di DNA liberi che la lunghezza dei bracci di DNA libero sono usati per determinare il numero di giri di DNA nel singolo nucleosoma. Al contrario, l'imaging AFM time lapse dei nucleosomi può essere usato per visualizzare il comportamento di scartamento spontaneo complessivo dei nucleosomi. Man mano che il numero di giri del nucleosoma diminuisce, si osserva anche una corrispondente diminuzione del volume nucleosoma del nucleo.
Oltre alla normale immagine time lapse, AFM può essere utilizzato per sondare la dinamica nucleosoma più intricata che viene persa utilizzando l'imaging a time lapse standard. La capacità di questa tecnica di catturare la dinamica per un lungo periodo di tempo era essenziale per la visualizzazione di una traslocazione a lunga distanza di un nucleo nucleosoma CENP-A, che è stato catturato nel corso di 1200 fotogrammi. Questa tecnica è stata anche fondamentale per catturare il raro trasferimento di un nucleo nucleosoma CENP-A da un substrato di DNA all'altro.
La velocità di acquisizione rapida dell'immagine ha reso possibile la visualizzazione di questo evento dinamico in quanto sono stati completati solo diversi fotogrammi. Nel campo della cromatina ampia ci sono una serie di importanti questioni relative ai ruoli degli istoni liger e all'ingrandimento istono della dinamica della cromatina. Tutte queste domande possono essere risolte usando la nostra tecnica.
